Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Protokół ten może być wykorzystany do badania poliploidyzacji wywołanej raną. Zachowawczy proces naprawy tkanek, w którym komórki rosną zamiast dzielić się u dorosłej muszki owocowej. Prosta rana kłuta może być wykonana, aby wywołać poliploidalność w nabłonku muchy w ciągu zaledwie dwóch dni.

Wielkość komórki nabłonkowej, ploidalność i organizację można wtedy łatwo ocenić. Zacznij od zebrania dwóch fiolek, zawierających od 10 do 15 nowo zamkniętych samic muszek owocowych interesującego Cię szczepu. I starzenie much w fiolkach ze świeżą żywnością, z około pięcioma samcami much na fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, do wieku od trzech do pięciu dni.

W przypadku zranienia brzucha, pod koniec inkubacji, użyj pojedynczego kołka ze stali nierdzewnej o grubości 0,1 milimetra, aby zmontować kilka uchwytów na szpilki, przy czym ostry koniec każdej szpilki powinien wysunąć się. Znieczulenie starych samic muszek owocowych na podkładce przeciwmuchowej z dwutlenkiem węgla pod mikroskopem stereoskopowym. I za pomocą pędzla ułóż muchy w rzędzie.

Nosząc okulary ochronne, z uchwytem na szpilkę w jednej ręce i kleszczami w drugiej, użyj kleszczy, aby ustawić muchy z brzusznymi odwłokami skierowanymi do góry. Następnie nakłuj dorosłe muchy w nabłonkowym niebieskim prawym obszarze celu A4 po obu stronach brzusznej linii środkowej, mieszaj noce i zwróć ranne muchy do fiolki z jedzeniem do pożądanego eksperymentalnego punktu czasowego po urazie. W punkcie końcowym eksperymentu sprawdź obecność rany i blizny w każdej znieczulonej muszce pod mikroskopem stereoskopowym i napełnij jedną studzienkę z dziewięciodołkowego szklanego naczynia preparacyjnego roztworem Grace.

Za pomocą kleszczy chwyć zranioną samicę muchy za grzbietową stronę klatki piersiowej i zanurz muchę w studzience roztworu. Drugą ręką użyj drugiej pary kleszczy, aby nakłuć i usunąć naskórek grzbietowy poniżej celu A6, z tyłu muszki owocowej. Jeśli narządy wewnętrzne nie zostaną usunięte, należy uciskać grzbietową stronę brzucha, aby wycisnąć pozostałe narządy.

Użyj kleszczy, aby oderwać cały brzuch na skrzyżowaniu klatki piersiowej powyżej celu A2 i przenieś brzuch do studzienki zawierającej około 100 mikrolitrów roztworu Grace. Kiedy wszystkie odwłok zostaną zebrane, zmniejsz objętość roztworu Grace w kolekcji do 30 mikrolitrów. Użyj kleszczy w jednej ręce, aby przytrzymać grzbietową stronę brzucha w dół, a drugą ręką włóż dolne ostrze nożyczek sprężynowych Venice do jamy brzusznej każdego brzucha i przetnij wzdłuż grzbietowej linii środkowej, aż brzuchy będą całkowicie otwarte.

Dodaj 30 mikrolitrów roztworu Grace do każdego obszaru montażowego suchej płytki preparacyjnej z 4,1 milimetrowymi kołkami na obszar montażu brzucha i umieść filetowany brzuch w kropli roztworu. Kiedy wszystkie odwłoki zostaną wyfiletowane i umieszczone, przypnij odwłoki do naczynia w czterech rogach grzbietowych. Dbanie o to, aby tkanki leżały płasko bez rozdzierania lub nadmiernego rozciągania tkanki brzusznej.

Następnie zastąp roztwór Grace 30 mikrolitrami roztworu utrwalającego na obszar montażowy. I umieść etykietę z taśmą na dnie każdej potrawy, aby oznaczyć każdą grupę kontrolną i eksperymentalną. Do zamontowania próbek tkanek muchy.

Po barwieniu użyj kleszczy, aby odpiąć brzuchy od płytki preparacyjnej pod mikroskopem stereoskopowym. I za pomocą kleszczy przenieś każdą próbkę za jej grzbietowy bok do około 30 mikrolitrów podłoża montażowego na indywidualnych szkiełkach nakrywkowych. Pod mikroskopem stereoskopowym zorientuj tkankę brzuszną tak, aby wnętrze było skierowane w dół w kierunku szkiełka nakrywkowego i użyj kleszczy, aby przyciągnąć zorientowane brzuchy do krawędzi każdej kropli pożywki.

Umieść każdą zamontowaną szkiełko nakrywkowe na oznakowanym szkiełku podstawowym. I użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar podłoża mocującego. Następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ich zobrazowania.

Białko połączenia przegrody szybko trzy, które oznacza połączenia komórek komórkowych, stanowi wskaźnik tego, czy podczas przygotowania wystąpiły jakiekolwiek zakłócenia przetwarzania. Odwłoki z dużymi rysami na niezabarwionym obszarze, które zaburzają obszar rany, muszą zostać odrzucone i nie są uwzględniane w analizie. Gojenie rany jest zakończone, gdy centralna duża komórka wielojądrowa pokrywa strup rany.

Przerwy większe niż 10 mikrometrów na arkuszu nabłonka są uważane za wady w zamykaniu ran i ponownym nabłonkowaniu. W tej reprezentatywnej analizie z użyciem much z zahamowaną aktywacją komórek mitotycznych, 52% ran nie było w stanie utworzyć ciągłej warstwy nabłonka na strupie rany. Ten esej o gojeniu się ran błonowych dostarcza więcej informacji na temat zakresu defektu naprawy ran, co pozwala na pogrupowanie defektów reepitelializacji jako całkowicie otwartych, częściowo zamkniętych lub całkowicie zamkniętych.

Na przykład w tym eksperymencie zahamowanie poliplooidyzacji wywołanej raną poprzez jednoczesne blokowanie replikacji endo i fuzji komórek, spowodowało, że w 92% ran nabłonkowych pozostały całkowicie otwarte. Natomiast aktywacja mitotycznego cyklu komórkowego spowodowała wadę zamykania ran nabłonkowych. Ponadto aktywność cyklu komórkowego wykryto poprzez włączenie analogu tymidyny EDU, a ploidalność nabłonka określono poprzez bezpośredni pomiar zawartości jądrowego DNA.

Podczas wycinania nabłonka brzusznego należy uważać, aby nie dotykać tkanki żadnym z narzędzi do preparacji, ponieważ spowoduje to zarysowanie próbki. Po rozbiorze, proliferacji komórek, śmierci komórki, wielkości nacięcia utraty komórek lub oceny zawartości jądrowego DNA można przeprowadzić, aby lepiej zrozumieć poliploidyzację wywołaną raną. lub inne procesy w obrębie nabłonka.