Name: Kalibracja i użycie mikrocewki MRM zademonstrowane na korzeniach pałki Medicago przy 22 tach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metodę kalibracji i użycia mikrocewek MRM do obrazowania biologicznego z rozdzielczością komórkową. Protokół zastosowano do korzeni roślin na spektrometrze 22,3 T, umożliwiając szczegółowe badanie małych próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty przy instrumencie 950 MHz były wspierane przez uNMR-NL, finansowany przez NWO National Roadmap Large-Scale Facility of the Netherlands (projekt 184.032.207). R.S. był wspierany przez konsorcjum BioSolarCells project U2.3. J.R.K. był wspierany przez Holenderską Szkołę Badań nad Rezonansem Magnetycznym (NMARRS) [022.005.029]. Dziękujemy Defeng Shen i Tonowi Bisselingowi za dostarczenie próbek Medicago truncatula. Ponadto dziękujemy Klaartje Houben, Marie Renault i Johanowi van der Zwanowi za wsparcie techniczne w zakładzie uNMR-NL. Chcielibyśmy również podziękować Volkerowi Lehmannowi, Henny'emu Janssenowi i Pieterowi de Waardowi za pomoc techniczną. Wyrażamy naszą wdzięczność Frankowi Vergeldtowi, Johnowi Philippi i Karthickowi B. Sai Sankarowi Gupcie za ich rady. Na koniec dziękujemy Jessice de Ruiter za udźwiękowienie filmu.

<ol><li>Ciobanu, L., Pennington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micron-scale+MRI+of+single+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Solid+State+Nuclear+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">3D micron-scale MRI of single biological cells.</a> Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).</li>
<li>Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+imaging+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell.</a> Nature. 322, 190-191 (1986).</li>
<li>Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+magnetic+resonance+microscopy+at+single-cell+resolution+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).</li>
<li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Resonance+Microscopy+%28MRM%29+of+Single+Mammalian+Myofibers+and+Myonuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei.</a> Scientific Reports. 7 (1), 39496(2017).</li>
<li>Callaghan, P. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCallaghan%2C+PT+%22Principles+of+nuclear+magnetic+resonance+microscopy%22">Principles of nuclear magnetic resonance microscopy</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1994).</li>
<li>Glover, P., Mansfield, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+to+magnetic+resonance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Limits to magnetic resonance microscopy.</a> Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).</li>
<li>Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+microcoils+for+NMR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance.+Series+B%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of microcoils for NMR microscopy.</a> Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).</li>
<li>Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+subcellular+architecture+of+L7+neurons+of+Aplysia+californica+using+magnetic+resonance+microscopy+%28MRM%29+at+7.8+microns%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns.</a> Scientific Reports. 5, 11147(2015).</li>
<li>Fratila, R. M., Velders, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Volume+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).</li>
<li>Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Support+of+Excised%2C+Living+Brain+Tissues+During+Magnetic+Resonance+Microscopy+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).</li>
<li>Minard, K. R., Wind, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solenoidal+microcoil+design.+Part+I%3A+Optimizing+RF+homogeneity+and+coil+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+in+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions.</a> Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).</li>
<li>Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-field+magnetic+resonance+imaging+using+solenoid+radiofrequency+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils.</a> Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).</li>
<li>Minard, K. R., Wind, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solenoidal+microcoil+design+Part+II%3A+Optimizing+winding+parameters+for+maximum+signal-to-noise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+in+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance.</a> Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+probeheads+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+in+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">NMR probeheads for in vivo applications.</a> Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).</li>
<li>Webb, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+microcoils+for+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).</li>
<li>Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Analysis+of+Microcoils+for+NMR+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).</li>
<li>Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+High-Resolution+Microcoil+1H-NMR+for+Mass-Limited%2C+Nanoliter-Volume+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples.</a> Science. 270 (5244), (1995).</li>
<li>Oerther, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOerther%2C+T+%22Micro+Imaging+Manual+for+AV3+Systems%22">Micro Imaging Manual for AV3 Systems</a>. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).</li>
<li>Callaghan, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+and+Diffusion+Effects+in+NMR+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy.</a> Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).</li>
<li>Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+1H-NMR+imaging+of+water+in+white+button+mushrooms+%28Agaricus+bisporus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus).</a> Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).</li>
<li>Tsai, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+property+modelling+of+perfluorodecalin+and+its+implications+for+environmental+fate+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Aerosol+and+Air+Quality+Research%22%5BJournal%5D)">Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards.</a> Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).</li>
<li>Keifer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((90%C2%B0+pulse+width+calibrations%3A+How+to+read+a+pulse+width+array%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+in+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array.</a> Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).</li>
<li>Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVlaardingerbroek%2C+MT+%22Magnetic+Resonance+Imaging%3A+Theory+and+Practice%22">Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice</a>. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).</li>
<li>Schenck, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+magnetic+susceptibility+in+magnetic+resonance+imaging%3A+MRI+magnetic+compatibility+of+the+first+and+second+kinds%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds.</a> Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).</li>
<li>Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+solenoidal+microcoil+NMR+probe+using+zero-susceptibility+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Concepts+in+Magnetic+Resonance+Part+B%3A+Magnetic+Resonance+Engineering%22%5BJournal%5D)">New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire.</a> Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li>
<li>van Schadewijk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Resonance+Microscopy+at+Cellular+Resolution+and+Localised+Spectroscopy+of+Medicago+truncatula+at+22.3+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla.</a> Scientific Reports. 10 (1), 971(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten najlepiej nadaje się do próbek biologicznych, ponieważ wiele materiałów i próbek geologicznych ma znacznie krótsze czasy relaksacji T2, których nie można zobrazować za pomocą zastosowanych tutaj sekwencji. Nawet niektóre tkanki biologiczne, które wykazują wysoką niejednorodność podatności magnetycznej próbki, mogą być trudne do zobrazowania w ultrawysokim polu, ponieważ efekty są skorelowane z natężeniem pola24. Protokół jest przydatny nie tylko w przypadku nowych cewek, ale może również pomóc w rozwiązywaniu problemów i diagnozowaniu potencjalnych problemów. W przypadku testowania nowych lub nieznanych próbek, protokół ten można wykonać z wyprzedzeniem na roztworze referencyjnym w celu sprawdzenia, czy konfiguracja eksperymentalna działa zgodnie ze specyfikacją. Pomaga to w rozwiązywaniu problemów, ponieważ spektrometr może zostać wykluczony jako źródło artefaktów i usterek. Dodatkowo ustawia to kondensatory strojące i dopasowujące na sondzie na wartości typowe dla mikrocewki.
Gdy w pierwszym eksperymencie nie zostanie zarejestrowany żaden sygnał, pole widzenia skanowania lokalizatora można powiększyć, aby sprawdzić, czy próbka jest widoczna. Następnie sprawdź ponownie, czy cewka jest prawidłowo dostrojona i spróbuj ponownie przeskanować lokalizator. Możliwe, że cewka wykazuje dodatkowe niezamierzone mody rezonansowe, w takim przypadku należy określić właściwy. Jeśli nadal nie można uzyskać obrazu, wyjmij próbkę, aby sprawdzić jej położenie w zespole mikrocewki i sprawdź, czy próbka jest nienaruszona (tj. nie ma pęcherzyków powietrza ani nieszczelności w uszczelkach). Na koniec próbkę można przygotować z użyciem wody zamiast PFD. W przypadku, gdy próbka daje niewielki wykrywalny sygnał w skanowaniu lokalizatora, nadal można wykryć otaczającą wodę w kapilarze.
Ponieważ mikrocewki znajdują się idealnie bardzo blisko próbki, różnice w podatności magnetycznej między powietrzem a drutem mogą powodować dodatkowe straty sygnału, jak pokazano na rysunku 7B. Potencjalne artefakty obejmują błędne mapowanie przestrzenne i anomalne zmiany intensywności sygnału. Szczególnie sekwencje impulsów typu gradient-echo są dotknięte tą niejednorodną utratą sygnału. Z tego powodu zaprezentowaliśmy cewkę dopasowaną do podatności, zanurzając drut w cieczy fluoroobojętnej (Fomblin lub FC-43). Metoda szacowania B1 zawarta w tym protokole może pomóc w ustaleniu, czy różnice w podatności B1 uzasadniają włączenie strategii dopasowania podatności do projektu zespołu cewki. Alternatywnym podejściem do konstruowania cewki dopasowanej do podatności jest użycie drutu25 dopasowanego do podatności. Co więcej, w ramach tego podejścia rozwiązywane są tylko problemy z podatnością ze względu na cewkę. Niedopasowanie podatności wewnątrz próbki (np. spowodowane przestrzeniami powietrznymi) nadal stanowi wyzwanie.
Kieszenie lub pęcherzyki powietrza stanowią wyzwanie eksperymentalne, które powoduje rozległe straty sygnału, spowodowane różnicami podatności na styku powietrza i płynu lub próbki19 (ryc. 5A). Krytycznym aspektem udanego przygotowania próbki jest zanurzenie zarówno próbki, jak i kapilary. Jednak nawet małe pęcherzyki mogą powodować straty sygnału, szczególnie w przypadku sekwencji typu echo gradientowe. Ruchome pęcherzyki powietrza mogą migrować przez kapilarę, dopóki nie zetkną się z próbką. Niektóre z tych efektów można złagodzić, lekko przechylając kapilatę tak, aby jeden koniec był wyższy od drugiego. Przechylanie zapewnia, że potencjalne pęcherzyki powietrza są utrzymywane na miejscu na wyższym końcu, bez naruszania próbki. Ważne jest również, aby sprawdzić, czy wosk kapilarny tworzy dobre uszczelnienie, ponieważ odwodnienie może powodować tworzenie się dużych pęcherzyków powietrza.
W przypadku przestrzeni powietrznych wewnątrz próbki, PFD użyto do wypełnienia międzykomórkowych przestrzeni powietrznych, nie przenikając przez błony komórkowe26. Jednak nawet przy takim podejściu nie byliśmy w stanie usunąć wszystkich przestrzeni powietrznych. Dodatkowo takie podejście oznacza, że potrzebujemy dodatkowego środka, który zwykle nie jest preferowany ze względu na chęć jak najbardziej nieinwazyjnego zbadania systemu.
Cylindryczny kształt naczyń włosowatych oznacza, że układy perfuzyjne powinny być żywotne, szczególnie w przypadku tkanek podatnych na rozpad, takich jak biopsje lub badanie procesów zachodzących w żywym materiale korzeniowym. Dwa kroki mogą zrealizować konfigurację perfuzji. Po pierwsze, podłączenie rurki zasilającej pożywki oraz rurki drenującej po obu stronach kapilary wystarczyłoby do wytworzenia chemostatu. Po drugie, dodanie wgłębienia w kapilarze próbki może utrzymać próbkę w miejscu w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu. Jest to analogiczne do protokołu opublikowanego dla mikrocewek płaskich10.
Nieinwazyjny charakter obrazowania MR w połączeniu z obojętnym płynem stosowanym w tym protokole (PFD lub Fomblin) oznacza, że po zakończeniu eksperymentów próbki mogą być usuwane z naczyń włosowatych w celu dalszych badań. Kombinacje obejmują mikroskopię optyczną lub elektronową oraz inne techniki obrazowania niszczącego. Niedawno zademonstrowaliśmy połączenie z mikroskopią optyczną na guzkach korzeniowych Medicago truncatula 27.
Zademonstrowaliśmy metodę obrazowania materiału roślinnego za pomocą dedykowanych mikrocewek na spektrometrze NMR w ultra wysokim polu. Stosunkowo duże objętości próbek mogą być badane w wysokiej rozdzielczości z dobrą jednorodnością RF. Co więcej, obrazowanie spektroskopowe może być wykonywane w wyższych rozdzielczościach niż jest to możliwe w innym przypadku. Dostosowanie konstrukcji mikrocewki do próbek jest ułatwione dzięki wydajnej metodzie określania charakterystyki działania cewki. Metoda cewki elektromagnetycznej może być również z łatwością zastosowana do próbek innych niż rośliny, w tym tkanek zwierzęcych.

Rezonans magnetyczny to wszechstronne narzędzie do nieinwazyjnego obrazowania szerokiej gamy próbek biologicznych, począwszy od ludzi, a skończywszy na pojedynczych komórkach1,2,3. Podczas gdy skanery MRI do zastosowań w obrazowaniu medycznym zazwyczaj wykorzystują magnesy o natężeniu pola od 1,5 T do 3 T, aplikacje jednokomórkowe są obrazowane przy znacznie wyższym natężeniu pola1,3,4. Badanie próbek w rozdzielczościach poniżej stu mikrometrów określa się mianem mikroskopii rezonansu magnetycznego (MRM)5. Jednak MRM cierpi na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z innymi dostępnymi technikami mikroskopii lub obrazowania (np. mikroskopią optyczną lub tomografią komputerową). Można zastosować kilka podejść do optymalizacji SNR6. Jednym z podejść jest zastosowanie pola magnetycznego o wyższym natężeniu, podczas gdy podejście uzupełniające polega na optymalizacji detektora sygnału dla poszczególnych próbek. W tym drugim przypadku wymiary detektora należy dostosować tak, aby odpowiadały wymiarom próbki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku małych próbek o średnicy ≈0,5-2 mm (np. tkanek korzeniowych) przydatne są mikrocewki, ponieważ SNR jest odwrotnie proporcjonalny do średnicy cewki6,7. Rozdzielczości do 7,8 x 7,8 x 15μm3 zostały osiągnięte na komórkach zwierzęcych za pomocą dedykowanych mikrocewek8. Istnieje wiele typów mikrocewek, przy czym cewki płaskie i elektromagnetyczne są najczęściej używane w zależności od zastosowania i geometrii tkanki9. Cewki planarne mają wysoką czułość blisko ich powierzchni, co jest przydatne do zastosowań na cienkich plasterkach. Na przykład metoda zaprojektowana specjalnie do obrazowania perfundowanej tkanki została opisana dla płaskich mikrocewek10. Jednak cewki planarne charakteryzują się wysokim spadkiem czułości i nie mają dobrze zdefiniowanej mocy impulsu odniesienia. Cewki elektromagnetyczne, będące cylindryczne, mają szerszy obszar zastosowania i są bardziej preferowane w przypadku grubszych próbek. W tym miejscu opisujemy charakterystykę cewki elektromagnetycznej, protokół przygotowania próbek do rezonansu magnetycznego mikrocewki, a także kalibrację mikrocewki elektromagnesu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).
Cewka elektromagnesu składa się z drutu przewodzącego zwiniętego, jak korkociąg, wokół kapilary przytrzymującej próbkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Zespoły mikrocewek mogą być konstruowane wyłącznie przy użyciu emaliowanego drutu miedzianego, asortymentu kondensatorów i odpowiedniej podstawy do komponentów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Głównymi zaletami są prostota i niski koszt w połączeniu z dobrymi parametrami wydajności pod względem SNR na jednostkę objętości i jednorodności pola B1. Łatwość konstrukcji umożliwia szybką iterację projektów i geometrii cewek. Szczegółowe wymagania dotyczące projektowania mikrocewek elektromagnetycznych i charakterystyki sondy (tj. teoria elektroniki, pomiary na stanowisku warsztatowym i pomiary spektrometru dla różnych geometrii cewek) zostały obszernie opisane w innym miejscu7,11,12,13,14.
Cewkę elektromagnetyczną można zbudować, pamiętając o zasadach projektowania dla pożądanych wymiarów zgodnie z wytycznymi opisanymi gdzie indziej15,16. W tym konkretnym przypadku zastosowano cewkę o średnicy wewnętrznej 1,5 mm, wykonaną z emaliowanego drutu miedzianego o średnicy 0,4 mm, zapętlonego wokół kapilary o średnicy zewnętrznej 1,5 mm. Ten elektromagnes jest utrzymywany na płycie podstawy, na której wykonany jest obwód, składający się z kondensatora strojeniowego (2,5 pF), kondensatora o zmiennym dopasowaniu (1,5-6 pF) oraz miedzianych przewodów łączących (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A, 1C). Kondensator strojeniowy dobiera się tak, aby osiągnąć pożądaną częstotliwość rezonansową 950 MHz, natomiast kondensator dopasowujący dobiera się tak, aby osiągnąć maksymalną transmisję sygnału przy impedancji 50 Ohm. Większy kondensator jest zmienny, aby umożliwić dokładniejszą regulację. W normalnej pracy strojenie i dopasowywanie odbywa się za pomocą kondensatorów w podstawie sondy. Zmontowaną mikrocewkę należy zamontować na sondzie, aby można ją było włożyć do magnesu. W zależności od systemu może być wymagany dodatkowy uchwyt. Tutaj używamy kombinacji magnesu 22,3 T z konsolą Bruker Avance III HD w połączeniu z sondą Micro5. W tym przypadku zastosowaliśmy zmodyfikowaną wkładkę wsporczą wyposażoną w niezbędne przyłącza do podłączenia do kanału 1H sondy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
Dopasowany do podatności projekt cewki zawiera zbiornik z perfluorowaną cieczą, aby zmniejszyć niedopasowania podatności, wynikające z tego, że cewka miedziana znajduje się w bliskiej odległości od próbki17. Zbiornik został wykonany z plastikowej strzykawki do zamknięcia cewki i wypełniony fombliną. Ponieważ perfluorowana ciecz musi otaczać cewkę, dostępna średnica próbki jest zmniejszana do średnicy zewnętrznej 1 mm. W celu ułatwienia wymiany próbki przygotowano w kapilarze o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 700 μm. Niezbędne narzędzia do przygotowania próbki są pokazane w Rysunek 2A.
Podstawowe parametry eksperymentalnego MR są w dużym stopniu zależne od sprzętu używanego systemu, w tym systemu gradientu, natężenia pola i konsoli. Do opisania wydajności systemu można użyć kilku parametrów, z których najbardziej praktyczne znaczenie mają długość i moc impulsu 90°, jednorodność B1 i SNR na jednostkę objętości (SNR/mm3). SNR/mm3 jest przydatny do porównywania wydajności różnych cewek w tym samym systemie18. Chociaż mogą istnieć różnice sprzętowe między systemami, jednolite stosowanie protokołu testów porównawczych ułatwia również porównywanie wydajności systemu.
Ten protokół skupia się na kalibracji i przygotowaniu próbki. Przedstawiono stopniową charakterystykę działania mikrocewek elektromagnetycznych: kalibracja długości lub mocy impulsu 90°; ocena jednorodności pola RF; i obliczanie SNR na jednostkę objętości (SNR/mm3). Opisano znormalizowany pomiar echa spinowego za pomocą fantomu, aby ułatwić porównanie konstrukcji cewek, co pozwala na optymalizację różnych zastosowań. Opisano preparaty próbek fantomowych i biologicznych, specyficzne dla mikrozwojów. Protokół ten może być zaimplementowany na dowolnym odpowiednim magnesie pionowym o wąskim otworze (≤60 mm) wyposażonym w dostępny na rynku system mikroobrazowania. W przypadku innych systemów może służyć jako wskazówka i może być używany z pewnymi korektami.
Przygotowanie próbki biologicznej do pomiarów MRI zazwyczaj nie jest zbyt obszerne, ponieważ próbka jest obrazowana w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Jednak przestrzenie powietrzne w tkance biologicznej mogą powodować artefakty obrazu ze względu na różnice w podatności magnetycznej19. Efekt ten nasila się wraz ze wzrostem natężenia pola magnetycznego20. W związku z tym należy unikać przestrzeni powietrznych o dużym natężeniu pola, co może wymagać zanurzenia próbki w płynie, aby uniknąć przepływu powietrza wokół tkanki i usunięcia przestrzeni powietrznych w strukturach tkanki. W szczególności, gdy stosowane są mikrocewki, może być wymagane wycięcie pożądanej tkanki próbki, a następnie zanurzenie jej w odpowiednim płynie. Następnie wprowadza się próbkę do wstępnie wyciętej kapilary, a na koniec uszczelnia kapilarnę woskiem kapilarnym. Użycie wosku jako uszczelniacza zamiast kleju, uszczelniania płomieniowego lub alternatyw oznacza, że próbkę można łatwo usunąć. Ta procedura jest pokazana na korzeniu Medicago truncatula, małej rośliny strączkowej. Zaletą tego protokołu jest możliwość późniejszej jednoczesnej rejestracji danych MRI z mikroskopią optyczną, ponieważ próbka nie jest niszczona podczas pomiaru MRI.
Prezentowany protokół nadaje się do pomiarów in situ o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, a bardziej skomplikowane projekty mogłyby pozwolić na obrazowanie próbek in vivo, gdzie trzeba byłoby rozwiązać problemy związane z systemami podtrzymywania życia.

<table><tbody><tr><td>Przygotowanie roztworu referencyjnego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma-aldrich</td><td>469130</td><td>Krystaliczny proszek do tworzenia roztworu referencyjnego</td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-aldrich</td><td>151882</td><td>Ciecz używana do przygotowania próbki referencyjnej</td></tr><tr><td>Waga</td><td>Skala Sartorius</td><td>PRACTUM513-1S</td><td> do ważenia związków</td></tr><tr><td>Przygotowanie próbki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilara 1000 &mu; m (Średnica zewnętrzna)</td><td>Hilbenberg GmbH</td><td>1408410</td><td>Kapilary na próbki</td></tr><tr><td>Wosk kapilarny</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-328</td><td>Wosk stały używany do uszczelniania próbek</td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy</td><td>Swann-Morton</td><td>nr 11</td><td>Służy do ekstrakcji próbek</td></tr><tr><td>Perfluorodekalina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P9900</td><td>Płyn używany do zanurzania próbki</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>Stołowy mikroskop dwuokularowy</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td></td> <td>Generic-Służy</td> <td>do nakładania PFD i manipulowania próbką</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Vacuubrand</td><td>MZ2C</td><td>Dwustopniowa membranowa pompa próżniowa służąca do usuwania kieszeni powietrznych z próbek.</td></tr><tr><td>Długopis woskowy</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-342</td><td>Ręczny długopis woskowy służący do topienia i nakładania wosku kapilarnego na próbki</td></tr><tr><td>Sprzęt do obrazowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22.3 T Magnet</td><td>Bruker GmbH</td><td>950 US2</td><td>Wąskootworowy magnes nadprzewodzący</td></tr><tr><td>Chłodnica powietrza</td><td>Bruker</td> <td>GmbH-Służy</td> <td>do regulacji temperatury</td></tr> <tr><td>sondyKonsola</td><td>Bruker GmbH</td><td>Avance III HD</td><td>Sterowanie działaniem spektrometru</td></tr><tr><td>Cewki gradientowe Micro5</td><td>Bruker GmbH</td><td>Mic5</td><td>Wyjmowane cewki gradientowe montowane na korpusie sondy</td></tr><tr><td>Micro5 Korpus sondy</td><td>Micro5 Bruker GmbH</td><td>Mic5</td><td>Zawiera mikrocewki i cewki gradientowe Mikrocewka</td></tr><tr><td>RF</td><td>Zbudowany w domu</td> <td>-</td> <td>zawiera Fomblin</td></tr><tr><td>Vector Network Analyzer</td><td>Copper Mountain Technologies</td><td>TR1300/1</td><td>Służy do wykonywania testu odbicia S11, zakres częstotliwości od 300 kHz do 1,3 GHz</td></tr><tr><td>Chłodnica wodna</td><td>Bruker GmbH</td><td>BCU-20</td><td>Chłodzenie wodne w pętli otwartej do odprowadzania ciepła z pracy cewki gradientowej.</td></tr></tbody></table>

kalibracja i użycie mikrocewki mrm zademonstrowane na korzeniach pałki medicago przy 22 tach

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

Ten protokół opisuje metodę kalibracji stosunku sygnału do szumu (SNR) i przygotowania próbki dla mikrocewek solenoidalnych w połączeniu z próbkami biologicznymi, przeznaczoną do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) o wysokiej rozdzielczości, określanego również jako mikroskopia MR (MRM). Może być stosowany w przedklinicznych spektrometrach MRI, demonstrowanych na próbkach korzenia Medicago truncatula. Mikrocewki zwiększają czułość poprzez dopasowanie wielkości rezonatora RF do wielkości próbki będącej przedmiotem zainteresowania, umożliwiając w ten sposób uzyskanie wyższych rozdzielczości obrazu w danym czasie akwizycji danych. Ze względu na stosunkowo prostą konstrukcję, mikrocewki elektromagnetyczne są proste i tanie w budowie oraz można je łatwo dostosować do wymagań próbki. Systematycznie wyjaśniamy, jak kalibrować nowe lub zbudowane w domu mikrocewki przy użyciu rozwiązania referencyjnego. Etapy kalibracji obejmują: określenie mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji; oszacowanie jednorodności pola RF; oraz obliczanie znormalizowanego głośności stosunku sygnału do szumu (SNR) przy użyciu standardowych sekwencji impulsów. Omówiono ważne etapy przygotowania próbek do małych próbek biologicznych, a także możliwe czynniki łagodzące, takie jak różnice w podatności magnetycznej. Zastosowania zoptymalizowanej cewki elektromagnetycznej są demonstrowane przez obrazowanie 3D próbki głównej w wysokiej rozdzielczości (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL).

Charakterystyka cewki 
Po pomyślnym dostrojeniu i dopasowaniu cewki jej wydajność można scharakteryzować za pomocą dobroci cewki Q, impulsu referencyjnego 90° oraz SNR/mm3. Dla zaprezentowanej tutaj cewki solenoidalnej o średnicy wewnętrznej 1,5 mm, dopasowanej pod względem podatności, zmierzona dobroć Q (bez obciążenia) wyniosła 244, w porównaniu do 561 dla cewki typu birdcage o średnicy 5 mm.
Literatura 90&#176; tętno wynosiło 12 &#181;s przy mocy 0,6 W; por. 5 &#181;s przy mocy 45 W dla cewki typu birdcage o średnicy 5 mm (Rycina 4 i Rycina 5). Odpowiada to natężeniu pola impulsu RF (B1), wykorzystując <img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/61266/61266eq4.jpg" /> wynoszącą 0,53 mT dla mikcewki i 1,17 mT dla cewki typu birdcage14 gdzie $\gamma$ jest stosunkiem gyromagnetycznym, a $\tau$ określa czas trwania impulsu. Ponieważ poziomy mocy impulsu (P) różnią się, cewki można porównać pod kątem wydajności nadawania <img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/61266/61266eq5.jpg" />: 0,69 mT/W1/2 oraz 0,18 mT/W1/2 odpowiednio dla mikrocewki i cewki typu birdcage14Porównując za pomocą a 90&#176; impuls, stwierdzono, że mikicewka stanowi czynnik &#8776; czterokrotnie wyższa czułość niż w przypadku cewki klatkowej.
Wpływ dopasowania podatności 
Przy ultrawysokich natężeniach pola magnetycznego podatność próbki i cewki staje się dominującym czynnikiem wpływającym na jakość obrazu, co widać w Rysunek 7A,7BW porównaniu z cewką pozbawioną zbiornika z płynem dopasowującym podatność magnetyczną, sygnał w próbce referencyjnej jest utrzymywany dłużej i bardziej homogenicznie. Jednak ze względu na obecność zbiornika podatności maksymalne wymiary próbki ulegają zmniejszeniu w stosunku do cewki bez zbiornika.
Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości 
W ciągu 20 godzin i 23 minut uzyskano wysoką rozdzielczość 13 x 13 x 13 μm3 próbki korzenia Medicago truncatula (Rycina 8). Począwszy od powierzchni korzenia, widoczna jest kora korzenia wraz z niewielką ilością pozostałej wody na zewnątrz korzenia. Ponadto ksylem widoczny jest jako ciemny pas otaczający floem. Niektóre pęcherzyki powietrza widoczne są jako ciemne plamy z całkowitą utratą sygnału.
Symbiotyczne guzki korzeniowe M. truncatula mogą być również obrazowane przy użyciu tego protokołu (Rysunek 9). Wykorzystując nieco większą cewkę niedopasowaną (długość około 3500 µm, średnica wewnętrzna 1500 μm), uzyskano obrazy o rozdzielczości do 16 x 16 x 16 μm3 w czasie 33 minut.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Mikrocewka solenoidowa. (A) Konstrukcja cewki solenoidowej składa się z drutu nawiniętego helikalnie, zazwyczaj wokół kapilary. Geometria drutu, taka jak jego grubość, średnica, liczba zwojów i odstępy między nimi, wpływa na charakterystykę cewki. (B) Samodzielnie wykonana mikrocewka solenoidowa z zbiornikiem na ciecz dopasowującą podatność (Fomblin). Składa się z powlekanego miedzianego drutu o grubości 0,4 mm, nawiniętego sześć razy wokół kapilary o średnicy zewnętrznej 1500 µm i długości cewki 3500 µm. Cewka jest zanurzona w zbiorniku wykonanym ze strzykawki. Można wstawić kapilary z próbką o średnicy zewnętrznej do 1000 µm. Wykorzystano dwa kondensatory: kondensator 1,5 pF szeregowo z cewką oraz drugi, zmienny kondensator 1,5-6 pF umieszczony równolegle do cewki. Wszystkie elementy są przylutowane do płyty z włókna szklanego (żółta). Jest ona zamocowana na komercyjnym uchwycie (szary polimer), który został zmodyfikowany w celu podparcia zbiornika. &#160;(C) Elementy konstrukcyjne cewki solenoidowej: 1. cewka solenoidowa, 2. kapilara z próbką, 3. kondensator strojący 1,5 pF, 4. zmienny kondensator dopasowujący, 5. baza z włókna szklanego, 6. miedziane wyprowadzenia drutu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Przygotowanie próbki pod stereomikroskopem. (A) Elementy niezbędne do przygotowania mikrocewek. Od lewej do prawej: 1. roztwór wzorcowy CuSO4, 2. perfluorodekalina, 3. mikrocewka, 4. skalpel, 5. pęseta o dodatnim naciągu, 6. pęseta, 7. kapilary o średnicy zewnętrznej = 1000 μm, 8. pisak woskowy, 9. wosk kapilarny, 10. rękawiczki nitrylowe, 11. stereomikroskop, 12. szkło zegarkowe z pokrywką do szalki Petriego, 13. materiał roślinny w podłożu wzrostowym. Nie pokazano: strzykawka 2 mL z igłą ø 0.8 x 40 mm i cienki papier tkankowy. (B) Zbliżenie na wprowadzanie próbki do kapilary za pomocą pęsety, podczas gdy oba elementy pozostają zanurzone. (C) Uszczelnianie kapilary za pomocą roztopionego wosku. (D) Wprowadzanie przygotowanej kapilary do mikrocewki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Elementy sondy do mikroobrazowania. (A) Podstawa sondy Micro5, zawierająca wszystkie niezbędne przyłącza do chłodzenia wodą, grzania, czujników temperatury, zasilania gradientu, RF (widoczne złącze koncentryczne) oraz opcjonalnie identyfikacji sondy (PICS). Pod podstawą sondy znajdują się pokrętła umożliwiające regulację zmiennych kondensatorów strojących i dopasowujących, a także śruby mocujące, które utrzymują sondę na miejscu wewnątrz spektrometru. (B) Własnej konstrukcji uchwyt mikrocewki zamontowany na podstawie sondy. Zwróć uwagę na kondensatory zmienne (biała ceramika) zamontowane na podstawie sondy, które umożliwiają strojenie i dopasowanie. (C) Zintegrowany gradient 3-osiowy zamontowany na podstawie sondy z gniazdami chłodzenia wodnego i pozłacanymi stykami do uziemienia gradientu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Krzywa nutacji. Krzywą nutacji wyznacza się w celu określenia referencyjnej mocy impulsu. Referencyjna moc impulsu (impuls 90°) jest definiowana jako kombinacja mocy i długości impulsu niezbędna do wygenerowania pola B1, które obraca całą dostępną magnetyzację z kierunku z na płaszczyznę poprzeczną. Seria impulsów jest rejestrowana wyłącznie bez kodowania gradientowego. Przy każdym impulsie zwiększana jest albo długość impulsu, albo jego moc. W tym przypadku moc impulsu została ustawiona na 0,6 W, natomiast długość impulsu była zwiększana o 1 µs przy każdej próbie. Maksymalna intensywność sygnału wskazuje impuls 90°, który występuje przy około 12 µs. W ten sam sposób, wykorzystując minimum intensywności, można również wyznaczyć impuls 180°. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Wizualne wyznaczanie mocy impulsu 90°. Po znalezieniu przybliżonej referencyjnej mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji, można ją zweryfikować wizualnie poprzez zmianę długości impulsu. W zależności od cewki, pole B1 może być w różnym stopniu wrażliwe na zmiany. (A) Długość impulsu 11 µs. (B) Długość impulsu 12 µs, optymalna dla tej cewki. (C) Długość impulsu 13 µs. (D) Długość impulsu 20 µs. Jeśli moc impulsu zostanie ustawiona zbyt wysoko, może dojść do tzw. over-tippingu, co zmniejszy intensywność obrazu w centrum cewki (grot strzałki). Zwiększone pole B1 zwiększa również zakres cewki, co można zaobserwować po szerokości obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig6.jpg" /> 
Rysunek 6: Wyznaczenie obszarów zainteresowania. Przedstawiono obszary zainteresowania (ROI) wykorzystane do obliczenia znormalizowanego objętościowo stosunku sygnału do szumu (SNR). Średnia intensywność próbki jest pobierana z ROI znajdującego się w obrębie próbki roztworu referencyjnego. Średni szum oraz odchylenie standardowe są obliczane z jednego lub większej liczby ROI zlokalizowanych w rogach obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig7.jpg" /> 
Rysunek 7: Homogeniczność pola RF oceniona za pomocą obrazowania echem gradientowym. W celu oceny RF stosuje się sekwencję wielokrotnego echa gradientowego (MGE) (B&#173;1&#173; -homogeniczność pola za pomocą serii ech gradientowych. Parametry podstawowe były następujące: czas repetycji 200 ms, czas echa 3,5 ms przy liczbie ech 48, odstęp między echami 3,5 ms, 64 średnie, czas akwizycji 27 min 18 s, kąt odchylenia 30&#176;Pole widzenia wynosiło 5 x 5 mm, macierz 128 x 128, rozdzielczość 39 x 39 x 200 &#181;m. (A) Cewka o dopasowanej podatności. Ciecz dopasowująca podatność (Fomblin) otaczająca cewkę RF redukuje efekty podatności wynikające z obecności drutu cewki. Małe pęcherzyki powietrza powodują utratę sygnału wraz ze wzrostem czasu echa. (B) Cewka (nieodpowiednia pod względem podatności magnetycznej) o tej samej średnicy. Przy dłuższych czasach echa nasilają się artefakty wywołane przez B0 obserwuje się niejednorodność pola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Rycina 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig8.jpg" /> 
Rycina 8: Obrazowanie 3D przekroju korzenia Medicago truncatula. (Góra) Obraz FLASH. Można rozróżnić kilka struktur przekroju korzenia, w tym epidermę (e), korę (c), floem (ph) oraz ksylem (xy). Pęcherzyki powietrza (a) w korzeniu powodują całkowitą utratę sygnału. Parametry podstawowe były następujące: czas repetycji 70 ms, czas echa 2,5 ms, 256 średnich, czas akwizycji 20 h 23 m. Rozdzielczość 13 x 13 x 13 µm3&#173;. Rozmiar macierzy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Pasmo odbiornika 50 kHz. (Dół) Obraz MSME. Parametry podstawowe były następujące: czas repetycji 500 ms, czas echa 5,2 ms, 28 średnich, czas akwizycji 15 h 55 m. Rozdzielczość 13 x 13 x 13 µm3&#173;. Rozmiar macierzy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Pasmo odbiornika 70 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig8large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61266/61266fig9.jpg" /> 
Rysunek 9: Obrazowanie 3D brodawki korzeniowej Medicago truncatula. (Góra) Obraz o niskiej rozdzielczości. Podstawowe parametry były następujące: czas repetycji 60 ms, czas echa 2,3 ms, 4 uśrednienia, czas akwizycji 4 m. Rozdzielczość 31 x 31 x 31 µm3&#173;. Rozmiar macierzy wynosił 64 x 32 x 32, a pole widzenia 2 x 1 x 1 mm. Pasmo odbiorcze 50 kHz. (Dół) Obraz o wysokiej rozdzielczości. Podstawowe parametry były następujące: czas repetycji 60 ms, czas echa 2,3 ms, 8 uśrednień, czas akwizycji 33 m. Rozdzielczość 16 x 16 x 16 µm3&#173;. Rozmiar macierzy wynosił 128 x 64 x 64, a pole widzenia 2 x 1 x 1 mm. Pasmo odbiorcze 50 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61266/61266fig9large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Przedstawiono protokół badania tkanki biologicznej w wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą mikroskopii rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu (MRM) przy użyciu mikrocewek. Znajdują się instrukcje krok po kroku dotyczące charakteryzowania mikrocewek. Na koniec zademonstrowano optymalizację obrazowania na korzeniach roślin.

Kalibracja i użycie mikrocewki MRM zademonstrowane na korzeniach pałki Medicago przy 22 tach

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Protokół ten pozwala na charakteryzację i wykorzystanie mikrocewek do obrazowania rezonansu magnetycznego o ultra wysokim polu. MRI jest unikalnym i nieinwazyjnym narzędziem do badania fizjologii, metabolizmu i właściwości dyfuzyjnych próbki biologicznej. Korzystając z pola magnetycznego o wysokim natężeniu i mikrocewek dostosowanych do interesującej próbki, można uzyskać obrazy o rozdzielczości do komórkowej.W tej metodzie opisujemy krok po kroku, jak określić charakterystykę komercyjnych lub domowych mikrocewek do zastosowań obrazowych. Używamy próbek biologicznych o średnicy mniejszej niż jeden milimetr i spektrometru NMR z pionowym otworem o ultra wysokim polu. Korzystając z domowych mikrocewek, możemy dostosować rozmiar cewki o częstotliwości radiowej do wielkości próbki.W tych badaniach używamy małego kawałka korzenia rośliny. Jest to przydatne, ponieważ czułość cewki jest proporcjonalna do zmniejszającej się średnicy cewki. Dzięki temu możemy uzyskać obrazy o wyższym stosunku sygnału do szumu dla małych próbek.Ze względu na niewielki rozmiar i delikatną naturę tych mikrocewek ważne jest ustalenie kilku podstawowych parametrów, takich jak na przykład długość impulsu 90 stopni i moc impulsu, bezpieczne limity pracy, a na koniec obliczenie czułości cewki w sposób, który można porównać w różnych systemach NMR. Mikrocewka elektromagnesu składa się z drutu nawiniętego wokół kapilary i dwóch kondensatorów: kondensatora strojącego i kondensatora dopasowującego. Kondensator strojeniowy został dobrany tak, aby osiągnąć pożądaną częstotliwość rezonansową 950 megaherców, podczas gdy kondensator dopasowujący został wybrany w celu osiągnięcia maksymalnej transmisji sygnału.Jest to impedancja 50 Ohm. Większy kondensator jest zmienny, aby umożliwić dokładniejszą regulację. Cewka jest osadzona na płycie podstawy, która jest przymocowana do zmodyfikowanego gniazda.Opcjonalnie można dodać zbiornik na płyn dopasowujący podatność, aby zmniejszyć wpływ drutu cewki na podatność. Do szkiełka zegarka przenieś jeden mililitr perfluorodekaliny lub PFD, która zostanie użyta do zanurzenia próbki. PFD jest stosowany, ponieważ może wypełniać przestrzenie powietrzne w próbce bez wnikania do komórek biologicznych.Nie jest również obserwowalny za pomocą protonowego rezonansu magnetycznego. Natychmiast przykryj PFD pokrywką z szalki Petriego, aby zapobiec parowaniu, zanim będzie potrzebne. Przygotowując próbkę referencyjną, należy zamiast tego użyć roztworu siarczanu miedzi.Następnie ostrożnie wyodrębnij system korzeniowy z jego podłoża wzrostowego. Wytnij niewielką część za pomocą skalpela. W celu obróbki próżniowej próbkę należy umieścić w probówce Eppendorfa zawierającej roztwór utrwalający.Następnie uszczelnij rurkę żarnikiem i przebij otwory, aby umożliwić wentylację. Poddać próbkę obróbce próżniowej. Z próbki wydostają się pęcherzyki powietrza.Patrząc przez mikroskop stereoskopowy, użyj pęsety, aby zanurzyć zarówno próbkę, jak i kapilar w przygotowanym wcześniej roztworze. Następnie włóż próbkę do kapilary za pomocą pęsety, gdy zarówno kapilara, jak i próbka są całkowicie zanurzone. Użyj mniejszej kapilary lub końcówki igły strzykawki jako popychacza.Uformuj bibułę w drobny punkt i użyj jej do usunięcia około jednego milimetra płynu z obu końców kapilary. Rozpuść niewielką objętość wosku kapilarnego za pomocą pisaka do wosku. Nałóż wosk po obu stronach.Wosk stanie się nieprzezroczysty po zestaleniu. Uważaj, aby wykluczyć pęcherzyki powietrza z kapilary. Następnie zeskrob nadmiar wosku za pomocą skalpela.Włóż próbkę do mikrocewki za pomocą pęsety, utrzymując mikrocewkę stabilnie. Użyj pręta, aby wyśrodkować próbkę w cewce. Jeśli cewka jest testowana po raz pierwszy, należy użyć próbki referencyjnej siarczanu miedzi do kalibracji mocy i określenia jednorodności SNR i pola B1.Protokół ten został zademonstrowany na spektrometrze o pionowym otworze 22,3 Tesli, wyposażonym w sondę mikroobrazowania ze zintegrowanymi cewkami gradientowymi, zdolną do uzyskania do trzech Tesli na metr. Przymocuj mikrocewkę do podstawy sondy, trzymając mikrocewkę w pozycji pionowej. Następnie nasuń się na cewkę gradientu w trzech osiach.Przekręć gwint na podstawie sondy, aby zamocować gradient na miejscu. Włóż sondę do magnesu i wykonaj niezbędne połączenia. Zainicjuj krzywą chybotania i w razie potrzeby dostosuj strojenie i dopasowanie.Zaleca się rozpoczęcie od dużej szerokości przeciągnięcia spektralnego. Należy pamiętać, że może być obecnych wiele trybów rezonansowych. Testy SNR dla każdego trybu mogą być konieczne w celu określenia prawidłowego trybu rezonansowego.Wybierz odpowiednią konfigurację cewki dla swojej mikrocewki. W przypadku, gdy bezpieczne limity dla cewek są nieznane, zacznij od 10 mikrosekund przy niskiej mocy impulsu 0,6 wata i powoli zwiększaj długość impulsu o jedną mikrosekundę na raz, aż pojawi się sygnał. Zapisz krzywą nutacyjną dla nowej cewki, aby uzyskać prawidłową długość i moc impulsu dla impulsu 90 stopni.W tym celu systematycznie zmieniaj czas trwania impulsu, utrzymując jednocześnie stałą moc impulsu. W przypadku niejednorodnego pola B1 impuls 90 stopni można oszacować na podstawie długości, przy których uzyskuje się maksymalne natężenie sygnału. Użyj skali lokalizatora z dużym polem widzenia, aby zlokalizować położenie cewki w magnesie.Jeśli próbka znajduje się dokładnie w środku systemu gradientu, skanowanie lokalizatora pokaże próbkę. Jeśli cewka lub próbka znajduje się poza środkiem, dostosuj skanowanie lokalizatora. Po znalezieniu przybliżonej mocy impulsu za pomocą krzywej nutacji, stopniowo zmieniaj moc impulsu dla serii obrazów, aby sprawdzić, czy obraz jest najbardziej jednorodny.W przypadku niektórych cewek z niejednorodnym polem B1 wyznaczony impuls 90 stopni może być zawyżony, co prowadzi do nadmiernego przechylenia w pożądanym słodkim miejscu cewki. Ręcznie podkładka pod pole magnetyczne na podstawie sygnału FID. W zależności od orientacji mikrozwojów, podkładki o różnej orientacji mogą skutkować silniejszą korektą jednorodności B0.Następnie należy obliczyć znormalizowany stosunek sygnału do szumu woluminu. Najpierw oblicz objętość woksela, mnożąc rozdzielczość X i Y razy grubość warstwy. Stosunek sygnału do szumu (SNR) oblicza się, odejmując średni szum od średniego sygnału i dzieląc go przez odchylenie standardowe szumu pomnożonego przez głośność wokseli.Średni sygnał jest pobierany ze środka obrazu, podczas gdy sygnał szumu jest obliczany z łat narożnych. Uruchom sekwencję echa gradientowego, aby sprawdzić, czy nie ma potencjalnych problemów z podatnością spowodowanych drutem cewki i samą próbką. W przypadku cewek zanurzonych różnica w podatności między drutami cewki a ich otoczeniem jest znacznie zmniejszona.Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości można osiągnąć za pomocą eksperymentów z lampą błyskową 3D. Można wyróżnić kilka cech korzenia, takich jak endoderma, kora i ksylem, które są trudne do rozwiązania przy użyciu większych cewek. Sekwencje wielowarstwowe, multiecho mogą być również stosowane w celu zmniejszenia wpływu podatności.Odbywa się to jednak kosztem zmniejszonej czułości na jednostkę czasu. Guzki korzeniowe Medicago truncatula mogą być również obrazowane przy użyciu tego protokołu. Rozdzielczość izotropową 31 mikrometrów uzyskano w ciągu czterech minut, natomiast rozdzielczość izotropową 16 mikrometrów uzyskano w ciągu 33 minut.Pozwala to na szczegółowe zbadanie różnych fizjologicznych aspektów małych guzków korzeniowych. Aby pomyślnie przygotować próbkę, ważne jest, aby całkowicie zanurzyć zarówno próbkę, jak i kapilarnę w cieczy. Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które negatywnie wpływają na jakość obrazu.Ponieważ obrazowanie MR jest nieniszczące, możemy usunąć próbkę biologiczną po skanowaniu MR i wykorzystać ją do dalszych badań, na przykład za pomocą mikroskopii optycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć podstawową wiedzę na temat charakterystyki i działania mikrocewek w zastosowaniach związanych z obrazowaniem. Można to zastosować do szerokiej gamy próbek biologicznych.

mrm-microcoil-performance-calibration-usage-demonstrated-on-medicago

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza praca opisuje podstawowe procedury nieinwazyjnego obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS) małych zwierząt in vivo.

Nieinwazyjne in vivo MRI i MRS małych zwierząt: Podstawowe procedury eksperymentalne

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

Prąd stosowany do wewnątrznaczyniowego mikrocewnika z końcówką mikrocewki wykonaną za pomocą litografii tokarki laserowej może osiągać kontrolowane odchylenia pod kontrolą rezonansu magnetycznego (MR), co może poprawić szybkość i skuteczność nawigacji naczyń krwionośnych podczas różnych zabiegów wewnątrznaczyniowych.

Magnetycznie wspomagane, zdalnie sterowane ugięcie końcówki mikrocewnika w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego

Ten artykuł pokazuje oryginalną metodologię opartą na zdalnym uruchamianiu cząstek magnetycznych osadzonych w biofilmie bakteryjnym oraz rozwoju dedykowanych pęset magnetycznych do pomiaru in situ lokalnych właściwości mechanicznych złożonego żywego materiału zbudowanego przez mikroorganizmy na granicy faz.

Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Wzrost roślin Medicago truncatula w symbiozie z bakteriami wiążącymi azot Sinorhizobium meliloti w indywidualnych, sterylnych mikrokosmosach wykonanych ze standardowych płytek laboratoryjnych pozwala na częste badanie systemów korzeniowych i guzków bez uszczerbku dla sterylności. Rośliny można utrzymywać w tych komorach wzrostowych do 9 tygodni.

Jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym Sinorhizobium meliloti

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Ten protokół opisuje metodę testowania hipotezy, że odwrócenie efektywnego pola geomagnetycznego (GMF) indukuje różnicową ekspresję genów i zmienia morfologię Arabidopsis thaliana. Trójosiowy ośmiokątny układ par cewek Helmholtza został wykorzystany do sztucznego generowania odwróconych warunków GMF w komorze wzrostu roślin.

Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

Ten artykuł pokazuje, jak hodować siewki Arabidopsis thaliana w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej, która ogranicza główny korzeń i włośniki do jednej płaszczyzny optycznej. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym drobnej morfologii korzeni, a także do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą innych środków.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Obecny protokół opisuje metodę, dzięki której użytkownicy mogą utrzymać żywotność ostrych preparatów wycinków hipokampa i kory mózgowej podczas zbierania danych z mikroskopii rezonansu magnetycznego.

Wspomaganie metaboliczne wyciętych, żywych tkanek mózgowych podczas akwizycji pod mikroskopią rezonansu magnetycznego

Większość roślin w społecznościach prawdopodobnie jest połączona przez arbuskularne grzyby mikoryzowe (AM), ale mediacja interakcji między roślinami przez nie była badana głównie przez uprawę roślin z mikoryzą i bez niej. Przedstawiamy metodę manipulowania powszechnymi sieciami mikoryzowymi wśród roślin mikoryzowych w celu zbadania ich konsekwencji dla interakcji roślin.

Badanie interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni

Ten artykuł opisuje nowe podejścia do pomiaru i wzmacniania funkcjonalnie specyficznych ścieżek neuronowych za pomocą przezczaszkowej stymulacji magnetycznej. Te zaawansowane nieinwazyjne metodologie stymulacji mózgu mogą zapewnić nowe możliwości zrozumienia relacji między mózgiem a zachowaniem i opracowania nowych terapii w leczeniu zaburzeń mózgu.

Pomiar i manipulowanie funkcjonalnie specyficznymi ścieżkami neuronalnymi w układzie motorycznym człowieka za pomocą przezczaszkowej stymulacji magnetycznej

Poznaj metodę kalibracji i użycia mikrocewek MRM do obrazowania biologicznego z rozdzielczością komórkową. Protokół zastosowano do korzeni roślin na spektrometrze 22,3 T, umożliwiając szczegółowe badanie małych próbek.

Kalibracja i użycie mikrocewki MRM zademonstrowane na korzeniach pałki Medicago przy 22 tach

Przeglądaj więcej filmów