Name: Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanego BDNF z komórek HEK293 z wykorzystaniem chromatografii afinitycznej oraz enzymatycznej monobiotynylacji za pomocą BirA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) oraz nagrody UK Dementia Research Institute Foundation (GS). Prace te były wspierane przez Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi CONICYT (Chilijska Narodowa Komisja Badań Naukowych i Technologicznych). Protokoły wykorzystane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komisje ds. Bezpieczeństwa Biologicznego oraz Bioetyki i Dobrostanu Zwierząt Pontificia Universidad Católica de Chile. Eksperymenty na kręgowcach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Bioetyki i Dobrostanu Zwierząt Pontificia Universidad Católica de Chile.
UWAGA: Poniższy protokół został opracowany do oczyszczania BDNFAvi z całkowitej objętości 500 ml kondycjonowanej pożywki wyprodukowanej w komórkach HEK293. Ilość kondycjonowanego podłoża, które jest produkowane i przetwarzane w celu oczyszczenia BDNFAvi, może być w razie potrzeby zwiększana lub zmniejszana. Jednak w takich okolicznościach może być konieczna dalsza optymalizacja. Skład pożywek hodowlanych i stosowanych w całym protokole można znaleźć w materiałach uzupełniających. 
1. Produkcja i oczyszczanie BDNFAvi z pożywek kondycjonowanych HEK293
<ol>
	<li>Transfekcja komórek HEK293
	<ol>
		<li>Hoduj komórki HEK293 do 70% konfluencji w uzupełnionym pożywce DMEM (10% bydlęca surowica płodowa, 1x suplement glutaminianu, 1x antybiotyk/antybiotyk / antybiotyk przeciwgrzybiczy) w 15 cm szalkach hodowlanych w temperaturze 37 ºC.</li>
		<li>Zmień pożywkę na bufor transfekcji.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę PEI-DNA do transfekcji. Użyj dwóch różnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml, aby rozcieńczyć odpowiednio DNA i PEI 25 K. Rozcieńczyć 20 μg plazmidowego DNA w końcowej objętości 500 μl w jednej probówce. Rozcieńczyć 60 μg liniowego PEI 25K w końcowej objętości 500 μl w drugiej probówce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. </li>
		<li>Ostrożnie odpipetować roztwór DNA do probówki PEI, mieszając raz ruchem góra-dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut. </li>
		<li>Wlej 1 ml mieszaniny PEI-DNA do każdej 15-centymetrowej płytki. Inkubować komórki z mieszaniną PEI-DNA przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zmienić pożywkę na świeży bufor inkubacyjny. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie i przechowywanie multimediów
	<ol>
		<li>Zebrać pożywkę ze wszystkich szalek 48 godzin po transfekcji komórek HEK293. Przygotować skoncentrowane zapasy roztworów opisanych w sekcji "Bufor do modyfikacji sklarowanego nad osadem" w pliku uzupełniającym 1 i dodać je do supernatantu HEK293 w celu uzyskania wymienionych stężeń końcowych. 
		UWAGA: Komórki można wyrzucić lub odzyskać w celu dalszej analizy.</li>
		<li>Inkubować pożywkę w lodzie przez 15 minut. </li>
		<li>Podwielokrotność pożywki przelać do probówek wirówkowych.</li>
		<li>Odwirować pożywkę o stężeniu 10 000 x g przez 45 minut w wirówce o temperaturze 4 °C. Ten etap pozwala na eliminację resztek komórkowych i martwych komórek zawieszonych w pożywce. </li>
		<li>Zebrać supernatanty, dodać BSA w końcowym stężeniu 0,1%, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C. Pożywkę można porcjować przed zamrożeniem w celu szybszego rozmrożenia na etapie oczyszczania. 
		UWAGA: Czas przechowywania zamrożonych pożywek kondycjonowanych do 2 miesięcy przyniósł pozytywne wyniki, dłuższe czasy przechowywania nie zostały ocenione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zagęszczanie i oczyszczanie mediów
	<ol>
		<li>Rozmrozić podłoże w łaźni termoregulowanej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Podzielić pożywkę na porcje do probówek wirówkowych. </li>
		<li>Odwirowywać pożywkę przez 1 godzinę przy 3 500 x g w wirówce schłodzonej w temperaturze 4 °C. Ten etap pozwala na eliminację pozostałych resztek komórkowych, aby zapewnić odpowiedni przepływ przez kolumnę chromatograficzną.</li>
		<li>Użyj koncentratorów białka z odcięciem 10 kDa, aby zmniejszyć pożywkę z 500 ml do 100 ml. Postępuj zgodnie z zalecanymi przez producenta parametrami wirowania, aby uzyskać optymalne stężenie.</li>
		<li>Dodać 500 μl kulek agarozy Ni-NTA do zagęszczonej pożywki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w bujaku. </li>
		<li>Zmontować aparaturę chromatograficzną i wlać do niej pożywkę. Pozostaw na 5 minut, a następnie otwórz 2-kierunkowy kran, aby przepuścić medium.</li>
		<li>Przemyj koraliki 5 ml buforu do płukania przez 5 minut. Upewnij się, że koraliki zostały ponownie zawieszone w kolumnie. Opróżnij bufor płuczkowy, otwierając 2-drogowy kurek. Powtórz 3 razy.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu elucyjnego do kolumny. Upewnij się, że koraliki w kolumnie zostały ponownie zawieszone. Inkubować przez 15 minut, a następnie zebrać eluat w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz ten krok 3 razy, aby uzyskać całkowitą eliminację BDNFAvi.</li>
		<li>Załaduj 5 μl każdego eluatu i różne stężenia dostępnego w handlu BDNF (40-160 ng) w 15% żelu poliakrylamidowym. Wykryj oczyszczone białko za pomocą western blotting przy użyciu przeciwciała anty-BDNF. </li>
		<li>Oznaczyć stężenie oczyszczonego BDNFAvi w każdym eluacie, stosując krzywą stężeń przygotowaną z dostępnym w handlu BDNF.</li>
		<li>Podwielokrotnić i przechowywać oczyszczony BDNFAvi w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Monobiotynylacja BDNFAvi in vitro przy użyciu enzymu BirA
<ol>
	<li>Reakcja monobiotynylacji in vitro
	<ol>
		<li>Przygotować skoncentrowane roztwory podstawowe odczynników buforowych biotynylacji. Zastosowanie skoncentrowanych wywarów zminimalizuje rozcieńczenie rekombinowanego białka. </li>
		<li>Pobrać podwielokrotność 800 ng BDNFAvi i dodać odczynniki buforowe do biotynylacji oraz enzym BirA w stosunku molowym 1:1 do BDNF. Na przykład w przypadku 200 μl końcowej objętości reakcyjnej dodać; 100 μl roztworu zawierającego 800 ng BDNFAvi, 20 μl bicyny 0,5 M pH 8,3, 20 μl ATP 100 mM, 20 μl MgOAc 100 mM, 20 μl d-biotyny 500 μM, 0,8-1 μg do 1 μl BirA-GST i uzupełnić do 200 μl wodą ultraczystą. 
		UWAGA: Pomyślne reakcje biotynylacji przeprowadzono z podwielokrotnościami 400 μL zawierającymi stężenie około 30 ng/μL BDNFAvi, w wyniku czego uzyskano jednorodnie biotynylowany BDNFAvi do końcowego stężenia ~20 ng/μL w końcowej reakcji.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C w piecu do hybrydyzacji przez 1 godzinę. Mieszać zawartość przez odwrócenie rurki co 15 minut. </li>
		<li>Dodaj taką samą objętość ATP i BirA jak w kroku 2.1.2 i powtórz krok 2.1.3. </li>
		<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz lub przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia (np. kontrola jakości biotynylacji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza biotynylacji
	<ol>
		<li>Zablokuj 30 μl kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę BDNF w 1 ml buforu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w rotatorze probówek do mikrowirówek. </li>
		<li>Wytrącić kulki magnetyczne za pomocą stojaka do separacji magnetycznej przez 3 do 5 minut lub do momentu, gdy bufor wydaje się całkowicie oczyszczony z kulek i wyrzucić bufor blokujący.</li>
		<li>Dodać 50 μl świeżego buforu blokującego i 80 ng monobiotynylowanej próbki BDNFAvi (mbtBDNF) do kulek, upewniając się, że zostały całkowicie ponownie zawieszone przez pipetowanie.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w rotatorze probówki do mikrowirówki, obracającym się z prędkością około 20 obr./min. </li>
		<li>Zebrać kulki za pomocą stojaka do separacji magnetycznej przez 3 do 5 minut i zebrać supernatant, zachowując 30 μl podwielokrotności do analizy.</li>
		<li>Umyj kulki jednorazowo 500 μl PBS, a następnie zbieraj je za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego przez 3 do 5 minut. Odzyskać supernatant i zachować 30 μl podwielokrotności do analizy. </li>
		<li>Dodaj 10 μl 4x bufora ładującego do kulek.</li>
		<li>Podgrzewać próbki do temperatury 97 °C przez 7 minut w celu elucji mbtBDNF. </li>
		<li>Wykryj mbtBDNF za pomocą przeciwciała specyficznego dla anty-BDNF19.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Weryfikacja aktywności biologicznej mbtBDNF
<ol>
	<li>Wykrywanie pTrkB i pERK przez western blot.
	<ol>
		<li>Umieść 2 miliony neuronów korowych szczurów w 60-milimetrowych szalkach hodowlanych. </li>
		<li>Hoduj neurony przez 7 dni (DIV7). Następnie, rozpoczynając eksperyment, zmień pożywkę na nieuzupełniony mediun neurobazalny.</li>
		<li>Godzinę po zmianie pożywki dodać mbtBDNF do końcowego stężenia 50 ng/ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przechowywać naczynie do kontroli ujemnej (niestymulowane BDNF) i naczynie do kontroli dodatniej (poddane działaniu 50 ng/ml dostępnego w handlu BDNF).</li>
		<li>Zbierz podłoże i delikatnie umyj każde naczynie 1x PBS. Zbierz i wyrzuć 1x PBS.</li>
		<li>Umieść naczynia na lodzie i dodaj 50-80 μl buforu do lizy do każdego naczynia. Użyj skrobaka do komórek, aby zlizować komórki. 
		UWAGA: Etap lizy należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć defosforylacji i degradacji białek. Wystarczą 1-2 minuty energicznego skrobania, aby uwidocznić interesujące białka za pomocą western blotting. </li>
		<li>Zebrać bufor do lizy i mieszać w mieszalniku wirowym z najwyższą prędkością przez 5 sekund.</li>
		<li>Odwirować bufor do lizy w temperaturze 14 000 x g (4 °C) przez 10 minut. Zebrać supernatant.</li>
		<li>Określić ilościowo zawartość białka w supernatantze za pomocą protokołu kwantyfikacji białka BCA20.</li>
		<li>Dodać bufor ładujący do podwielokrotności zawierającej 30-50 μg białka na warunek i załadować go do 12% żelu poliakrylamidowego do western blotting. Wykrywanie pTrkB i pERK za pomocą specyficznych przeciwciał fosfologicznych w celu weryfikacji aktywności biologicznej BDNFAvi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weryfikacja aktywności biologicznej BDNF-QD metodą immunofluorescencji pCREB.
	<ol>
		<li>Wysiewamy 40 000 neuronów kory mózgowej szczurów w 10-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, uprzednio autoklawowanych i traktowanych poli-L-lizyną, jak opisano wcześniej21.</li>
		<li>Hodować neurony przez 7-8 dni w buforze podtrzymującym neurony (patrz materiały dodatkowe) w temperaturze 37 ºC. </li>
		<li>Aby rozpocząć eksperyment, należy zmienić pożywkę na niesuplementowaną pożywkę neuropodstawową i inkubować w temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przygotuj mbtBDNF sprzężony z kropkami kwantowymi (BDNF-QD), dodając do podwielokrotności mbtBDNF niezbędną objętość koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi (streptawidyna-QD), aby uzyskać stosunek molowy BDNF-QD 1:1. Następnie rozcieńczyć do 20 μl pożywką neuropodstawową. Owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. 
		UWAGA: Przygotować kolejną probówkę z tą samą objętością koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi i rozcieńczyć ją do 20 μl podłożem neurobazalnym jako kontrolę ujemną.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę mbtBDNF/streptawidyny-QD przez 30 minut w temperaturze pokojowej w bujaku. </li>
		<li>Rozcieńczyć BDNF-QD do pożądanego stężenia końcowego (200 pM i 2 nM) w podłożu neuropodstawnym.</li>
		<li>Po 1 godzinie inkubacji z nieuzupełnioną pożywką neurobazalną stymulować neurony BDNF-QD lub streptawidyną-QD (kontrola) do końcowego stężenia 200 pM i 2 nM BDNF przez 30 minut w temperaturze 37 °C. </li>
		<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy 1x PBS (37 °C) i utrwal komórki na 15 minut, traktując szkiełko nakrywkowe 4% roztworem paraformaldehydu zawierającym inhibitory fosfatazy.</li>
		<li>Przemyć komórki 3 razy PBS, a następnie inkubować z buforem blokującym/permeabilizacyjnym (BSA 5%, Triton X-100 0,5%, 1x inhibitor fosfatazy) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem anty-pCREB 1:500 (w 3% BSA, 0,1% Triton X-100) przez noc w temperaturze 4 °C. </li>
		<li>Następnego dnia przemyć 3 razy 1x PBS i inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100). </li>
		<li>Umyj 3 razy za pomocą 1x PBS. Dodawać roztwór barwienia jądrowego Hoechst (5 μg/ml) przez 7 min. </li>
		<li>Umyj 3 razy za pomocą 1x PBS i zamontuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja wstecznego transportu aksonalnego BDNF-QD w żywych neuronach
	<ol>
		<li>Przygotuj komory mikroprzepływowe i neurony nasienne zgodnie z wcześniejszym opisem16.</li>
		<li>Po 7-8 dniach w hodowli zmień pożywkę na niesuplementowaną pożywkę neuropodstawową.</li>
		<li>Przygotuj mbtBDNF sprzężony z kropkami kwantowymi (BDNF-QD), dodając do podwielokrotności mbtBDNF niezbędną objętość koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi (streptawidyna-QD), aby uzyskać stosunek molowy BDNF-QD 1:1. Następnie rozcieńczyć do 20 μl pożywką neuropodstawową. Owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. 
		UWAGA: Przygotować kolejną probówkę z tą samą objętością koniugatu streptawidyny z kropkami kwantowymi i rozcieńczyć ją do 20 μl pożywką neurobazalną jako kontrolą.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę mbtBDNF/streptawidyny-QD przez 30 minut w temperaturze pokojowej w bujaku. </li>
		<li>Rozcieńczyć BDNF-QD do pożądanego stężenia końcowego (2 nM).</li>
		<li>Po 1 godzinie inkubacji z nieuzupełnioną pożywką neurobazalną dodać BDNF-QD lub mieszaninę kontrolną do przedziałów aksonalnych komory mikroprzepływowej. Inkubować przez 210 minut w temperaturze 37 °C, aby zapewnić wsteczny transport netto BDNF-QD.</li>
		<li>W przypadku obrazowania żywych komórek należy zobrazować aksonalny transport wsteczny w segmencie mikrorowków, który jest proksymalny do przedziału ciała komórki, za pomocą obiektywu 100x przy użyciu mikroskopu odpowiedniego do tego celu (37 °C i 5% CO2). Rejestruj obrazy z szybkością 1 klatki/s. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huang, E., Reichardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+Roles+in+Neuronal+Development+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotrophin+family+of+neurotrophic+factors%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mollecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview.</a> Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).</li>
<li>Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+neuronal+growth+by+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).</li>
<li>Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+role+for+BDNF+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Mollecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A simple role for BDNF in learning and memory.</a> Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).</li>
<li>Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronfman%2C+FC+%22Neurotrophic+Factor.+Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22">Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology</a>. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).</li>
<li>Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+of+neurotrophins+in+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development.</a> Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).</li>
<li>Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52 (2), 293(2006).</li>
<li>Escudero, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+%28JNK%29-dependent+internalization+and+Rab5-dependent+endocytic+sorting+medaited+long-distance+retrograde+neuronal+death+induced+by+axonal+BDNF-p75+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling.</a> Scientific Reports. 9, 6070(2019).</li>
<li>Vrabec, J. P., Levin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of cell death in glaucoma.</a> Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).</li>
<li>Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+alters+retrograde+transport+of+TrkB+receptors+in+striatal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites.</a> Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).</li>
<li>Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapin+recruits+dynein+to+BDNF-TrkB+signaling+endosomes+for+retrograde+axonal+transport+and+is+essential+for+dendrite+growth+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons.</a> Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).</li>
<li>Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF-GFP+containing+secretory+granules+are+localized+in+the+vicinity+of+synaptic+junctions+of+cultured+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons.</a> Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).</li>
<li>Adachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+affects+dendritic+transport+of+BDNF-containing+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles.</a> Scientific Reports. 5, 12684(2015).</li>
<li>Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/">https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/</a> (2012).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+underlying+activity-dependent+insertion+of+TrkB+into+the+neuronal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface.</a> Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).</li>
<li>Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+axonal+transport+of+quantum+dot-labeled+BDNF+in+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).</li>
<li>Deerinck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+fluorescent+quantum+dots+to+confocal%2C+multiphoton+and+electron+microscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).</li>
<li>Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+epilepticus+induces+a+TrkB+to+p75+neurotrophin+receptor+switch+and+increases+brain-derived+neurotrophic+factor+interaction+with+p75+neurotrophon+receptor%3A+an+initial+event+in+neuronal+injury+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction.</a> Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).</li>
<li>Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29+regulates+Rab5-positive+early+endosomes+in+hippocampal+neurons+to+induce+dendritic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).</li>
<li>Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+local+and+intercellular+BDNF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).</li>
<li>Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1">https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1</a> (2019).</li>
<li>Mowla,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+post-translational+processing+of+the+precursor+to+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).</li>
<li>Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Mammalian+Cell+Transfection+with+Polyethyleneimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI).</a> Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).</li>
<li>Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+polyethyleneimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods. 55 (1), 44-51 (2011).</li>
<li>Dalton, A., Barton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein expression in mammalian cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).</li>
<li>Stepanenko, A. A., Heng, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+vector+transfection%3A+Pitfalls%2C+off-target+effects%2C+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts.</a> Mutation Research. 773, 91-103 (2017).</li>
<li>Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modulation+of+TrkB+receptor+signaling+upon+sequential+delivery+of+curcumin-DHA+loaded+carriers+towards+promoting+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Angelova, A., Angelov, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+and+multi-drug+delivery+nanoparticles+towards+neuronal+survival+and+synaptic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair.</a> Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano zoptymalizowaną metodologię produkcji i oczyszczania mbtBDNF w procedurze opartej na chromatografii powinowactwa, w oparciu o pracę Sunga i współpracowników17. Optymalizacje obejmują zastosowanie opłacalnego odczynnika do transfekcji (PEI) przy jednoczesnym zachowaniu wydajności droższych metod transfekcji, takich jak lipofektamina. Taka optymalizacja przekłada się na znaczne obniżenie kosztów w protokole, pozwalając na skalowalność przy zachowaniu wysokiej efektywności kosz...

Neurony to funkcjonalne jednostki układu nerwowego posiadające złożoną i wyspecjalizowaną morfologię, która umożliwia komunikację synaptyczną, a tym samym generowanie skoordynowanych i złożonych zachowań w odpowiedzi na różne bodźce. Projekcje neuronalne, takie jak dendryty i aksony, są krytycznymi cechami strukturalnymi zaangażowanymi w komunikację neuronalną, a neurotrofiny odgrywają kluczową rolę w określaniu ich morfologii i funkcji1. Neurotrofiny to rodzina wydzielanych czynników wzrostu, która obejmuje NGF, NT-3, NT-4 i neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)2. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) BDNF uczestniczy w różnych procesach biologicznych, w tym między innymi w neurotransmisji, arboryzacji dendrytycznej, dojrzewaniu kolców dendrytycznych, długotrwałym wzmocnieniu3,4. Dlatego BDNF odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji neuronów.
Różnorodne procesy komórkowe regulują dynamikę i funkcję BDNF. Na powierzchni neuronu BDNF wiąże kinazę receptora tropomiozyny B (TrkB) i/lub receptor neurotrofiny p75 (p75). Kompleksy BDNF-TrkB i BDNF-p75 są endocytozowane i sortowane w różnych organellach endocytarnych5,6,7,8. Prawidłowy transport wewnątrzkomórkowy kompleksu BDNF/TrkB jest wymagany do prawidłowej sygnalizacji BDNF w różnych obwodach neuronalnych9,10,11. Z tego powodu głębokie zrozumienie dynamiki transportu BDNF i jej zmian w procesach patofizjologicznych jest niezbędne do zrozumienia sygnalizacji BDNF w zdrowiu i chorobie. Opracowanie nowatorskich i specyficznych narzędzi molekularnych do monitorowania tego procesu przyczyni się do rozwoju tej dziedziny i umożliwi lepsze zrozumienie związanych z tym mechanizmów regulacyjnych.
Istnieje kilka narzędzi dostępnych do badania handlu BDNF w neuronach. Powszechnie stosowana metodologia polega na transfekcji rekombinowanego BDNF oznaczonego cząsteczkami fluorescencyjnymi, takimi jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub monomeryczny fluorescencyjny wariant GFP z przesunięciem ku czerwieni mCherry12,13. Jednak główną wadą nadekspresji BDNF jest to, że eliminuje ona możliwość dostarczania znanych stężeń tej neurotrofiny. Może to również powodować toksyczność komórkową, zasłaniając interpretację wyników14. Alternatywną strategią jest transfekcja TrkB oznaczonego epitopem, takiego jak Flag-TrkB. Metodologia ta pozwala na badanie dynamiki internalizacji TrkB15, ale obejmuje również transfekcję, która może skutkować zmienioną funkcją TrkB i toksycznością komórkową. Aby przezwyciężyć te przeszkody metodologiczne, opracowano rekombinowane warianty NGF i BDNF zawierające sekwencję Avi (BDNFAvi), która może być monobiotynylowana przez enzym ligazy biotyny BirA, 16,17. Biotynylowany rekombinowany BDNF może być sprzężony z różnymi narzędziami związanymi ze streptawidyną, które obejmują między innymi fluorofory, kulki, nanocząstki paramagnetyczne do wykrywania. Jeśli chodzi o obrazowanie żywych komórek, kropki kwantowe (QD) stały się często używanymi fluoroforami, ponieważ mają pożądane cechy do śledzenia pojedynczych cząstek, takie jak zwiększona jasność i odporność na fotowybielanie w porównaniu z fluoroforami drobnocząsteczkowymi18.
Produkcja mono-biotynylowanego BDNF (mbtBDNF) przy użyciu BDNFAvi została osiągnięta poprzez kotransfekcję plazmidów napędzających ekspresję BDNFAvi i BirA, a następnie oczyszczanie rekombinowanego białka za pomocą chromatografii powinowactwa z wydajnością 1-2 μg BDNF na 20 ml pożywki hodowlanej kondycjonowanej HEK29317. W tym miejscu proponujemy modyfikację tego protokołu, która pozwala na oczyszczanie BDNFAvi z 500 ml pożywki kondycjonowanej HEK293, co ma na celu maksymalizację odzysku białka w protokole opartym na kolumnie chromatograficznej w celu ułatwienia manipulacji. Zastosowany środek do transfekcji, polietylenoimina (PEI), zapewnia opłacalną metodę bez poświęcania wydajności transfekcji. Etap monobiotynylacji został dostosowany do reakcji in vitro, aby uniknąć powikłań związanych z kotransfekcją i zapewnić jednorodne znakowanie BDNF. Aktywność biologiczną mbtBDNF wykazano w eksperymentach z użyciem western blot i mikroskopii fluorescencyjnej, w tym aktywacji pCREB i obrazowaniu żywych komórek w celu zbadania wstecznego transportu aksonalnego BDNF w komorach mikroprzepływowych. Zastosowanie tego protokołu pozwala na zoptymalizowaną, wysokowydajną produkcję jednorodnego monobiotynylowanego i biologicznie aktywnego BDNF.

<table><tbody><tr><td>Zawór 2-drogowy</td><td>BioRad</td><td>7328102</td><td>Komponent aparatury chromatograficznej</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>BDNF bufor elucyjny</td></tr><tr><td>Akrylamid/Bisakryloamid</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td>preparat żelowy SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td>stężenie BDNF</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A9164</td><td>SDS-PAGE preparat żelowy</td></tr><tr><td>przeciwciało anty B-III-tubulina</td><td>Sigma</td><td>T8578</td><td>Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF</td></tr><tr><td>przeciwciało anty BDNF</td><td>Alomone</td><td>AGP-021</td><td>Testy Western blot do oznaczania ilościowego BDNF</td></tr><tr><td>przeciwciało anty BDNF</td><td>Alomone</td><td>ANT-010</td><td>Testy Western blot do oznaczania ilościowego BDNF</td></tr><tr><td>Komórka przeciwciała anty ERK</td><td> Sygnalizacja</td><td>9102</td><td>Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF</td></tr><tr><td>przeciwciało anty pCREB (S133)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9198</td><td>Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej przeciwciała</td></tr><tr><td>anty pERK BDNF (T202, Y204)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4370</td><td>Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF</td></tr><tr><td>przeciwciało anty pTrkB (Y515)</td><td>Abcam</td><td>ab109684</td><td>Testy Western blot do wykrywania aktywności biologicznej BDNF</td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>HEK293 utrzymanie</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>BDNF bufor monobiotynylacyjny</td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Utrzymanie neuronów</td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma</td><td>B3876</td><td>BDNF bufor monobiotynylacyjny</td></tr><tr><td>BirA-GST</td><td>BPS Bioscience</td><td>70031</td><td>Enzym do monobiotynylacji BDNF AviTag</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>HyClone</td><td>HC. SH30396.02</td><td>HEK293 utrzymanie</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>Składnik modyfikacji buforu BDNF, bufor blokujący dla western blot i immunofluorescencji</td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>Bufor monobiotynylacyjny BDNF</td></tr><tr><td>DMEM Medium o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Neuron wysiewający</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-081</td><td>HEK293 konserwacja</td></tr><tr><td>Lejek kolumny Econo</td><td>BioRad</td><td>7310003</td><td>Komponent aparatury chromatograficznej</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw EZ-ECL</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>1633664</td><td>Wykrywanie białek za pomocą western blotting</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Konserwacja Neuron i HEK293</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>104094</td><td>Bufor elucyjny BDNF, bufor do lizy do testów western blot</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 46R Wirówka</td><td>Hettich</td><td>wycofana z produkcji</td><td>Wirówka używana do usuwania zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Hettich Wirówka uniwersalna 32R Hettich</td> wycofana z <td></td><td>produkcji</td><td>Wirówka używana do wirowania koncentratora białek</td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Wysiew neuronów</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 500</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>29005063</td><td>Western blot Akwizycja obrazu Western blot</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I55513</td><td>Komponent modyfikacji bufora BDNF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>BM-1370</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Komponent KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>PBS komponent</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Powłoka pokrywy dla neuronów podzielonych na przedziały</td></tr><tr><td>Adapter rurki Luer BioRad</td><td></td><td>7323245</td><td>Komponent aparatury chromatograficznej</td></tr><tr><td>Luminata&trade; Forte Western HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0100</td><td>Wykrywanie białka przez western blotting</td></tr><tr><td>Mg(CH3COO)2</td><td>Merck</td><td>105819</td><td>BDNF bufor monobiotynylacyjny</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Odczynnik montażowy do testów immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>MyOne C1 Streptawidyna Kulki magnetyczne</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>Weryfikacja biotynylacji</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Składnik modyfikacji bufora BDNF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>BM-1630</td><td>PBS, składnik modyfikacji buforu BDNF</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>106346</td><td>Składnik modyfikacji bufora BDNF</td></tr><tr><td>Podłoże neurobazowe</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Konserwacja neuronów</td></tr><tr><td>Koraliki agarozowe Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>BDNF Oczyszczanie AviTag</td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td> do <td>obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>BioRad</td><td>1620115</td><td>Transfer białka do western blotting</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 Cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>Kamera do obrazowania epifluorescencyjnego</td></tr><tr><td>P8340 Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Składnik modyfikacji buforu BDNF</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>104005</td><td>Utrwalacz do testów immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Utrzymanie neuronów</td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Corning</td><td>DLW354210</td><td>Powłoka pokrywająca dla neuronów podzielonych na przedziały</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Milipora</td><td>P2363</td><td>Powłoka pokrywająca dla neuronów niepodzielonych na przedziały</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna Poly-Prep</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>Składnik aparatury chromatograficznej</td></tr><tr><td>Polietylenoimina 25K</td><td>Polysciences Inc.</td><td>PLY-0296</td><td>HEK293 transfekcja</td></tr><tr><td>Kropki kwantowe 655 koniugat streptawidyny</td><td>Invitrogen</td><td>Q10121MP</td><td>Monobiotynylowana etykieta BDNF AviTag do eksperymentów z żywymi i stałymi komórkami</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td>Detergent do testów immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Syldgard 184 silikonowa baza elastomerowa</td><td>Poirot</td><td>4019862</td><td>Przygotowanie komory mikroprzepływowej</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td>SDS-PAGE preparat żelowy</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Winkler</td><td>BM-2000</td><td>Składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Merck</td><td>108603</td><td>Permeabilizacja komórek w testach immunofluorescencyjnych i western blot</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,5%</td> <td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>HEK293 pasażowanie</td></tr></tbody></table>

ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego bdnf w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293, a następnie ekonomicznie oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. Opracowano powtarzalny protokół bezpośredniego monobiotynylowania BDNFAvi enzymem BirA w probówce. W tej reakcji monobiotynylowany BDNFAvi zachowuje swoją aktywność biologiczną.
Neurotrofiny są czynnikami wzrostu pochodzenia docelowego, odgrywającymi rolę w rozwoju i utrzymaniu neuronów. Wymagają szybkich mechanizmów transportowych wzdłuż szlaku endocytarnego, aby umożliwić sygnalizację na duże odległości między różnymi przedziałami neuronalnymi. Opracowanie narzędzi molekularnych do badania transportu neurotrofin umożliwiło precyzyjne śledzenie tych białek w komórce za pomocą rejestracji in vivo. W tym protokole opracowaliśmy zoptymalizowaną i opłacalną procedurę produkcji monobiotynylowanego BDNF. Rekombinowany wariant BDNF zawierający biotynylowaną sekwencję avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w zakresie mikrogramów, a następnie oczyszczany w łatwo skalowalnej procedurze przy użyciu chromatografii powinowactwa. Oczyszczony BDNF może być następnie jednorodnie monobiotynylowany w bezpośredniej reakcji in vitro z enzymem BirA w probówce. Aktywność biologiczna monobiotynylowanego BDNF (mbtBDNF) może być sprzężona ze streptawidyną sprzężoną z różnymi fluoroforami. BDNFAvi i mbtBDNF zachowują swoją aktywność biologiczną, o której wykazano odpowiednio poprzez wykrywanie dalszych fosforylowanych celów za pomocą western blot i aktywacji czynnika transkrypcyjnego CREB. Korzystając z kropek kwantowych streptawidyny, byliśmy w stanie zwizualizować internalizację mbtBDNF towarzyszącą aktywacji CREB, którą wykryto za pomocą przeciwciała specyficznego dla fosfo-CREB. Ponadto mbtBDNF sprzężony ze streptawidyną-kropkami kwantowymi nadawał się do analizy transportu wstecznego w neuronach korowych hodowanych w komorach mikroprzepływowych. Tak więc wytwarzany w probówce mbtBDNF jest niezawodnym narzędziem do badania fizjologicznej dynamiki endosomów sygnalizacji i transportu w neuronach.

Zastosowanie protokołu opartego na kolumnie chromatograficznej pozwala na przetwarzanie znacznych objętości pożywki kondycjonowanej komórek HEK293. Na Rysunku 1 przedstawiono wyniki oczyszczania BDNFAvi z 500 mL pożywki kondycjonowanej. Kolejne elucje BDNFAvi z kulek agarozy Ni-NTA dają malejące stężenia BDNFAvi (Rysunek 1A). Po czterech następujących po sobie elucjach (każda trwająca 15 min) odzyskano większość BDNF związanego z kulkami. Stężenia eluatów wahają...

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie i oczyszczenie jajowodu BDNF w zoptymalizowanym protokole obejmującym transfekcję komórek HEK293 i oczyszczanie w kolumnie chromatograficznej. Jajowód BDNF jest następnie monobiotynylowany w reakcji in vitro w celu znakowania a posteriori i wykrywania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej procedury jest to, że umożliwia produkcję, oczyszczanie i monobiotynylację BDNF w zoptymalizowany sposób.Parametry ciąży zostały zoptymalizowane pod kątem maksymalnej produkcji BDNF przy użyciu ekonomicznego odczynnika do transfekcji, a proces oczyszczania odbywa się w konfiguracji chromatograficznej, która ułatwia manipulację i pozwala na eskalację procedury. Zacznij od rozcieńczenia 60 mikrogramów polietyleniminy w 500 mikrolitrach nieuzupełnionego DMEM i 20 mikrogramów plazmidu jajowodu BDNF w 500 mikrolitrach niesuplementowanego DMEM na 15-centymetrową miskę, która ma być transfekowana. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie pipetować roztwór DNA do probówki z polietylenu, mieszając raz ruchem góra/dół.Inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wlać jeden mililitr mieszaniny PEI/DNA do każdej 15-centymetrowej naczynia. Inkubować komórki z mieszaniną PEI/DNA przez trzy godziny, a następnie zmienić pożywkę na bufor inkubacyjny. 48 godzin po transfekcji komórek zbierz pożywkę ze wszystkich szalek.Następnie dodaj składniki pożywki BDNF do supernatantu HEK293, w tym chlorek sodu, składniki buforowane fosforanem, imidazol i inhibitory proteazy. Inkubować w lodzie przez 15 minut. Następnie porcjować pożywkę do probówek wirówkowych.Wirować przez 45 minut w temperaturze 10 000 g w złotej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten etap pozwala na eliminację resztek komórkowych i martwych komórek zawieszonych w pożywce. Następnie zbierz supernatanty.Dodaj BSA w końcowym stężeniu 0,1% i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do dwóch miesięcy. Aby oczyścić BDNF, zacznij od rozmrożenia pożywki w kąpieli termoregulowanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie podzielić pożywkę na porcje do probówek wirówkowych.Wirować przez godzinę w temperaturze 3 500 g w złotej wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten etap pozwala na eliminację pozostałych zanieczyszczeń, aby zapewnić odpowiedni przepływ przez kolumnę chromatograficzną. Następnie użyj koncentratorów białka, aby zmniejszyć pożywkę z 500 mililitrów do 100 mililitrów.Postępuj zgodnie z zalecanymi przez producenta parametrami wirowania, aby uzyskać optymalne stężenie. Następnie dodaj 500 mikrolitrów kulek agarozy niklowo-NTA do zagęszczonej pożywki i inkubuj przez noc w bujaczku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zmontuj aparaturę chromatograficzną i wlej do niej pożywkę.Pozwól mu odpocząć przez pięć minut, a następnie otwórz dwukierunkowy kurek odcinający, aby przepuścić medium. Płukać pięcioma mililitrami buforu do płukania przez pięć minut, upewniając się, że kulki zostały ponownie zawieszone w kolumnie. Powtórz trzy razy.Na koniec dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego do kolumny, upewniając się, że kulki zostały ponownie zawieszone. Inkubować przez 15 minut, a następnie zebrać eluent w probówce do mikrowirówki. Powtórz ten krok trzy razy, aby całkowicie usunąć BDNF.Aby biotynylować BDNF, należy pobrać podwielokrotność zawierającą 800 nanogramów białka i dodać odczynnik buforowy biotynylacji, a następnie trochę BirA-GST w stosunku molowym jeden do jednego do BDNF. Inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 60 minut, mieszając zawartość probówki co 15 minut przez inwersję. Następnie dodać taką samą objętość ATP i BirA-GST jak w pierwszym kroku i inkubować przez 60 minut, mieszając zawartość probówki co 15 minut.Biotynylowany BDNF można następnie pozostawić w lodzie w celu natychmiastowej weryfikacji biotynylacji lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy a posteriori. Aby zweryfikować biotynylację jajowodu BDNF, należy rozpocząć od zablokowania 30 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny na próbkę BDNF w buforze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie wytrącić kulki magnetyczne w magnetycznym separatorze zębatkowym, a następnie wyrzucić bufor blokujący.Dodaj 50 mikrolitrów świeżego buforu blokującego i próbkę BDNF do kulek, upewniając się, że zostały całkowicie ponownie zawieszone. Homogenizować zawartość probówki i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę w rotatorze probówek do mikrowirówek. Przygotować próbkę do western blot zgodnie z opisem w tekście, aby ocenić skuteczność reakcji biotynylacji.Aby sprzęgnąć jajowód BDNF z kropkami kwantowymi, zacznij od dodania niezbędnej objętości kropek kwantowych, aby uzyskać relację molową jeden do jednego z BDNF, a następnie rozcieńcz do końcowej objętości 20 mikrolitrów. Zhomogenizuj zawartość tuby, a następnie zawiń ją w folię aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w bujaku.Następnie rozcieńczyć jajowód BDNF do pożądanego stężenia końcowego i dodać go do przedziału aksonalnego komory mikroprzepływowej, inkubując przez 210 minut w celu obrazowania późniejszych żywych lub utrwalonych komórek. Zastosowanie protokołu opartego na kolumnie chromatograficznej pozwala na przetwarzanie znacznych ilości pożywek kondycjonowanych HEK293. W tym eksperymencie przetworzono 500 mililitrów kondycjonowanych pożywek w celu oczyszczenia jajowodu BDNF.Cztery kolejne eluacje trwające 15 minut każda dały zmniejszenie stężenia jajowodu BDNF w zakresie od sześciu do 28 nanogramów na mikrolitr. Całkowity plon wyniósł około 60 mikrogramów jajowodu BDNF. Ten oczyszczony BDNF został następnie poddany biotynylacji w reakcji in vitro, w której pośredniczył BirA-GST.Próbka była jednorodnie biotynylowana, o czym świadczy brak niebiotynylowanego jajowodu BDNF w supernatancie buforu oczyszczonego z kulek magnetycznych. Wyniki te pokazują, że proponowany protokół pozwala na oczyszczenie znacznych ilości jajowodu BDNF i jednorodną monobiotynylację in vitro. Następnie aktywność biologiczną monobiotynylowanego BDNF oceniono przy użyciu dwóch różnych podejść eksperymentalnych.Najpierw neurony korowe umieszczone na 60-milimetrowych płytkach stymulowano 50 nanogramami na mililitr monobiotynylowanego BDNF przez 30 minut, a następnie przygotowano białka do analizy western blot. Aktywność biologiczną monobiotynylowanego BDNF określono ilościowo, wykrywając fosfo-TrkB i fosfo-ERK. Wiązanie BDNF z TrkB wyzwala autofosforylację receptora i aktywację kilku dalszych kinaz, w tym ERK.Do analizy aktywności biologicznej jajowodu BDNF włączono stan kontroli negatywnej, który nie był stymulowany BDNF, oraz stan kontroli pozytywnej, który był stymulowany dostępnym na rynku BDNF. Oba prążki były fosforylowanymi białkami, miały podobną intensywność w neuronach leczonych komercyjnym BDNF i monobiotynylowanym BDNF i oba wykazywały silniejszy sygnał niż w warunkach kontroli negatywnej. Następnie oceniono aktywność biologiczną monobiotynylowanego BDNF sprzężonego z kropkami kwantowymi streptawidyny, aby wykazać, że można je wykorzystać w eksperymentach obrazowania na żywo.Neurony korowe umieszczono w 10-milimetrowych osłonach i potraktowano końcowym stężeniem 200 pikomolarnych lub dwóch nanomolowych kropek kwantowych BDNF przez 30 minut przed utrwaleniem i barwieniem na fosfo-CREB. CREB jest czynnikiem transkrypcyjnym, który jest celem aktywowanego ERK12 w neuronach korowych. Stymulacja neuronów rosnącym stężeniem kropek kwantowych BDNF spowodowała zależny od dawki wzrost fosforylacji CREB i obecności cząstek kropek kwantowych otaczających jądro, co wskazuje, że cząstki kropek kwantowych BDNF były endocytozowane i wyzwalały aktywację szlaków sygnałowych związanych z aktywacją TrkB za pośrednictwem BDNF.Dwukrotny wzrost sygnału fosfo-CREB wykryto podczas stymulacji neuronów 200 pikomolarnymi kropkami kwantowymi BDNF, podczas gdy stymulacja dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi BDNF spowodowała 3,5-krotny wzrost sygnału fosfo-CREB. Dlatego biotynylowany jajowód BDNF jest biologicznie aktywny i nie traci swojej aktywności w połączeniu z kropkami kwantowymi streptawidyny, dzięki czemu nadaje się do immunofluorescencji i obrazowania żywych komórek. Na koniec oceniono potencjał obrazowania kropek kwantowych BDNF w kulturach podzielonych na przedziały przy użyciu komór mikroprzepływowych.Neurony korowe umieszczono w komorach mikroprzepływowych w celu oddzielenia przedziałów aksonalnych i somatodendrytycznych i stymulowano je dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi BDNF przez 3,5 godziny. Przeprowadzono mikroskopię żywych komórek, a uzyskane kimografy wykorzystano do ilościowego określenia prędkości kropek kwantowych zawierających organelle BDNF. Wykryto średnią prędkość ruchu wynoszącą 0,91 mikrometra na sekundę, co jest zgodne z wcześniejszą analizą transportu za pośrednictwem cytoplazmatycznej tyminy.Komory mikroprzepływowe potraktowane dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi streptawidyny nie wykazywały poruszających się kropek kwantowych w mikrogrupach, jak pokazano na kimografie. Komórki hodowane w tych samych warunkach stymulowano 500 pikomolarnymi lub dwoma nanomolowymi kropkami kwantowymi BDNF przez 210 minut, a następnie utrwalano i znakowano barwnikiem jądrowym. Neurony traktowane kropkami kwantowymi BDNF wykazują zależną od dawki akumulację znakowanego białka we wszystkich analizowanych podprzedziałach, w tym w proksymalnej i dystalnej części mikrogrupy oraz w kompartmencie somatodendrytycznym.W przeciwieństwie do tego, neurony kontrolne nie wykazywały prawie żadnego sygnału kropek kwantowych w całej komorze. W związku z tym kropka kwantowa BDNF może być wykrywana w żywych i nieruchomych komórkach w komorach mikroprzepływowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać monobiotynylowany jajowód BDNF w opłacalnej procedurze opartej na kolumnie chromatograficznej.

an-improved-protocol-to-purify-directly-mono-biotinylate-recombinant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Axonalny transport BDNF, czynnika neurotroficznego, jest krytyczny dla przetrwania i funkcjonowania kilku populacji neuronów. Niektóre zaburzenia zwyrodnieniowe charakteryzują się zaburzeniem struktury i funkcji aksonów.  Zademonstrowaliśmy techniki stosowane do badania żywego transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych przy użyciu neuronów pierwotnych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Tutaj prezentujemy wyrafinowany protokół, który skutecznie ujawnia znakowanie biotynylowanej aminy dekstranu (BDA) metodą barwienia fluorescencyjnego poprzez wzajemną ścieżkę neuronową. Nadaje się do analizy drobnej struktury znakowania BDA i odróżniania jej od innych elementów nerwowych pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Protokół opisuje przygotowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej zawierającymi funkcjonalne białka transbłonowego receptora B kinazy tropomiozyny. Wyjaśniono również zastosowanie kolumn CMAC w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z tymi receptorami i obecnych w złożonych mieszaninach naturalnych.

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

Ten protokół opisuje technikę wysokowydajnej izolacji tubuliny z mózgu świni, zoptymalizowaną pod kątem oprzyrządowania na małą skalę. Procedury izolacji są uzupełnione procedurami oznaczania aktywności polimeryzacji tubuliny in vitro przy użyciu testów kosedymentacyjnych i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Optymalizacja wydajności tubuliny z tkanki mózgowej świni

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj zoptymalizowaną metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanego BDNF z komórek HEK293 z wykorzystaniem chromatografii afinitycznej oraz enzymatycznej monobiotynylacji za pomocą BirA.

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

Przeglądaj więcej filmów