Kalibracja i użycie mikrocewki MRM zademonstrowane na korzeniach pałki Medicago przy 22 tach
16 stycznia 2021
Przedstawiono protokół badania tkanki biologicznej w wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą mikroskopii rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu (MRM) przy użyciu mikrocewek. Znajdują się instrukcje krok po kroku dotyczące charakteryzowania mikrocewek. Na koniec zademonstrowano optymalizację obrazowania na korzeniach roślin.
Protokół ten pozwala na charakteryzację i wykorzystanie mikrocewek do obrazowania rezonansu magnetycznego o ultra wysokim polu. MRI jest unikalnym i nieinwazyjnym narzędziem do badania fizjologii, metabolizmu i właściwości dyfuzyjnych próbki biologicznej. Korzystając z pola magnetycznego o wysokim natężeniu i mikrocewek dostosowanych do interesującej próbki, można uzyskać obrazy o rozdzielczości do komórkowej.
W tej metodzie opisujemy krok po kroku, jak określić charakterystykę komercyjnych lub domowych mikrocewek do zastosowań obrazowych. Używamy próbek biologicznych o średnicy mniejszej niż jeden milimetr i spektrometru NMR z pionowym otworem o ultra wysokim polu. Korzystając z domowych mikrocewek, możemy dostosować rozmiar cewki o częstotliwości radiowej do wielkości próbki.
W tych badaniach używamy małego kawałka korzenia rośliny. Jest to przydatne, ponieważ czułość cewki jest proporcjonalna do zmniejszającej się średnicy cewki. Dzięki temu możemy uzyskać obrazy o wyższym stosunku sygnału do szumu dla małych próbek.
Ze względu na niewielki rozmiar i delikatną naturę tych mikrocewek ważne jest ustalenie kilku podstawowych parametrów, takich jak na przykład długość impulsu 90 stopni i moc impulsu, bezpieczne limity pracy, a na koniec obliczenie czułości cewki w sposób, który można porównać w różnych systemach NMR. Mikrocewka elektromagnesu składa się z drutu nawiniętego wokół kapilary i dwóch kondensatorów: kondensatora strojącego i kondensatora dopasowującego. Kondensator strojeniowy został dobrany tak, aby osiągnąć pożądaną częstotliwość rezonansową 950 megaherców, podczas gdy kondensator dopasowujący został wybrany w celu osiągnięcia maksymalnej transmisji sygnału.
Jest to impedancja 50 Ohm. Większy kondensator jest zmienny, aby umożliwić dokładniejszą regulację. Cewka jest osadzona na płycie podstawy, która jest przymocowana do zmodyfikowanego gniazda.
Opcjonalnie można dodać zbiornik na płyn dopasowujący podatność, aby zmniejszyć wpływ drutu cewki na podatność. Do szkiełka zegarka przenieś jeden mililitr perfluorodekaliny lub PFD, która zostanie użyta do zanurzenia próbki. PFD jest stosowany, ponieważ może wypełniać przestrzenie powietrzne w próbce bez wnikania do komórek biologicznych.
Nie jest również obserwowalny za pomocą protonowego rezonansu magnetycznego. Natychmiast przykryj PFD pokrywką z szalki Petriego, aby zapobiec parowaniu, zanim będzie potrzebne. Przygotowując próbkę referencyjną, należy zamiast tego użyć roztworu siarczanu miedzi.
Następnie ostrożnie wyodrębnij system korzeniowy z jego podłoża wzrostowego. Wytnij niewielką część za pomocą skalpela. W celu obróbki próżniowej próbkę należy umieścić w probówce Eppendorfa zawierającej roztwór utrwalający.
Następnie uszczelnij rurkę żarnikiem i przebij otwory, aby umożliwić wentylację. Poddać próbkę obróbce próżniowej. Z próbki wydostają się pęcherzyki powietrza.
Patrząc przez mikroskop stereoskopowy, użyj pęsety, aby zanurzyć zarówno próbkę, jak i kapilar w przygotowanym wcześniej roztworze. Następnie włóż próbkę do kapilary za pomocą pęsety, gdy zarówno kapilara, jak i próbka są całkowicie zanurzone. Użyj mniejszej kapilary lub końcówki igły strzykawki jako popychacza.
Uformuj bibułę w drobny punkt i użyj jej do usunięcia około jednego milimetra płynu z obu końców kapilary. Rozpuść niewielką objętość wosku kapilarnego za pomocą pisaka do wosku. Nałóż wosk po obu stronach.
Wosk stanie się nieprzezroczysty po zestaleniu. Uważaj, aby wykluczyć pęcherzyki powietrza z kapilary. Następnie zeskrob nadmiar wosku za pomocą skalpela.
Włóż próbkę do mikrocewki za pomocą pęsety, utrzymując mikrocewkę stabilnie. Użyj pręta, aby wyśrodkować próbkę w cewce. Jeśli cewka jest testowana po raz pierwszy, należy użyć próbki referencyjnej siarczanu miedzi do kalibracji mocy i określenia jednorodności SNR i pola B1.
Protokół ten został zademonstrowany na spektrometrze o pionowym otworze 22,3 Tesli, wyposażonym w sondę mikroobrazowania ze zintegrowanymi cewkami gradientowymi, zdolną do uzyskania do trzech Tesli na metr. Przymocuj mikrocewkę do podstawy sondy, trzymając mikrocewkę w pozycji pionowej. Następnie nasuń się na cewkę gradientu w trzech osiach.
Przekręć gwint na podstawie sondy, aby zamocować gradient na miejscu. Włóż sondę do magnesu i wykonaj niezbędne połączenia. Zainicjuj krzywą chybotania i w razie potrzeby dostosuj strojenie i dopasowanie.
Zaleca się rozpoczęcie od dużej szerokości przeciągnięcia spektralnego. Należy pamiętać, że może być obecnych wiele trybów rezonansowych. Testy SNR dla każdego trybu mogą być konieczne w celu określenia prawidłowego trybu rezonansowego.
Wybierz odpowiednią konfigurację cewki dla swojej mikrocewki. W przypadku, gdy bezpieczne limity dla cewek są nieznane, zacznij od 10 mikrosekund przy niskiej mocy impulsu 0,6 wata i powoli zwiększaj długość impulsu o jedną mikrosekundę na raz, aż pojawi się sygnał. Zapisz krzywą nutacyjną dla nowej cewki, aby uzyskać prawidłową długość i moc impulsu dla impulsu 90 stopni.
W tym celu systematycznie zmieniaj czas trwania impulsu, utrzymując jednocześnie stałą moc impulsu. W przypadku niejednorodnego pola B1 impuls 90 stopni można oszacować na podstawie długości, przy których uzyskuje się maksymalne natężenie sygnału. Użyj skali lokalizatora z dużym polem widzenia, aby zlokalizować położenie cewki w magnesie.
Jeśli próbka znajduje się dokładnie w środku systemu gradientu, skanowanie lokalizatora pokaże próbkę. Jeśli cewka lub próbka znajduje się poza środkiem, dostosuj skanowanie lokalizatora. Po znalezieniu przybliżonej mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji, stopniowo zmieniaj moc impulsu dla serii obrazów, aby sprawdzić, czy obraz jest najbardziej jednorodny.
W przypadku niektórych cewek z niejednorodnym polem B1 wyznaczony impuls 90 stopni może być zawyżony, co prowadzi do nadmiernego przechylenia w pożądanym słodkim miejscu cewki. Ręcznie podkładka pod pole magnetyczne na podstawie sygnału FID. W zależności od orientacji mikrozwojów, podkładki o różnej orientacji mogą skutkować silniejszą korektą jednorodności B0.
Następnie należy obliczyć znormalizowany stosunek sygnału do szumu woluminu. Najpierw oblicz objętość woksela, mnożąc rozdzielczość X i Y razy grubość warstwy. Stosunek sygnału do szumu (SNR) oblicza się, odejmując średni szum od średniego sygnału i dzieląc go przez odchylenie standardowe szumu pomnożonego przez głośność wokseli.
Średni sygnał jest pobierany ze środka obrazu, podczas gdy sygnał szumu jest obliczany z łat narożnych. Uruchom sekwencję echa gradientowego, aby sprawdzić, czy nie ma potencjalnych problemów z podatnością spowodowanych drutem cewki i samą próbką. W przypadku cewek zanurzonych różnica w podatności między drutami cewki a ich otoczeniem jest znacznie zmniejszona.
Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości można osiągnąć za pomocą eksperymentów z lampą błyskową 3D. Można wyróżnić kilka cech korzenia, takich jak endoderma, kora i ksylem, które są trudne do rozwiązania przy użyciu większych cewek. Sekwencje wielowarstwowe, multiecho mogą być również stosowane w celu zmniejszenia wpływu podatności.
Odbywa się to jednak kosztem zmniejszonej czułości na jednostkę czasu. Guzki korzeniowe Medicago truncatula mogą być również obrazowane przy użyciu tego protokołu. Rozdzielczość izotropową 31 mikrometrów uzyskano w ciągu czterech minut, natomiast rozdzielczość izotropową 16 mikrometrów uzyskano w ciągu 33 minut.
Pozwala to na szczegółowe zbadanie różnych fizjologicznych aspektów małych guzków korzeniowych. Aby pomyślnie przygotować próbkę, ważne jest, aby całkowicie zanurzyć zarówno próbkę, jak i kapilarnę w cieczy. Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które negatywnie wpływają na jakość obrazu.
Ponieważ obrazowanie MR jest nieniszczące, możemy usunąć próbkę biologiczną po skanowaniu MR i wykorzystać ją do dalszych badań, na przykład za pomocą mikroskopii optycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć podstawową wiedzę na temat charakterystyki i działania mikrocewek w zastosowaniach związanych z obrazowaniem. Można to zastosować do szerokiej gamy próbek biologicznych.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę badania tkanki biologicznej z wysoką rozdzielczością przestrzenną przy użyciu mikroskopii rezonansu magnetycznego (MRM) w ultra-wysokim polu z wykorzystaniem mikrocewek. Badanie koncentruje się na charakterystyce mikrocewek i optymalizacji obrazowania, zastosowanych konkretnie do korzeni roślin, co umożliwia wysokiej jakości obrazowanie małych preparatów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości
- Mikroskopia rezonansu magnetycznego
- Biologia roślin
Wstęp
- MRI jest nieinwazyjnym narzędziem służącym do badania właściwości biologicznych.
- Mikicewki umożliwiają obrazowanie z wyższą czułością w przypadku małych próbek.
- Charakterystyka parametrów cewki jest kluczowa dla efektywnego obrazowania.
Zastosowane metody
- Protokół krok po kroku dotyczący konstrukcji i kalibracji mikrocewek
- Zastosowanie mikrocewek do małych próbek korzeni roślin
- Wykorzystanie spektrometru 22,3 Tesla z pionowym otworem
Główne wyniki
- Pomyślnie uzyskano obrazy w rozdzielczości komórkowej z małych preparatów.
- Scharakteryzowano i zoptymalizowano mikice dla zastosowań obrazowania.
- Przeprowadzono demonstrację skutecznej metody redukcji efektów podatności w obrazowaniu.
Wnioski
- Badanie dostarcza szczegółowych wytycznych dotyczących obrazowania tkanek biologicznych w wysokiej rozdzielczości.
- Metoda ta poprawia jakość obrazowania w badaniach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości submilimetrowych preparatów biologicznych z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu magnetycznego wspomaganej mikrocewką, co wspiera walidację celu poprzez nieniszczące fenotypowanie strukturalne. Zapewnia on ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania, które mogą być wykorzystane do weryfikacji hipotez mechanistycznych we wczesnej fazie odkryć poprzez korelację cech anatomicznych z perturbacjami genetycznymi lub farmakologicznymi. Metoda ta znajduje zastosowanie w preklinicznych systemach modelowych, w których szczegóły na poziomie komórkowym dostarczają informacji o angażowaniu celu i analizie szlaków bez konieczności wykonywania sekcji histologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację struktur komórkowych i podkomórkowych w nienaruszonych preparatach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki powtarzalnemu obrazowaniu morfologii tkanki docelowej bez użycia znaczników.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez zapewnienie integralności próbek i redukcję artefaktów związanych z podatnością magnetyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kalibrację cewki i pomiar SNR w celu zapewnienia spójnej wydajności obrazowania w kolejnych seriach badań.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia ciągłość translacyjną poprzez umożliwienie obrazowania podłużnego tego samego preparatu na etapach odkrywczych i przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając ilościowych biomarkerów strukturalnych powiązanych z wynikami fenotypowymi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego po identyfikację związku wiodącego – gdzie obrazowanie strukturalne o wysokiej rozdzielczości pozwala potwierdzić pewność wyboru celu oraz zredukować ryzyko mechanistyczne przed rozpoczęciem przesiewu związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie wizualizacji zmian anatomicznych w odpowiedzi na modulację genetyczną lub chemiczną.
- Screening: Zwiększa gotowość testów dzięki zestandaryzowanej kalibracji mikrocewek i obliczaniu SNR z normalizacją objętościową, co zapewnia niezawodną detekcję fenotypów strukturalnych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych metryk SNR opartych na wokselach oraz jednorodności pola B1, co umożliwia porównywanie różnych warunków i optymalizację testów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie nieinwazyjnego obrazowania, które pozwala zachować próbki do późniejszej walidacji.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Stanowi reużywalną funkcjonalność platformy do obrazowania różnorodnych małych preparatów biologicznych w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej wizualizacji fenotypów komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym procedurom kalibracji, w tym krzywym nutacji i normalizacji SNR.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie danych strukturalnych, które ograniczają biologiczną utratę projektów na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie fenotypów obrazowych z pewnością walidacji celu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektroskopii NMR, wytwarzania mikrocewek oraz obchodzenia się z próbkami biologicznymi.
- Zależne od dostępu do spektrometrów o ultrawysokim polu (≥20 T) oraz sond do mikroobrazowania z możliwością generowania gradientów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów strojenia, dopasowania oraz wyrównywania podatności magnetycznej między zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych rozmiarów próbek, podatności magnetycznych oraz mediów zatapiających.
- Ograniczone przez delikatność cewek oraz konieczność ostrożnego obchodzenia się z nimi, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza podczas ładowania próbki.
