Name: Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę badania poliploidyzacji indukowanej raną w modelu Drosophila melanogaster. Protokół umożliwia ocenę wielkości komórek nabłonkowych, ploidalności i organizacji tkanek w ciągu dwóch dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

W Boston College chcielibyśmy podziękować Dr. Ericowi Folkerowi za korzystanie z kamery i mikroskopu stereoskopowego w jego laboratorium do obrazowania oraz Bretowi Judsonowi z Boston College Imaging Core za infrastrukturę i wsparcie. Chcielibyśmy również podziękować zasobom społeczności muchowej: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center i TRiP Center at Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) za dostarczenie transgenicznych zapasów wykorzystanych w tym badaniu. Mysie przeciwciało FasIII uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank wspieranego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer R35GM124691. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Liu, R., Watts, J. J., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryos+close+epithelial+wounds+using+a+combination+of+cellular+protrusions+and+an+actomyosin+purse+string%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryos close epithelial wounds using a combination of cellular protrusions and an actomyosin purse string.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 24), 5984-5997 (2012).</li>
<li>Wood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+recapitulates+morphogenesis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos.</a> Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).</li>
<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biology. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+and+cell+fusion+contribute+to+wound+healing+in+the+adult+Drosophila+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium.</a> Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+Adhesions+Suppress+Syncytium+Formation+in+the+Drosophila+Larval+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin Adhesions Suppress Syncytium Formation in the Drosophila Larval Epidermis.</a> Current Biology. 25 (17), 2215-2227 (2015).</li>
<li>Ramos-Lewis, W., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scar-like+lesion+is+apparent+in+basement+membrane+after+wound+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">A scar-like lesion is apparent in basement membrane after wound repair in vivo.</a> Matrix Biology. 74, 101-120 (2018).</li>
<li>Lee, C. W., Kwon, Y. C., Lee, Y., Park, M. Y., Choe, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cdc37+is+essential+for+JNK+pathway+activation+and+wound+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">cdc37 is essential for JNK pathway activation and wound closure in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (21), 2651-2658 (2019).</li>
<li>Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-Induced+Polyploidization%3A+Regulation+by+Hippo+and+JNK+Signaling+and+Conservation+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals.</a> PLoS One. 11 (3), e0151251(2016).</li>
<li>Tamori, Y., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+through+cell+competition+and+compensatory+cellular+hypertrophy+in+postmitotic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia.</a> Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).</li>
<li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-dependent+TOR-independent+endocycles+support+Drosophila+gut+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EGFR-dependent TOR-independent endocycles support Drosophila gut epithelial regeneration.</a> Nature Communications. 8, 15125(2017).</li>
<li>Cohen, E., Allen, S. R., Sawyer, J. K., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fizzy-Related+dictates+A+cell+cycle+switch+during+organ+repair+and+tissue+growth+responses+in+the+Drosophila+hindgut%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fizzy-Related dictates A cell cycle switch during organ repair and tissue growth responses in the Drosophila hindgut.</a> Elife. 7, e38327(2018).</li>
<li>Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+Polyploid+Mystery+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Solving the Polyploid Mystery in Health and Disease.</a> Trends in genetics: TIG. 35 (1), 6-14 (2019).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+Creates+an+Endoreplication+Wavefront+that+Leads+Regeneration+of+Epicardial+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tension Creates an Endoreplication Wavefront that Leads Regeneration of Epicardial Tissue.</a> Developmental Cell. 42 (6), 600-615 (2017).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li>
<li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344(2018).</li>
<li>Grendler, J., Lowgren, S., Mills, M., Losick, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+polyploidization+is+driven+by+Myc+and+supports+tissue+repair+in+the+presence+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wound-induced polyploidization is driven by Myc and supports tissue repair in the presence of DNA damage.</a> Development. 146 (15), 173005(2019).</li>
<li>Mehrotra, S., Maqbool, S. B., Kolpakas, A., Murnen, K., Calvi, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycling+cells+do+not+apoptose+in+response+to+DNA+rereplication+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress.</a> Genes & Development. 22 (22), 3158-3171 (2008).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+mononuclear+diploid+cardiomyocytes+underlies+natural+variation+in+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration.</a> Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).</li>
<li>Gonzalez-Rosa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Polyploidization+Creates+a+Barrier+to+Heart+Regeneration+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Myocardial Polyploidization Creates a Barrier to Heart Regeneration in Zebrafish.</a> Developmental Cell. 44 (4), 433-446 (2018).</li>
<li>Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+nucleus%3A+nuclear+shape%2C+size+and+nuclear-envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).</li>
<li>Knouse, K. A., Lopez, K. E., Bachofner, M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Segregation+Fidelity+in+Epithelia+Requires+Tissue+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Segregation Fidelity in Epithelia Requires Tissue Architecture.</a> Cell. 175 (1), 200-211 (2018).</li>
<li>Box, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycles+support+tissue+growth+and+regeneration+of+the+adult+Drosophila+accessory+gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Endocycles support tissue growth and regeneration of the adult Drosophila accessory gland.</a> bioRxiv. , 719013(2019).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3111(2011).</li>
<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Border+Cell+Migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Border Cell Migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
</ol>

Przedstawiono szczegółowy protokół dotyczący preparowania i wykorzystania nabłonka brzusznego dorosłego D. melanogaster do zbadania, w jaki sposób geny regulują WIP poprzez zmianę reepitelializacji i endoreplikacji podczas gojenia się ran16. Korzystając z tej metody, protoonkogen Myc został niedawno zidentyfikowany jako kluczowy regulator WIP. Myc jest wymagany, aby komórki nabłonkowe mogły się replikować po urazie i jest wystarczający do endocyklu komórek nabłonka w stanie spoczynku zarówno w nabłonku dorosłej muchy, jak i gruczołach dodatkowych16,22. Stwierdzono również, że przełączanie komórek nabłonka na mitotyczny cykl komórkowy przez ekspresję stg, fzrRNAi jest szkodliwe dla gojenia się ran. Kontynuowane badania z wykorzystaniem tej metody zidentyfikują inne geny wymagane do regulacji reepitelializacji i endoreplikacji podczas WIP, ujawniając zarówno podobieństwa, jak i różnice w sposobie regulacji i funkcjonowania poliploidii w różnych tkankach.
Ten model i metoda oferują wyjątkowe zalety, w tym łatwą indukcję poliploidalności za pomocą mechanicznego nakłucia oraz fakt, że komórki poliploidalne są generowane w ciągu kilku dni4. Protokoły preparacji i przygotowania tkanek opierają się na technikach preparacji larw23, ale odwłok dorosłej muchy jest sztywniejszy i dlatego łatwo ulega zaburzeniom. W rezultacie, protokół ten wymaga praktyki i precyzji, aby wyizolować nienaruszoną tkankę do badania WIP. Jednak po wypreparowaniu nabłonek jest wyraźnie widoczny i łatwy do zobrazowania, co daje obraz procesu gojenia się ran. Metoda ta dostarcza wielu informacji na temat organizacji nabłonka dorosłej muchy, wielkości komórek i syncytium oraz ploidalności komórek i poszczególnych jąder. Chociaż obrazowanie na żywo w nienaruszonej muszce owocowej nie jest jeszcze możliwe ze względu na jej nieprzezroczysty naskórek, protokół ten można dostosować tak, aby uwzględniał obecnie dostępne warunki hodowli ex vivo stosowane u D. melanogaster w celu przeprowadzenia krótkoterminowych badań obrazowania na żywo24.
W przyszłości model ten będzie idealny do badania przesłuchów międzykomórkowych i udziału innych typów komórek w WIP poprzez regulację ekspresji genów za pomocą systemu Gal4/UAS w innych typach komórek będących przedmiotem zainteresowania. Na podobne pytania można również odpowiedzieć, korzystając z różnych środowisk genetycznych i zmutowanych. Wypreparowany odwłok dorosłej muchy zawiera różne typy komórek, które można łatwo zobrazować za pomocą tej metody, w tym ciało tłuszczowe i enocyty, boczne włókna mięśniowe, neurony czuciowe, tchawica i hemocyty podobne do makrofagów. Ponadto model ten pozwoli naukowcom zbadać, w jaki sposób zmienne fizjologiczne wpływają na WIP, w tym płeć, dieta, infekcje, wiek i stresory środowiskowe. Podczas gdy w protokole wykorzystuje się dorosłą samicę muchy ze względu na jej większy rozmiar, WIP występuje również u samców muszki owocowej (Gjelsvik i Losick, niepublikowane). Stwierdzono, że komórki poliploidalne powstają podczas starzenia się i chorób związanych z wiekiem w wątrobie, mózgu, oku i sercu ssaków12. Model muszki owocowej umożliwi naukowcom badanie poliploidyzacji w kontekście fizjologicznym i chorobowym, ponieważ geny związane z chorobami ludzkimi są wysoce konserwatywne.

Drosophila melanogaster to atrakcyjny system modelowy do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów naprawy ran nabłonkowych. Podobnie jak u ssaków, stosowane mechanizmy naprawy tkanek zależą zarówno od tkanki, jak i jej etapu rozwoju. Bezbliznowe gojenie się ran zachodzi w zarodku muszki owocowej, gdzie na krawędzi czołowej nabłonka tworzy się "sznurek torebki" aktomiozyny, umożliwiając płynne zamknięcie rany1,2. Gojenie się ran po zarodku u larw, poczwarek i dorosłych muszek owocowych powoduje przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, tworzenie blizn melaniny i wzrost komórek nabłonkowych3,4,5,6. Komórki nabłonkowe zwiększają swój rozmiar w wyniku fuzji komórek i endocyklu, niepełnego cyklu komórkowego, który omija mitozę3,4,7,8. W rezultacie utrata komórek jest kompensowana przez wzrost komórek poliploidalnych, a nie przez podział komórek. Dorosły osobnik tylny, jelito środkowe i nabłonek mieszków włosowych również polegają na wzroście komórek poliploidalnych, aby skompensować utratę komórek po uszkodzeniu tkanki9,10,11.
Poliploidia jest dobrze znanym aspektem rozwoju organizmów u roślin i owadów, ale w ciągu ostatnich kilku lat stało się bardziej oczywiste, że poliploidia jest konserwatywną strategią naprawy tkanek u kręgowców12. Danio pręgowany, który ma zdolność regeneracji serca, polega na wzroście komórek poliploidalnych, aby leczyć uszkodzone nasierdzie13. Poliploidalność przyczynia się również do regeneracji wątroby ssaków i naprawy nabłonka kanalików nerkowych po ostrym urazie14,15. W tych przykładach komórki poliploidalne są generowane przez endoreplikację poprzez endocykl lub endomitozę, co skutkuje komórką dwujądrową z powodu blokady cytokinezy12. Zagadką jest, dlaczego komórki poliploidalne powstają podczas gojenia się ran i jak poliploidalność wpływa na funkcję tkanek. Ostatnie badania dostarczyły nowych informacji na pytanie, czy poliploidalność ma zaletę czy wadę leczniczą. W episierdziu danio pręgowanego poliploidalność zwiększała szybkość gojenia się ran13. Stwierdzono, że u D. melanogaster w jelicie tylnym i wątrobie ssaków poliploidalność chroni przed wzrostem onkogennym11,14. W nabłonku dorosłej muchy stwierdzono niedawno, że poliploidalność umożliwia gojenie się ran w obecności stresu genotoksycznego16. Endoreplikacja jest odporna na uszkodzenia DNA, co pozwala na gojenie się ran, gdy proliferacja komórek byłaby zagrożona17. Jednak w przypadku kardiomiocytów w sercach myszy i danio pręgowanego poliploidalność spowalnia gojenie, co skutkuje zwiększonym tworzeniem blizn18,19. Dlatego, w zależności od narządu i/lub typu komórki, poliploidalność może być korzystną lub szkodliwą strategią naprawy tkanek. Dostępność genetyki D. melanogaster w połączeniu z analizą odpowiedzi na poliploidyzację indukowaną raną (WIP) sprawia, że jest to idealny system modelowy do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i komórkowych, które kierują tą strategią gojenia się ran.
Tutaj prezentujemy protokół analizy WIP w nabłonku dorosłego D. melanogaster. Dołączone są instrukcje dotyczące uszkadzania muszek owocowych, preparowania, barwienia immunologicznego, montowania, obrazowania i analizy ponownego nabłonkowania, fuzji komórek i endoreplikacji (ploidalności). Obrazowanie i analizę ploidalną można również dostosować do innych modeli w celu sprawdzenia, czy występuje WIP. Należy zauważyć, że wraz ze wzrostem zawartości jądrowego DNA często następuje odpowiedni wzrost wielkości jądra. Istnieje jednak wiele przykładów w biologii, gdzie rozmiar jądra nie odzwierciedla odpowiedniej zmiany w ploidy20. Jeszcze większą ostrożność należy zachować przy interpretacji wielkości jądra w kontekście środowiska rany, w którym komórki często rozprzestrzeniają się lub rozciągają, aby pokryć miejsce rany. Dlatego jedynym ostatecznym dowodem zmiany w ploidalności jest zmierzenie zawartości DNA tą metodą (lub innymi, takimi jak sekwencjonowanie całego genomu)21. Metoda ta zwiększa przydatność dorosłego nabłonka brzusznego D. melanogaster jako modelu do badania roli i regulacji poliploidalności w gojeniu się ran.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Do tworzenia płytek do preparacji w</td></tr><tr><td>stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Do przygotowania odczynników barwiących w</td></tr><tr><td>AxioImager M2 z Apotome</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td>Do obrazowania próbek</td></tr><tr><td>Dmuchawka mini</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104M</td><td>Do znieczulania D. melanogaster szczepy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, 30%</td> <td>Sigma</td><td>A7284-500ML</td><td>Do barwienia immuostainowego</td></tr><tr><td>Zbiornik na dwutlenek węgla</td><td>różne dystrybutory</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do znieczulania szczepów D. melanogaster</td></tr><tr><td>Zestaw Click-iT EdU 594 Thermofisher</td><td></td><td>C10339</td><td>Do testu EdU</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermofisher</td><td>3406</td><td>Do montażu</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td>Do barwienia immuostainingu</td></tr><tr><td>płytek preparacyjnych (użyj zestawu Sylgard 184 Sil Elastic Kit)</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>184SIL</td><td>Do tworzenia płytek do preparacji. Wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z zaleceniami, pozostaw do wyschnięcia na noc</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-królikowe IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A21206</td><td>Do wtórnego barwienia immuostainicznego</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>A10042</td><td>Do wtórnego barwienia immuostainu</td></tr><tr><td>Rurki i złączki Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-124C, 59-123, 59-140</td><td>Do znieczulania szczepów D. melanogaster</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-20</td><td>Do preparowania</td></tr><tr><td>epi-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b38793</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b38793, b27392</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Do wykonywania obliczeń ploidalnych</td></tr><tr><td>Fidżi/ImageJ (oprogramowanie do analizy obrazu)</td><td>NIH</td><<td>a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Pokarm dla much</td><td>Archon Scientific</td><td>N/A</td><td>Syrop kukurydziany/pokarm sojowy</td></tr><tr><td>Flystuff Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>Do znieczulania D. szczepy melanogaster</td></tr><tr><td>Szklana miska preparcyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td>Do wykonywania sekcji w</td></tr><tr><td>szkiełkach szklanych</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-104C</td><td>Do montażu</td></tr><tr><td>koziego przeciwciała anty-mysiego IgG (H + L), koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>Do wtórnego barwienia immuotyka</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Drugorzędowe, Alexa Fluor 568 koniugat</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>Do wtórnego barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Grace's Insects Medium, niesuplementowany</td><td>Thermofisher</td><td>11595030</td><td>Do preparowania w</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Do ranienia i przypinania płaskich odwłoków much</td></tr><tr><td>Mysz anty-Fasciclin III (Drosophila) Pierwotne przeciwciało</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>7G10</td><td>Do barwienia immunologicznego połączeń komórka-komórka nabłonkowa</td></tr><tr><td>Pożywki do barwienia</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antyblakowy nośnik montażowy zapobiegający wybielaniu zdjęć podczas obrazowania</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td>Do uszczelniania szkiełek</td></tr><tr><td>Wytrząsarka ortibal</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-988</td><td>Do barwienia immuostainu</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, PH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>Do barwienia</td></tr><tr><td>uchwytów na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91606-07</td><td>Do ranienia</td></tr><tr><td>pierwotnego przeciwciała przeciwziarnistego królika</td><td>Niedotyczy</td><td></td> Nie dotyczy <td>Do barwienia immunologicznego jąder nabłonkowych. Protokół wytwarzania przeciwciała można znaleźć (Ref. # 4 i 8)</td></tr> <tr><td>Królicze przeciwciało pierwotne anty-RFP</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Do barwienia immunologicznego nabłonka muchy mCD8-RFP</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Do preparowania i montażu tkanki muchy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>10789704001</td><td>Do barwienia immuostainu</td></tr><tr><td>UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN</td><td>VDRC (v) i Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>v108837, b6292</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>UAS-fzr RNAi, UAS-Stg</td><td>VDRC (v) i Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>v25550, b56562</td><td>Grendler et al. Rozwój, 2019</td></tr><tr><td>UAS-Myc</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b9674</td><td>Grendler i wsp. Rozwój, 2019</td></tr><tr><td>UAS-myc RNAi</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b36123</td><td>Grendler i wsp. Rozwój, 2019</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-00</td><td>Do preparacji</td></tr></tbody></table>

model drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Poliploidia jest częstym zjawiskiem, którego wpływ na zdrowie organizmu i choroby jest nadal słabo poznany. Komórka jest definiowana jako poliploidalna, jeśli zawiera więcej niż diploidalną kopię swoich chromosomów, co jest wynikiem endoreplikacji lub fuzji komórek. Stwierdzono, że w naprawie tkanek poliplooidyzacja indukowana ranami (WIP) jest konserwatywną strategią gojenia od muszek owocowych do kręgowców. WIP ma kilka zalet w stosunku do proliferacji komórek, w tym odporność na wzrost onkogenny i stres genotoksyczny. Wyzwaniem było określenie, dlaczego powstają komórki poliploidalne i jak funkcjonują te unikalne komórki. Dostarczono szczegółowy protokół do badania WIP w nabłonku dorosłej muszki owocowej, w którym komórki poliploidalne są generowane w ciągu 2 dni po ranie kłutej. Korzystając z obszernego zestawu narzędzi genetycznych D. melanogaster, zaczęto identyfikować geny niezbędne do inicjowania i regulowania WIP, w tym Myc. Dalsze badania z wykorzystaniem tej metody mogą ujawnić, w jaki sposób inne zmienne genetyczne i fizjologiczne, w tym płeć, dieta i wiek, regulują i wpływają na funkcję WIP.

Przedstawiono szczegółowy protokół wykorzystania D. melanogaster jako modelu do badania poliploidyzacji indukowanej zranieniem (WIP). Ten model gojenia ran oferuje wiele zalet w porównaniu z ssakami oraz innymi modelami much w badaniach nad WIP. Poliploidię łatwo było wywołać poprzez mechaniczne nakłucie szpilką entomologiczną, a komórki poliploidalne powstawały w krótkim czasie (2-3 dpi) (Rycina 1A, 1B)4. Głównym wyzwaniem jest wypreparowanie nienaruszonej tkanki brzusznej bez zakłócania struktury nabłonka. Nabłonek D. melanogaster jest podatny na przypadkowe uderzenia lub zadrapania ostrymi narzędziami preparacyjnymi. Dlatego przed przystąpieniem do analizy należy przećwiczyć poszczególne kroki niniejszego protokołu.
W pierwszej kolejności uraz ograniczono do brzusznej strony odwłoka samicy, która zapewnia duży, płaski i nieprzezroczysty obszar tkanki, idealny do obrazowania. Rany kłute zadano w nabłonku pleurytów, znajdującym się po obu stronach brzusznych sternitów linii środkowej, celując pomiędzy segmentami tergitów (T) T4-T5 (Rysunek 1A-C). Takie rozmieszczenie ran zapewnia duży widoczny obszar, który nie zostaje naruszony podczas sekcji. Trudne etapy obejmują cięcie odwłoka nożyczkami sprężynowymi oraz przypinanie (Rysunek 1D, 1E). Cięcie nożyczkami sprężynowymi przebiegało najskuteczniej, gdy odwłoki przecinano w niewielkiej objętości roztworu Grace'a (~30 µL), aby ograniczyć ruch tkanki. Konieczne było wykonanie precyzyjnego cięcia wzdłuż grzbietowej linii środkowej, aby zapewnić wystarczającą powierzchnię płatów grzbietowych odwłoka do ich przypięcia w pozycji otwartej na płytce sekcyjnej (Rysunek 1C). Odwłok należy delikatnie przypiąć w czterech narożnikach, nie używając nadmiernej siły (Rysunek 1E). Zbyt mocne dociśnięcie szpilką spowoduje zniekształcenie tkanki odwłoka, a nawet jej wciśnięcie w płytkę sekcyjną. W takim przypadku tkankę należy odrzucić. Po utrwaleniu tkanki odwłoka pozostawała ona na płytce sekcyjnej aż do zakończenia barwienia immunofluorescencyjnego i zamontowania odwłoków na szkiełku podstawowym w celu obrazowania (Rysunek 1F).
Gojenie ran wymaga utworzenia ciągłej warstwy nabłonka, co jest zależne od endoreplikacji i fuzji komórek4,16. Białko złączeń septalnych FasIII, służące do znakowania złączeń międzykomórkowych, stanowiło wskaźnik pozwalający ocenić, czy podczas przygotowania wystąpiły jakiekolwiek zaburzenia procesowe (Rysunek 1G, 1H). Odwłoki z dużymi zadrapaniami (obszary niezbarwione), które zaburzają obszar rany, muszą zostać odrzucone i nie były wykorzystywane do dalszych analiz (Rysunek 1H).
Kolejnym krokiem była analiza nienaruszonych próbek pod kątem wszelkich defektów w procesie WIP. Niniejszy protokół obejmuje oddzielne testy służące do wykrywania różnych aspektów odpowiedzi WIP (Rysunek 2). Naprawa rany została uznana za zakończoną, gdy centralna, duża, wielojądrowa komórka pokryła strup rany (Rysunek 3A). Fuzję komórek wykryto poprzez barwienie na FasIII/Grh i kwantyfikację liczby jąder nabłonkowych Grh+ objętych obszarem wyznaczonym przez FasIII4. Defekty w zamykaniu rany lub reepitelializacji stwierdzano w przypadku zaobserwowania przerw o szerokości &gt;10 µm w płacie nabłonka (Rysunek 3B, czerwona strzałka). Miało to miejsce na przykład wtedy, gdy WIP został zahamowany poprzez aktywację cyklu mitotycznego za pomocą ekspresji stg, fzrRNAi, co zgłoszono w niedawnych doniesieniach16. W tym wariancie genetycznym 52% ran nie było w stanie utworzyć ciągłego płata nabłonka nad strupem rany (Rysunek 3B, 3C).
Inną metodą pomiaru naprawy rany w tym modelu była wizualizacja błony nabłonkowej za pomocą ekspresji UAS-mCD8-ChRFP pod kontrolą epi-Gal44 (Rysunek 2, Rysunek 3D). W grupie kontrolnej 91% ran nabłonkowych zamknęło się całkowicie do 3 dpi, natomiast jednoczesne hamowanie WIP poprzez blokowanie endoreplikacji (E2f1RNAi) i fuzji komórek (RacDN), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, spowodowało, że 92% ran nabłonkowych pozostało całkowicie otwartych (Rysunek 3D, 3E)8,16. Aktywacja mitotycznego cyklu komórkowego poprzez ekspresję stg, fzrRNAi również doprowadziła do defektu zamknięcia rany nabłonkowej. Jednakże dzięki wizualizacji błony komórkowej nabłonka można było określić stopień defektu reepitelializacji. Rany much mutantów WIP (E2f1RNAi, RacDN) były bardziej otwarte niż rany stg, fzrRNAi (Rysunek 3D, przerywany czerwony obrys)16. Ten test gojenia rany w oparciu o obrazowanie błony dostarczył więcej informacji na temat zakresu defektu naprawy rany. W rezultacie defekty reepitelializacji można było podzielić na rany całkowicie otwarte, częściowo zamknięte (tj. szczeliny &gt;10 µm) lub całkowicie zamknięte (Rysunek 3D, 3E).
Oprócz fuzji komórek, komórki nabłonka zwiększają swoje rozmiary poprzez endoreplikację, czyli niepełny cykl komórkowy, który podwaja zawartość DNA w jądrze. Endoreplikację analizowano zarówno poprzez badanie aktywności cyklu komórkowego, jak i bezpośrednie pomiary ploidalności DNA jądrowego (Rysunek 2 oraz Rysunek 4). W tym przypadku aktywność cyklu komórkowego wykryto poprzez włączenie analogu tymidyny, EdU (Rysunek 4A, 4B). Stwierdzono, że komórki nabłonka D. melanogaster wchodzą w endocykl, czyli niepełny cykl komórkowy, który oscyluje między fazami S i G bez intervening fazy M4,12. Dietę dorosłych D. melanogaster uzupełniono o pokarm z EdU+ przed wystąpieniem urazu, a muchy utrzymywano na diecie EdU+ aż do momentu sekcji w 2 dpi (Rysunek 4A). Następnie EdU wykryto przy użyciu protokołu Click-iT producenta. Analiza EdU została wykorzystana do określenia, gdzie, kiedy i ile jąder zostało pobudzonych do wejścia w fazę S w odpowiedzi na ranę. Wykorzystując system Gal4/ UAS, niedawno odkryto, że specyficzna dla nabłonka ekspresja genu myc może albo blokować (mycRNAi), albo nasilać (nadekspresja Myc) zdolność komórek nabłonka do wejścia w fazę S. W rezultacie wykazano, że Myc jest wystarczający do indukcji endoreplikacji w komórkach postmitotycznych, nawet bez urazu16,22.
Następnie ploidię nabłonka określono poprzez bezpośredni pomiar zawartości DNA w jądrach komórkowych. Jądra komórek nabłonka zidentyfikowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego markerem specyficznym dla nabłonka, Grh (Rycyna 4D). W oprogramowaniu do obrazowania Fiji systematycznie zidentyfikowano jądra nabłonka, a następnie zastosowano progowanie na podstawie barwienia jądrowego Grh. Następnie jądra rozdzielono, a obszary zainteresowania (ROI) nałożono na obraz sumy stosów DAPI (Rycyna 4D, zielona strzałka). Wszelkie nakładające się jądra usunięto ręcznie przed pomiarem gęstości zintegrowanej (Integrated Density) wybranych jąder (Rycyna 4D, czerwone strzałki). Ta półautomatyczna metoda pozwala na ilościowe określenie rozkładu i ploidii większości jąder w nieuszkodzonym i zregenerowanym nabłonku brzusznym muchy8. Jak niedawno zgłoszono, jądra nabłonka otaczające ranę w 3 dpi składały się w 44% z jąder poliploidalnych o zawartości DNA powyżej 3C (Rycyna 4E, 4F)16. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z rezultatów EdU, wyciszenie genu myc doprowadziło do znaczącej blokady endoreplikacji, gdyż tylko 9% jąder nabłonka było poliploidalnych, podczas gdy nadekspresja Myc spowodowała, że 100% jąder nabłonka wokół miejsca rany było poliploidalnych (Rycyna 4F)16. Rozmiar jąder nabłonka był również widocznie zależny od ekspresji myc, co objawiało się występowaniem jąder pomniejszonych lub powiększonych. Jednakże pole powierzchni jądra nie jest dokładną miarą ploidii i efektów fizjologicznych, ponieważ czynniki takie jak rozciąganie komórek mogą również wpływać na rozmiar jądra bez zmiany zawartości DNA w jądrze20.
<img alt="Genetyka segmentacji Drosophila; układ eksperymentalny i obrazy mikroskopowe; wyniki analizy genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Powodowanie ran brzucha, sekcja i montaż tkanek dorosłej muszki owocówki. (A) Schemat testu powodowania ran brzucha u osobników dorosłych. Muchy powinny zostać zranione po obu stronach odwłoka na poziomie 4. tergitu (T4). (B) Dorosła samica muszki owocówki 3 dpi z melanchinistycznym strupem powstałym w wyniku gojenia rany (biała ramka). Pasek skali = 50 µm. (C) Sekcja brzucha dorosłego osobnika, widok grzbietowy, z oznaczonymi tergitami. Brzuchy zostały rozcięte wzdłuż linii środkowej strony grzbietowej (biała przerywana linia). Pasek skali = 50 µm. (D) Zsekcjonowane i rozcięte brzuchy dorosłych osobników przed przypięciem. Pasek skali = 50 µm. (E) Przypięty brzuch dorosłego osobnika na płytce sekcyjnej. Szpilkę umieszczono w każdym z czterech rogów brzucha od strony grzbietowej. Tkankę delikatnie otwarto, ale nie rozciągano jej, aby uniknąć rozerwania. (F) Brzuchy dorosłych osobników zostały zamontowane i umieszczone na szkiełku nakrywkowym wewnętrzną stroną brzucha skierowaną w dół, ku szkiełku nakrywkowe, a kutykulą w stronę szkiełka przedmiotowego. (G) Barwienie FasIII nienaruszonego obszaru rany bez zakłóceń podczas obróbki oraz centralny syncytium (żółta przerywana linia). Pasek skali = 50 µm. (H) Obraz zadrapanego obszaru rany (*) z nieobarwionym regionem FasIII, który przerywa syncytium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu immunofluorescencyjnego u muszki owocowej; epi-Gal4/UAS-X, podawanie EdU, wizualizacja połączeń komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat analizy WIP. Przepływ działań przedstawia trzy testy opisane w niniejszym badaniu oraz wspólne i odrębne etapy służące wykrywaniu i pomiarowi odpowiedzi WIP. Test EdU mierzy aktywność cyklu komórkowego (niebieskie pola), ploidię i reepitelializację wykrywa się za pomocą immunostainingu Grh/FasIII (zielone pola), a ekspresja membranowego RFP umożliwia pomiar zakresu zamknięcia rany nabłonkowej (różowe pola). Wspólne etapy znajdują się w szarych polach, a genotypy szczepów D. melanogaster wymieniono powyżej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza gojenia rany, obrazy mikroskopowe i wykres słupkowy przedstawiające zmienność reepitelializacji w próbkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Metody wykrywania reepitelializacji podczas WIP. Reepitelializacja została zaburzona w przypadku genetycznego zahamowania WIP. Obrazy immunofluorescencyjne grupy kontrolnej (A) oraz stg, fzrRNAi (B) w 3 dpi. Jądra komórek nabłonkowych i złącza smugowe zostały zabarwione odpowiednio Grh (zielony) i FasIII (magenta). (A' i B') Samo zabarwienie FasIII wykazało, że reepitelializacja była upośledzona (czerwona strzałka) w nabłonku stg, fzrRNAi. Pasek skali = 50 µm. (C) Ilościowe określenie defektów reepitelializacji (%) w 3 dpi (szary): kontrola (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). Słupki błędu oznaczają błąd standardowy; istotność statystyczną zmierzono za pomocą testu t Studenta, **P &lt; 0.01. Reepitelializację podczas naprawy rany można było również wykryć poprzez ekspresję związanego z błoną białka RFP przy użyciu epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Obrazy immunofluorescencyjne kontroli, E2F1RNAi, RacDN oraz stg, fzrRNAi w 3 dpi. Pasek skali = 20 µm. Strup rany (żółty obrys) i obszar otwartej rany nabłonkowej (czerwony obrys). (E) Ilościowe określenie zamknięcia rany w ctrl (n = 11), E2F1RNAi, RacDN (n = 13) oraz stg, fzrRNAi (n = 13). Adaptowano z Grendler et al.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie regeneracji nabłonka muchy; znakowanie EdU, efekt mycRNAi, histogram, analiza jąder, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Metody wykrywania endoreplikacji podczas WIP. (A) Harmonogram testu EdU: dorosłe Drosophila były karmione 75 µL 5 mM drożdży-EdU każdego dnia przez 2 dni przed uszkodzeniem, a następnie do 2 dpi. (B) Obrazy immunofluorescencyjne znakowania EdU w szczepach much wykazujących ekspresję systemu epi-Gal4/ UAS w 2 dpi. Strup rany (W). Pasek skali = 50 µm. (C) Średnia liczba jąder nabłonka EdU+ na muchę w 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi#1 (n = 10) oraz Myc (n = 8). Słupki błędu oznaczają błąd standardowy; istotność statystyczną określono za pomocą testu t-Studenta, *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01. (D) Schemat wykrywania i pomiaru ploidalności jąder nabłonka. Jądra nabłonka zostały zidentyfikowane i poddane progowaniu za pomocą barwienia przeciw-Grh w programie Fiji. Nakładające się jądra nabłonka zostały rozdzielone (zielone groty strzałek) lub usunięte (czerwone groty strzałek), jeśli były przesłonięte przez jądra nienabłonkowe. Zmierzono gęstość zintegrowaną oraz pole powierzchni jądra na odpowiadającym im obrazie jąder barwionych DAPI. (E) Wielkość jąder nabłonka (Grh) uległa zmianie pod wpływem ekspresji myc w 3 dpi. (F) Ploidalność jąder nabłonka (%) w 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi#1 (n = 6) oraz Myc (n = 3). Adaptowano z Grendler et al.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Poliploidyzacja wywołana raną to zachowana strategia naprawy tkanek, w której komórki rosną zamiast dzielić, aby zrekompensować utratę komórek. Oto szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać muszkę owocową jako model do pomiaru ploidalności i jej regulacji genetycznej w naprawie ran nabłonkowych.

Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Protokół ten może być wykorzystany do badania poliploidyzacji wywołanej raną. Zachowawczy proces naprawy tkanek, w którym komórki rosną zamiast dzielić się u dorosłej muszki owocowej. Prosta rana kłuta może być wykonana, aby wywołać poliploidalność w nabłonku muchy w ciągu zaledwie dwóch dni.Wielkość komórki nabłonkowej, ploidalność i organizację można wtedy łatwo ocenić. Zacznij od zebrania dwóch fiolek, zawierających od 10 do 15 nowo zamkniętych samic muszek owocowych interesującego Cię szczepu. I starzenie much w fiolkach ze świeżą żywnością, z około pięcioma samcami much na fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, do wieku od trzech do pięciu dni.W przypadku zranienia brzucha, pod koniec inkubacji, użyj pojedynczego kołka ze stali nierdzewnej o grubości 0,1 milimetra, aby zmontować kilka uchwytów na szpilki, przy czym ostry koniec każdej szpilki powinien wysunąć się. Znieczulenie starych samic muszek owocowych na podkładce przeciwmuchowej z dwutlenkiem węgla pod mikroskopem stereoskopowym. I za pomocą pędzla ułóż muchy w rzędzie.Nosząc okulary ochronne, z uchwytem na szpilkę w jednej ręce i kleszczami w drugiej, użyj kleszczy, aby ustawić muchy z brzusznymi odwłokami skierowanymi do góry. Następnie nakłuj dorosłe muchy w nabłonkowym niebieskim prawym obszarze celu A4 po obu stronach brzusznej linii środkowej, mieszaj noce i zwróć ranne muchy do fiolki z jedzeniem do pożądanego eksperymentalnego punktu czasowego po urazie. W punkcie końcowym eksperymentu sprawdź obecność rany i blizny w każdej znieczulonej muszce pod mikroskopem stereoskopowym i napełnij jedną studzienkę z dziewięciodołkowego szklanego naczynia preparacyjnego roztworem Grace.Za pomocą kleszczy chwyć zranioną samicę muchy za grzbietową stronę klatki piersiowej i zanurz muchę w studzience roztworu. Drugą ręką użyj drugiej pary kleszczy, aby nakłuć i usunąć naskórek grzbietowy poniżej celu A6, z tyłu muszki owocowej. Jeśli narządy wewnętrzne nie zostaną usunięte, należy uciskać grzbietową stronę brzucha, aby wycisnąć pozostałe narządy.Użyj kleszczy, aby oderwać cały brzuch na skrzyżowaniu klatki piersiowej powyżej celu A2 i przenieś brzuch do studzienki zawierającej około 100 mikrolitrów roztworu Grace. Kiedy wszystkie odwłok zostaną zebrane, zmniejsz objętość roztworu Grace w kolekcji do 30 mikrolitrów. Użyj kleszczy w jednej ręce, aby przytrzymać grzbietową stronę brzucha w dół, a drugą ręką włóż dolne ostrze nożyczek sprężynowych Venice do jamy brzusznej każdego brzucha i przetnij wzdłuż grzbietowej linii środkowej, aż brzuchy będą całkowicie otwarte.Dodaj 30 mikrolitrów roztworu Grace do każdego obszaru montażowego suchej płytki preparacyjnej z 4,1 milimetrowymi kołkami na obszar montażu brzucha i umieść filetowany brzuch w kropli roztworu. Kiedy wszystkie odwłoki zostaną wyfiletowane i umieszczone, przypnij odwłoki do naczynia w czterech rogach grzbietowych. Dbanie o to, aby tkanki leżały płasko bez rozdzierania lub nadmiernego rozciągania tkanki brzusznej.Następnie zastąp roztwór Grace 30 mikrolitrami roztworu utrwalającego na obszar montażowy. I umieść etykietę z taśmą na dnie każdej potrawy, aby oznaczyć każdą grupę kontrolną i eksperymentalną. Do zamontowania próbek tkanek muchy.Po barwieniu użyj kleszczy, aby odpiąć brzuchy od płytki preparacyjnej pod mikroskopem stereoskopowym. I za pomocą kleszczy przenieś każdą próbkę za jej grzbietowy bok do około 30 mikrolitrów podłoża montażowego na indywidualnych szkiełkach nakrywkowych. Pod mikroskopem stereoskopowym zorientuj tkankę brzuszną tak, aby wnętrze było skierowane w dół w kierunku szkiełka nakrywkowego i użyj kleszczy, aby przyciągnąć zorientowane brzuchy do krawędzi każdej kropli pożywki.Umieść każdą zamontowaną szkiełko nakrywkowe na oznakowanym szkiełku podstawowym. I użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar podłoża mocującego. Następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ich zobrazowania.Białko połączenia przegrody szybko trzy, które oznacza połączenia komórek komórkowych, stanowi wskaźnik tego, czy podczas przygotowania wystąpiły jakiekolwiek zakłócenia przetwarzania. Odwłoki z dużymi rysami na niezabarwionym obszarze, które zaburzają obszar rany, muszą zostać odrzucone i nie są uwzględniane w analizie. Gojenie rany jest zakończone, gdy centralna duża komórka wielojądrowa pokrywa strup rany.Przerwy większe niż 10 mikrometrów na arkuszu nabłonka są uważane za wady w zamykaniu ran i ponownym nabłonkowaniu. W tej reprezentatywnej analizie z użyciem much z zahamowaną aktywacją komórek mitotycznych, 52% ran nie było w stanie utworzyć ciągłej warstwy nabłonka na strupie rany. Ten esej o gojeniu się ran błonowych dostarcza więcej informacji na temat zakresu defektu naprawy ran, co pozwala na pogrupowanie defektów reepitelializacji jako całkowicie otwartych, częściowo zamkniętych lub całkowicie zamkniętych.Na przykład w tym eksperymencie zahamowanie poliplooidyzacji wywołanej raną poprzez jednoczesne blokowanie replikacji endo i fuzji komórek, spowodowało, że w 92% ran nabłonkowych pozostały całkowicie otwarte. Natomiast aktywacja mitotycznego cyklu komórkowego spowodowała wadę zamykania ran nabłonkowych. Ponadto aktywność cyklu komórkowego wykryto poprzez włączenie analogu tymidyny EDU, a ploidalność nabłonka określono poprzez bezpośredni pomiar zawartości jądrowego DNA.Podczas wycinania nabłonka brzusznego należy uważać, aby nie dotykać tkanki żadnym z narzędzi do preparacji, ponieważ spowoduje to zarysowanie próbki. Po rozbiorze, proliferacji komórek, śmierci komórki, wielkości nacięcia utraty komórek lub oceny zawartości jądrowego DNA można przeprowadzić, aby lepiej zrozumieć poliploidyzację wywołaną raną. lub inne procesy w obrębie nabłonka.

a-drosophila-model-to-study-wound-induced-polyploidization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje wykorzystanie fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych u poczwarek Drosophila. Zielone hemocyty są przyciągane do uszkodzonego nabłonka, po czym następuje dalsza migracja. Fotokonwersja przesuwa niektóre hemocyty z zielonego na czerwony, ułatwiając śledzenie ich ruchu.

Technika fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach owadów

Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.

Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Analiza klonów mozaiki w nabłonku dysku imaginalnego Drosophila to potężny system modelowy do badania genetycznych i komórkowych mechanizmów nowotworzenia. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji guzów w dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS i wprowadzamy metodę diagnozy w celu klasyfikacji fenotypów guza.

Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Ta metoda pozwala na generowanie tetraploidalnych i triploidalnych nicieni Caenorhabditis z dowolnego szczepu diploidalnego. Szczepy poliploidalne wygenerowane tą metodą zostały wykorzystane do badania interakcji chromosomów w profazie mejotycznej, a metoda ta jest przydatna do badania ważnych podstawowych pytań w biologii komórki, rozwoju, ewolucji i raka.

Manipulacja ploidalnością u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie i wizualizację utrwalonej tkanki poczwarki Drosophila notum. Może być stosowany zarówno do nienaruszonej, jak i zranionej tkanki, a oryginalna architektura tkanki zostaje zachowana. Procedury preparowania, mocowania i barwienia są opisane w tym artykule.

Preparowanie, naprawianie i wizualizacja poczwarki Drosophila notum

Poznaj metodę badania poliploidyzacji indukowanej raną w modelu Drosophila melanogaster. Protokół umożliwia ocenę wielkości komórek nabłonkowych, ploidalności i organizacji tkanek w ciągu dwóch dni.

Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Przeglądaj więcej filmów