Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie i oczyszczenie jajowodu BDNF w zoptymalizowanym protokole obejmującym transfekcję komórek HEK293 i oczyszczanie w kolumnie chromatograficznej. Jajowód BDNF jest następnie monobiotynylowany w reakcji in vitro w celu znakowania a posteriori i wykrywania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej procedury jest to, że umożliwia produkcję, oczyszczanie i monobiotynylację BDNF w zoptymalizowany sposób.

Parametry ciąży zostały zoptymalizowane pod kątem maksymalnej produkcji BDNF przy użyciu ekonomicznego odczynnika do transfekcji, a proces oczyszczania odbywa się w konfiguracji chromatograficznej, która ułatwia manipulację i pozwala na eskalację procedury. Zacznij od rozcieńczenia 60 mikrogramów polietyleniminy w 500 mikrolitrach nieuzupełnionego DMEM i 20 mikrogramów plazmidu jajowodu BDNF w 500 mikrolitrach niesuplementowanego DMEM na 15-centymetrową miskę, która ma być transfekowana. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie pipetować roztwór DNA do probówki z polietylenu, mieszając raz ruchem góra/dół.

Inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wlać jeden mililitr mieszaniny PEI/DNA do każdej 15-centymetrowej naczynia. Inkubować komórki z mieszaniną PEI/DNA przez trzy godziny, a następnie zmienić pożywkę na bufor inkubacyjny. 48 godzin po transfekcji komórek zbierz pożywkę ze wszystkich szalek.

Następnie dodaj składniki pożywki BDNF do supernatantu HEK293, w tym chlorek sodu, składniki buforowane fosforanem, imidazol i inhibitory proteazy. Inkubować w lodzie przez 15 minut. Następnie porcjować pożywkę do probówek wirówkowych.

Wirować przez 45 minut w temperaturze 10 000 g w złotej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten etap pozwala na eliminację resztek komórkowych i martwych komórek zawieszonych w pożywce. Następnie zbierz supernatanty.

Dodaj BSA w końcowym stężeniu 0,1% i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do dwóch miesięcy. Aby oczyścić BDNF, zacznij od rozmrożenia pożywki w kąpieli termoregulowanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie podzielić pożywkę na porcje do probówek wirówkowych.

Wirować przez godzinę w temperaturze 3 500 g w złotej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten etap pozwala na eliminację pozostałych zanieczyszczeń, aby zapewnić odpowiedni przepływ przez kolumnę chromatograficzną. Następnie użyj koncentratorów białka, aby zmniejszyć pożywkę z 500 mililitrów do 100 mililitrów.

Postępuj zgodnie z zalecanymi przez producenta parametrami wirowania, aby uzyskać optymalne stężenie. Następnie dodaj 500 mikrolitrów kulek agarozy niklowo-NTA do zagęszczonej pożywki i inkubuj przez noc w bujaczku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zmontuj aparaturę chromatograficzną i wlej do niej pożywkę.

Pozwól mu odpocząć przez pięć minut, a następnie otwórz dwukierunkowy kurek odcinający, aby przepuścić medium. Płukać pięcioma mililitrami buforu do płukania przez pięć minut, upewniając się, że kulki zostały ponownie zawieszone w kolumnie. Powtórz trzy razy.

Na koniec dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego do kolumny, upewniając się, że kulki zostały ponownie zawieszone. Inkubować przez 15 minut, a następnie zebrać eluent w probówce do mikrowirówki. Powtórz ten krok trzy razy, aby całkowicie usunąć BDNF.

Aby biotynylować BDNF, należy pobrać podwielokrotność zawierającą 800 nanogramów białka i dodać odczynnik buforowy biotynylacji, a następnie trochę BirA-GST w stosunku molowym jeden do jednego do BDNF. Inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 60 minut, mieszając zawartość probówki co 15 minut przez inwersję. Następnie dodać taką samą objętość ATP i BirA-GST jak w pierwszym kroku i inkubować przez 60 minut, mieszając zawartość probówki co 15 minut.

Biotynylowany BDNF można następnie pozostawić w lodzie w celu natychmiastowej weryfikacji biotynylacji lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy a posteriori. Aby zweryfikować biotynylację jajowodu BDNF, należy rozpocząć od zablokowania 30 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę BDNF w buforze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie wytrącić kulki magnetyczne w magnetycznym separatorze zębatkowym, a następnie wyrzucić bufor blokujący.

Dodaj 50 mikrolitrów świeżego buforu blokującego i próbkę BDNF do kulek, upewniając się, że zostały całkowicie ponownie zawieszone. Homogenizować zawartość probówki i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę w rotatorze probówek do mikrowirówek. Przygotować próbkę do western blot zgodnie z opisem w tekście, aby ocenić skuteczność reakcji biotynylacji.

Aby sprzęgnąć jajowód BDNF z kropkami kwantowymi, zacznij od dodania niezbędnej objętości kropek kwantowych, aby uzyskać relację molową jeden do jednego z BDNF, a następnie rozcieńcz do końcowej objętości 20 mikrolitrów. Zhomogenizuj zawartość tuby, a następnie zawiń ją w folię aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w bujaku.

Następnie rozcieńczyć jajowód BDNF do pożądanego stężenia końcowego i dodać go do przedziału aksonalnego komory mikroprzepływowej, inkubując przez 210 minut w celu obrazowania późniejszych żywych lub utrwalonych komórek. Zastosowanie protokołu opartego na kolumnie chromatograficznej pozwala na przetwarzanie znacznych ilości pożywek kondycjonowanych HEK293. W tym eksperymencie przetworzono 500 mililitrów kondycjonowanych pożywek w celu oczyszczenia jajowodu BDNF.

Cztery kolejne eluacje trwające 15 minut każda dały zmniejszenie stężenia jajowodu BDNF w zakresie od sześciu do 28 nanogramów na mikrolitr. Całkowity plon wyniósł około 60 mikrogramów jajowodu BDNF. Ten oczyszczony BDNF został następnie poddany biotynylacji w reakcji in vitro, w której pośredniczył BirA-GST.

Próbka była jednorodnie biotynylowana, o czym świadczy brak niebiotynylowanego jajowodu BDNF w supernatancie buforu oczyszczonego z kulek magnetycznych. Wyniki te pokazują, że proponowany protokół pozwala na oczyszczenie znacznych ilości jajowodu BDNF i jednorodną monobiotynylację in vitro. Następnie aktywność biologiczną monobiotynylowanego BDNF oceniono przy użyciu dwóch różnych podejść eksperymentalnych.

Najpierw neurony korowe umieszczone na 60-milimetrowych płytkach stymulowano 50 nanogramami na mililitr monobiotynylowanego BDNF przez 30 minut, a następnie przygotowano białka do analizy western blot. Aktywność biologiczną monobiotynylowanego BDNF określono ilościowo, wykrywając fosfo-TrkB i fosfo-ERK. Wiązanie BDNF z TrkB wyzwala autofosforylację receptora i aktywację kilku dalszych kinaz, w tym ERK.

Do analizy aktywności biologicznej jajowodu BDNF włączono stan kontroli negatywnej, który nie był stymulowany BDNF, oraz stan kontroli pozytywnej, który był stymulowany dostępnym na rynku BDNF. Oba prążki były fosforylowanymi białkami, miały podobną intensywność w neuronach leczonych komercyjnym BDNF i monobiotynylowanym BDNF i oba wykazywały silniejszy sygnał niż w warunkach kontroli negatywnej. Następnie oceniono aktywność biologiczną monobiotynylowanego BDNF sprzężonego z kropkami kwantowymi streptawidyny, aby wykazać, że można je wykorzystać w eksperymentach obrazowania na żywo.

Neurony korowe umieszczono w 10-milimetrowych osłonach i potraktowano końcowym stężeniem 200 pikomolarnych lub dwóch nanomolowych kropek kwantowych BDNF przez 30 minut przed utrwaleniem i barwieniem na fosfo-CREB. CREB jest czynnikiem transkrypcyjnym, który jest celem aktywowanego ERK12 w neuronach korowych. Stymulacja neuronów rosnącym stężeniem kropek kwantowych BDNF spowodowała zależny od dawki wzrost fosforylacji CREB i obecności cząstek kropek kwantowych otaczających jądro, co wskazuje, że cząstki kropek kwantowych BDNF były endocytozowane i wyzwalały aktywację szlaków sygnałowych związanych z aktywacją TrkB za pośrednictwem BDNF.

Dwukrotny wzrost sygnału fosfo-CREB wykryto podczas stymulacji neuronów 200 pikomolarnymi kropkami kwantowymi BDNF, podczas gdy stymulacja dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi BDNF spowodowała 3,5-krotny wzrost sygnału fosfo-CREB. Dlatego biotynylowany jajowód BDNF jest biologicznie aktywny i nie traci swojej aktywności w połączeniu z kropkami kwantowymi streptawidyny, dzięki czemu nadaje się do immunofluorescencji i obrazowania żywych komórek. Na koniec oceniono potencjał obrazowania kropek kwantowych BDNF w kulturach podzielonych na przedziały przy użyciu komór mikroprzepływowych.

Neurony korowe umieszczono w komorach mikroprzepływowych w celu oddzielenia przedziałów aksonalnych i somatodendrytycznych i stymulowano je dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi BDNF przez 3,5 godziny. Przeprowadzono mikroskopię żywych komórek, a uzyskane kimografy wykorzystano do ilościowego określenia prędkości kropek kwantowych zawierających organelle BDNF. Wykryto średnią prędkość ruchu wynoszącą 0,91 mikrometra na sekundę, co jest zgodne z wcześniejszą analizą transportu za pośrednictwem cytoplazmatycznej tyminy.

Komory mikroprzepływowe potraktowane dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi streptawidyny nie wykazywały poruszających się kropek kwantowych w mikrogrupach, jak pokazano na kimografie. Komórki hodowane w tych samych warunkach stymulowano 500 pikomolarnymi lub dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi BDNF przez 210 minut, a następnie utrwalano i znakowano barwnikiem jądrowym. Neurony traktowane kropkami kwantowymi BDNF wykazują zależną od dawki akumulację znakowanego białka we wszystkich analizowanych podprzedziałach, w tym w proksymalnej i dystalnej części mikrogrupy oraz w kompartmencie somatodendrytycznym.

W przeciwieństwie do tego, neurony kontrolne nie wykazywały prawie żadnego sygnału kropek kwantowych w całej komorze. W związku z tym kropka kwantowa BDNF może być wykrywana w żywych i nieruchomych komórkach w komorach mikroprzepływowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać monobiotynylowany jajowód BDNF w opłacalnej procedurze opartej na kolumnie chromatograficznej.