31 marca 2022
Ten protokół służy jako obszerny samouczek do ustandaryzowanego i powtarzalnego mieszania lepkich materiałów za pomocą nowatorskiej technologii automatyzacji open source. Znajdują się tam szczegółowe instrukcje dotyczące obsługi nowo opracowanej stacji roboczej typu open source, korzystania z projektanta protokołów open source oraz walidacji i weryfikacji w celu identyfikacji powtarzalnych mieszanin.
Badania biomedyczne stoją w obliczu kryzysu odtwarzalności, ponieważ nowe wyniki badań rzadko znajdują zastosowanie w zastosowaniach terapeutycznych. Protokół ten redukuje czynnik ludzki i wprowadza automatyzację i standaryzację do produkcji. Metoda ta koncentruje się w szczególności na fotosieciowalnych hydrożelach do zastosowań w hodowlach komórkowych 3D, ponieważ hydrożele stały się najczęściej używaną platformą w modelach tkanek nowotworowych i innych chorób w ciągu ostatniej dekady.
Udało nam się rozwiązać obecne ograniczenia sprzętowe i programowe, opracowując platformę technologiczną open source. Platforma ta została zaprojektowana specjalnie dla hydrożeli i umożliwia zautomatyzowane procesy produkcyjne na potrzeby badań w zakresie inżynierii tkankowej. Aby zainstalować interfejs API, otwórz interfejs wiersza poleceń.
Aby zainstalować interfejs API pracy, wpisz install openworkstation i naciśnij Enter. Aby uruchomić moduł biofabrykacji pipetowania, wprowadź polecenie, aby zainstalować interfejs API opentrons. Następnie użyj wiersza poleceń, aby otworzyć skrypt języka Python i sprawdzić, czy oba interfejsy API zostały pomyślnie zainstalowane.
Aby wygenerować kod protokołu, otwórz aplikację do projektowania protokołu, aby wygenerować niestandardowy skrypt protokołu, który zostanie wykonany przez platformę. Interfejs działa w każdej powszechnie używanej przeglądarce internetowej. Wprowadź nazwę protokołu na stronie konfiguracji i kliknij przycisk Kontynuuj.
W ustawieniach tacy wejściowej wybierz blok grzewczy trzy na cztery, aby zdefiniować tacę wejściową. Aby zdefiniować materiały i stężenia zapasów, wybierz Gel 1 z menu definiuj wejścia i wprowadź GelMA jako nazwę. Ustaw stężenie zapasu na 20%, a liczbę próbek na trzy i kliknij przycisk Dodaj, aby zapisać wpisy i wypełnić pierwszą kolumnę.
Wybierz Gel 2 z menu definiowania wejść i wprowadź Alginate jako nazwę. Ustaw stężenie zapasu na 4%, a liczbę próbek na trzy i kliknij przycisk Dodaj, aby zapisać wpisy i wypełnić drugą kolumnę. Po ustawieniu parametrów fotoinicjatora i rozcieńczalnika, jak pokazano, wybierz sieciowanie zdjęć, ustaw czas na 30 sekund, a intensywność na dwie i kliknij OK. Następnie ustaw typ płytki studzienkowej na płytkę 96-dołkową i kliknij Grupa 1, aby umożliwić określenie parametrów tworzenia hydrożeli z podwójną siecią.
Następnie w razie potrzeby zaznacz pole zastosuj zaawansowany protokół mieszania, ustaw liczbę próbek na 96 i kliknij przycisk Kontynuuj. Aby ustawić układ pokładu, wybierz odpowiedni typ tacy dla każdego miejsca. Po wybraniu wszystkich typów tacek kliknij lewe pole pipety i wybierz z menu rozwijanego opcję 10 do 100 mikrolitrów wyporności.
Ustaw prędkość zasysania na 600, a prędkość dozowania na 800. Następnie w ten sam sposób ustaw odpowiednie parametry pipety. Następnie kliknij przycisk Generuj protokół, aby wygenerować i zapisać skrypt protokołu.
Przed wykonaniem protokołu spryskaj materiały eksploatacyjne 70% etanolem i ustaw je zgodnie z konfiguracją zdefiniowaną w ustawieniach użytkownika. Umieść rurki reakcyjne z materiałami w bloku aluminiowym na dokach temperatury zgodnie z wybraną konfiguracją. Następnie spryskaj rękawice 70% etanolem i ostrożnie otwórz probówki reakcyjne, nie dotykając otwartych probówek.
Gdy substancje osiągną odpowiednią temperaturę eksperymentalną, uruchom wygenerowany protokół za pomocą interfejsu użytkownika. Stacja robocza rozpocznie proces bazowania, a następnie pobierze pustą płytę studzienki z modułu magazynującego. Po zdjęciu pokrywy z płytki studzienki, płytka jest transportowana do następnego modułu.
Protokół określa objętość pipetowaną z każdego roztworu podstawowego i automatycznie zmienia końcówki po każdym materiale, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Aby mieszać lepkie roztwory w powtarzalny sposób, stacja robocza wykonuje specjalny protokół mieszania, który został zoptymalizowany pod kątem lepkich hydrożeli. Aplikacja do projektowania protokołów uwzględnia poziom napełnienia zbiornika i automatycznie dostosowuje wysokość mieszania, aby zapobiec niepotrzebnemu zanurzaniu się w lepkich materiałach.
Po automatycznym wygenerowaniu modeli 3D i płytek studzienkowych, stacja robocza ponownie zamyka płytkę studzienki z pokrywą i przechowuje płytkę studzienki w zaprogramowanej pozycji w module magazynu. Po zakończeniu protokołu wyjmij płytkę z modułu przechowywania. W celu walidacji i weryfikacji przeprowadzonego protokołu należy załadować płytkę do spektrofotometru i dwukrotnie odczytać absorbancję przy 450 nanometrach.
Po zapisaniu wartości absorbancji otwórz plik arkusza kalkulacyjnego analizy, który jest dostarczony jako materiał uzupełniający w publikacji i skopiuj odczyty absorbancji do tabeli w surowym arkuszu danych. Następnie kliknij arkusz analizy, aby wyświetlić wartości średnie, odchylenie standardowe i współczynnik wariancji, które są automatycznie obliczane i wyświetlane dla równomiernego rozkładu próbki dla określonych wierszy i dla określonych kolumn płytki 96-dołkowej. Aby znaleźć konfigurację, która zapewnia wysoką odtwarzalność roztworów glicerolu, wygenerowano protokoły bez kontroli temperatury i bez dotyku końcówki, z kontrolą temperatury i bez dotyku końcówki lub z kontrolą temperatury i z dotykiem końcówki.
Obliczony współczynnik zmienności wartości dla trzech konfiguracji ujawnił znaczący wpływ stacji dokującej temperatury i funkcji dotyku końcówki, podkreślając zdolność protokołu do generowania wysoce powtarzalnych wyników przy użyciu obu funkcji. Korzystając z funkcji dotykowej końcówki ze stacją dokującą temperatury, odchylenie standardowe zostało znacznie zmniejszone w konfiguracji trzeciej. Wykreślenie wartości absorbancji próbki dla układu trzeciego nie wykazało żadnych rosnących ani malejących wartości w całym eksperymencie, a zatem nie wykazało wpływu położenia próbki na wartości absorbancji.
Następnie przygotowano serię rozcieńczeń GelMA, rozcieńczając 20% roztwór podstawowy GelMA i oceniając różnice między różnymi rozcieńczeniami GelMA. Wartość absorbancji mierzona na każdym etapie koncentracji znacznie się różniła, a regresja liniowa wykazała wysokie dopasowanie, potwierdzając zdolność do generowania różnych kroków stężenia. Ponadto wpływ dotyku końcówki oceniano dla hydrożeli o podwójnej sieci z 5%GelMA, 2% alginianem i 0,15% LAP, które były generowane automatycznie za pomocą konfiguracji.
Integracja dotyku końcówki powoduje znaczne zmniejszenie odchylenia standardowego, co wspiera generowanie powtarzalnego zestawu danych. Wizualizacja wartości absorbancji i map cieplnych potwierdziła zmniejszone odchylenie przy użyciu dotyku końcówki do usuwania nadmiaru materiału z końcówki. Nasza technologia umożliwia automatyzację produkcji hydrożelu do hodowli komórkowych 3D i inżynierii tkankowej.
Jest to niedrogie rozwiązanie zwiększające przepustowość i odtwarzalność trudnych technicznie przepływów pracy. Zapewniając konfigurowalne podejście open source, technologia ta toruje drogę do powszechnej adaptacji automatyzacji procesów w badaniach nad inżynierią tkankową.
Niniejszy protokół stanowi kompleksowy instruktaż ustandaryzowanego mieszania materiałów lepkich z wykorzystaniem technologii automatyzacji open source. Koncentruje się on na obsłudze nowo opracowanej stacji roboczej zaprojektowanej dla hydrożeli sieciowanych fotochemicznie w zastosowaniach w 3D cell culture.
Ręczne obchodzenie się z lepkimi biomateriałami wprowadza zmienność, która obniża powtarzalność w modelach przedklinicznych, opóźniając walidację celów i identyfikację wiodących cząsteczek. Ta otwarta platforma automatyzacji standaryzuje wytwarzanie hydrożeli, ograniczając błędy ludzkie i umożliwiając tworzenie skalowalnych, powtarzalnych systemów kultur 3D do mechanistycznego ograniczania ryzyka. Dzięki integracji kontroli temperatury i walidacji dotyku końcówki, platforma ta wspiera spójne przygotowanie modeli istotnych dla danej choroby na potrzeby opracowywania testów i przepływów pracy w badaniach przesiewowych.
Platforma integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając zautomatyzowane przygotowanie hydrożeli do walidacji celów terapeutycznych, umożliwia następnie prowadzenie screeningu przy użyciu ustandaryzowanych formatów testów 3D oraz wspiera badania translacyjne poprzez tworzenie powtarzalnych modeli przedklinicznych.