Name: Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę analizy przerzutów do płuc po wstrzyknięciu do żyły ogonowej u myszy. Wykorzystaj cyfrową analizę obrazu do precyzyjnej ilościowej oceny obciążenia nowotworowego w badaniach nad przerzutami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reprezentatywne dane zostały sfinansowane przez National Cancer Institute (K22CA218549 do S.T.S.). Oprócz pomocy w opracowaniu opisanej w niniejszym dokumencie kompleksowej metody analizy, dziękujemy The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (dyrektor – Krista La Perle, DVM, PhD) za usługi histologiczne i immunohistochemiczne oraz Pathology Imaging Core za opracowanie i analizę algorytmów.

Wykorzystanie zwierząt było zgodne z przepisami University Laboratory Animal Resources (ULAR) na mocy zatwierdzonego przez OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokołu 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Iniekcja komórek raka piersi do żyły ogonowej
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek i strzykawki do wstrzyknięcia
	<ol>
		<li>Na płytkę należy umieścić odpowiednią liczbę komórek w zależności od liczby myszy i stężenia komórek, które mają być użyte. 
		UWAGA: Liczba wstrzykniętych komórek i czas do rozwoju przerzutów będą zależeć od użytej linii komórkowej i będą musiały zostać zoptymalizowane. W tej demonstracji 1 x 106 komórek MDA-MB-231 wstrzykuje się dożylnie do NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) myszy, a makroskopowe zmiany w płucach obserwuje się nie później niż 24 dni po wstrzyknięciu. W przypadku linii komórek mysiego guza sutka MVT117, 3 x 106 komórek wstrzykuje się do immunologicznie kompetentnych myszy FVB/N z licznymi przerzutami do płuc obserwowanymi przez 14 dni22,23.</li>
		<li>Zassać pożywkę i przepłukać płytki komórkowe 1x PBS. Trypsynizuj komórki w minimalnej objętości, dodaj odpowiednią objętość pożywki i policz komórki za pomocą hematocytometru lub innej preferowanej metody. Błękit trypanowy (0,4%) lub inne żywe/martwe barwniki komórkowe mogą być używane do określania liczby żywotnych komórek.</li>
		<li>Granulki wirować z prędkością 180 x g przez 5 min.</li>
		<li>Zawiesić odpowiednią liczbę komórek w sterylnym 1x PBS tak, aby wstrzyknąć objętość 100 μl na mysz. Utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie, aby utrzymać żywotność.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy dokładnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 200 μl lub 1 ml, aby uniknąć zbrylania. Pobrać 100 μl do strzykawki insulinowej 28 G (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Usunąć pęcherzyki powietrza, trzymając strzykawkę pionowo, stukając w strzykawkę i powoli regulując tłok. Wstrzyknięcie pęcherzyków powietrza do żyły może spowodować zator powietrzno-gazowy, który może być śmiertelny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja boczna do żyły ogonowej 
	UWAGA: W przypadku eksperymentalnych testów przerzutów raka piersi zastrzyki wykonuje się > 6-tygodniowym samicom myszy.
	<ol>
		<li>Chwyć mysz za ogon i wsuń zwierzę do szczelinowej rury/urządzenia przytrzymującego o odpowiednim rozmiarze (patrz Tabela materiałów dla zastosowanego urządzenia przytrzymującego).</li>
		<li>Włóż część zaślepiającą urządzenia przytrzymującego i ustaw mysz na boku tak, aby jej boczna żyła ogonowa była dobrze widoczna. Mysz ma tętnicę brzuszną w linii z narządami płciowymi, żyłę grzbietową i dwie boczne żyły ogonowe.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię ogona myszy aseptyczną chusteczką. Chwyć ogon między palcem wskazującym a kciukiem ręką niedominującą i lekko napnij go.</li>
		<li>Zaczynając od dystalnej części ogona, włóż igłę równolegle do żyły skośnym końcem do góry.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, ostrożnie nakręć igłę i zegnij pod kątem 20-30°. Zdecydowanie zaleca się stosowanie metody jednoręcznej lub urządzenia do nawijania igłą. 
		UWAGA: Nie jest konieczne zasysanie, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się żyły. Jednak po pierwszym umieszczeniu można zobaczyć mały błysk krwi. Igła płynnie wsunie się do żyły przy prawidłowym umieszczeniu.</li>
		<li>Powoli dozuj całą objętość do żyły. Nie powinno być oporu podczas naciskania tłoka.</li>
		<li>Jeśli wyczuwalny jest jakikolwiek opór, należy natychmiast wyjąć igłę ze strzykawki. W razie potrzeby ponownie włóż igłę (najlepiej nie więcej niż 3 próby), przesuwając się w kierunku bliższego końca ogona lub przeciwległej żyły bocznej.</li>
		<li>Niewielka objętość krwi prawdopodobnie zostanie przemieszczona po wstrzyknięciu. Delikatnie docisnąć sterylną gazą i przetrzeć aseptyczną chusteczką.</li>
		<li>Strzykawkę należy niezwłocznie wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty.</li>
		<li>Umieść mysz z powrotem w czystej, wentylowanej klatce i monitoruj oznaki niepokoju.</li>
		<li>Monitoruj myszy 2-3 razy w tygodniu pod kątem oznak tworzenia się przerzutów (trudności w oddychaniu, zgarbiona postawa, utrata masy ciała) i ogólnego stresu. Czas do rozwoju przerzutów będzie zależał od linii komórkowej i szczepu myszy.</li>
		<li>W przypadku korzystania z urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo, należy zobrazować myszy natychmiast po wstrzyknięciu żyły ogonowej, aby potwierdzić udane wstrzyknięcie komórek i uzyskać dane czasowe "zero" (szczegółowe informacje na temat obrazowania bioluminescencyjnego in vivo nie są zawarte w niniejszym dokumencie, ale są opisane przez Yang et al.24).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalanie tkanki płucnej i analiza obciążenia przerzutowym guzem płuc
<ol>
	<li>Nadmuchiwanie tkanki płucnej w celu utrzymania strukturalnego formatu płuc do histopatologii
	<ol>
		<li>Po wykonaniu zatwierdzonych procedur eutanazji (np. dwutlenek węgla przy 30 - 70% przemieszczeniu objętości komory/min) należy przymocować tuszę myszy do deski sekcyjnej za pomocą szpilek. Spryskaj lub zastosuj 70% etanolu, aby sierść myszy nie przeszkadzała podczas sekcji. 
		UWAGA: Uduszenie dwutlenkiem węgla może powodować krwotok płucny jako oczekiwaną zmianę tła, szczególnie przy wolniejszych prędkościach przepływu.</li>
		<li>Otwórz klatkę piersiową z nacięciem w linii środkowej, przedłuż nacięcie czaszkowo/doogonowo przez otrzewną i odetnij przeponę, chwytając wyrostek ksyloidalny.</li>
		<li>Używając osobnego zestawu nożyczek, aby nie stępić ostrzy, odetnij żebra po obu stronach mostka i ostrożnie usuń klatkę piersiową, pozostawiając miejsce na rozszerzenie płuc.</li>
		<li>Odizoluj tchawicę, usuwając gruczoły ślinowe podżuchwowe i mięśnie podgnykowe. Umieszczenie szpilek po obu stronach tchawicy może zapobiec niepożądanemu ruchowi podczas wprowadzania igły.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę 26 G 2-3 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny i włóż do tchawicy.</li>
		<li>Powoli wstrzyknij formalinę i obserwuj, aż płuca się rozszerzają (zwykle wymaga ~1,5 ml formaliny).</li>
		<li>Gdy formalina zacznie wyciekać z płuc (unikaj nadmiernego napompowania), uszczypnij tchawicę kleszczami, wyjmij igłę strzykawki i odłącz cały aparat oddechowy. Płuca, serce itp. należy umieścić bezpośrednio w formalinie, ponieważ po utrwaleniu można wykonać dodatkowe przycinanie tkanki.</li>
		<li>Kompletne przetwarzanie, zatapianie, cięcie tkanek oraz barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) przy użyciu standardowych metod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obciążenia przerzutowym guzem płuc
	<ol>
		<li>Skanuj wycinki płuc zabarwione H&E za pomocą skanera slajdów o wysokiej rozdzielczości przy 40-krotnym powiększeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Importuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazów (np. Visiopharm Image Analysis) w celu ilościowego określenia przerzutów do płuc. 
		UWAGA: Zalecamy, aby nowi użytkownicy odbyli szkolenie na miejscu lub online w zakresie korzystania z oprogramowania do analizy obrazu. Liczne webinaria są również dostępne za pośrednictwem komercyjnej strony internetowej.</li>
		<li>Wybierz aplikację Visiopharm 10118 H&E do badania przerzutów do płuc z biblioteki aplikacji oprogramowania. 
		UWAGA: Celem tej aplikacji jest oznaczanie i ilościowe określanie przerzutów do płuc na szkiełkach barwionych H&E. W ramach aplikacji 10118 H&E Lung Metastasis pierwszy etap przetwarzania obrazu polega na segmentacji tkanki płucnej za pomocą aplikacji do wykrywania tkanek. Drugi etap przetwarzania obrazu wykorzystuje aplikację Metastasis Detect, która identyfikuje przerzuty wewnątrz tkanki płucnej. Przerzuty są identyfikowane na podstawie kształtu wraz z obszarami, które są albo zbyt zniekształcone, zbyt czerwone, albo zbyt rzadkie, aby można je było zidentyfikować jako przerzuty.</li>
		<li>Dostosuj parametry definiujące kształt i rzadkość, aby jak najlepiej pasowały do reprezentatywnych obrazów. Segmentowane obszary przerzutów nowotworowych i prawidłowej tkanki płucnej mogą być wyświetlane za pomocą różnych kolorowych etykiet dla każdego typu tkanki. 
		UWAGA: W przypadku, gdy aplikacja nie może dokładnie oddzielić przerzutów od normalnej tkanki płucnej, może być konieczne napisanie niestandardowej aplikacji korzystającej z programu Visiopharm Decision Forest, tak jak to miało miejsce w przypadku eksperymentów (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Szczegółowe informacje na temat pisania niestandardowego algorytmu znajdują się poniżej. W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.2.9.</li>
		<li>Otwórz program Decision Forest, który działa poprzez trenowanie wielu klas [tj. tkanki płucnej (nienowotworowej), przerzutów, czerwonych krwinek, nabłonka i/lub białej przestrzeni] na żądanym obrazie. W <silnej klasie="xfig">Rysunek 2, przerzuty nowotworowe są niebieskie, normalna tkanka jest zielona, a nabłonek oskrzelików jest żółty. Również czerwone krwinki są w kolorze czerwonym, a przestrzenie powietrzne w kolorze różowym.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z podpowiedziami zawierającymi serię pytań typu "tak" lub "nie", aby odpowiednio przeszkolić każdą klasę pod kątem obrazu. Dokładność algorytmu określi liczbę pytań tak/nie. Na potrzeby analizy niestandardowy algorytm/aplikacja została napisana z dokładnością ustawioną na 50 (zakres 0-100).</li>
		<li>Dostosuj cechy dla każdej klasy, stosując filtry do wyostrzania, rozmycia, sortowania według kształtu itp., aby zwiększyć dokładność algorytmu/aplikacji. Visiopharm wyświetla każdą klasę przez jedną lub wiele soczewek znanych jako funkcje. Funkcje zmieniają sposób, w jaki klasa widzi obraz, aby wydobyć określone kolory lub intensywności. 
		UWAGA: W przypadku algorytmu niestandardowego przerzuty o wielkości 8500μm2 i większej są oznaczane i mierzone jako przerzuty. Odpowiada to za wariancję wielkości i przerzuty zbyt małe do wykrycia. Małe zniekształcone obszary i małe obszary przerzutowe poniżej 8500 μm2 zostały włączone do prawidłowej oceny ilościowej tkanki.</li>
		<li>Zapisz zmodyfikowane ustawienia z aplikacji lub algorytmu niestandardowego, a następnie zastosuj algorytm/aplikację do całego zestawu lub serii tkanek barwionych metodą H&E.</li>
		<li>Na koniec wyeksportuj wszystkie zmienne wyjściowe, w tym te wymienione w tabeli 1. Pole w mikronach do kwadratu (μm2) można określić ilościowo dla każdego typu tkanki, a wartości procentowe pochodzą z całkowitej powierzchni netto tkanki próbki (tj. całkowitej tkanki minus przestrzeń powietrzna).</li>
		<li>Tworząc niestandardowy algorytm, przejrzyj znaczniki tkanek w porozumieniu z patologiem weterynaryjnym certyfikowanym przez American College of Veterinary Pathologists, aby zapewnić dokładne pomiary i rozróżnić typy tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting metastasis.</a> Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).</li>
<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li>
<li>Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+discovery+and+development+of+therapies+for+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).</li>
<li>Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+metastasis%3A+progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of metastasis: progress and prospects.</a> Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Schoenenberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+c-myc+gene+expression+in+mammary+glands+of+transgenic+mice+induces+mammary+tumours+with+constitutive+milk+protein+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription.</a> EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).</li>
<li>Nusse, R., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+tumors+induced+by+the+mouse+mammary+tumor+virus+contain+a+provirus+integrated+in+the+same+region+of+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome.</a> Cell. 31 (1), 99-109 (1982).</li>
<li>Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+induction+of+mammary+adenocarcinoma+in+transgenic+mice+bearing+the+activated+c-neu+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene.</a> Cell. 54 (1), 105-115 (1988).</li>
<li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li>
<li>Green, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C3%281%29%2FSV40+T-antigen+transgenic+mouse+model+of+mammary+cancer%3A+ductal+epithelial+cell+targeting+with+multistage+progression+to+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma.</a> Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).</li>
<li>Iorns, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse+model+for+the+study+of+human+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis.</a> PloS One. 7 (10), 47995(2012).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+Number+of+Women+Living+with+Metastatic+Breast+Cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+survival+outcomes+in+patients+with+breast+cancer+and+lung+metastasis%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).</li>
<li>Smid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+breast+cancer+show+preferential+site+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse.</a> Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Soni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+subtypes+predispose+the+site+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases.</a> American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).</li>
<li>Leone, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+impact+of+metastatic+pattern+in+stage+IV+breast+cancer+at+initial+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).</li>
<li>Pei, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant-cell+culture+of+primary+mammary+tumors+from+MMTV-c-Myc+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology%3A+Animal%22%5BJournal%5D)">Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).</li>
<li>Mathsyaraja, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF1-ETS2-induced+microRNA+in+myeloid+cells+promote+metastatic+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth.</a> Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>La Perle, K. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Pathologists%3A+Ultimate+Control+Freaks+Seeking+Validation%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation.</a> Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).</li>
<li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+of+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+immune+system+in+cancer%3A+from+tumor+initiation+to+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression.</a> Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).</li>
<li>Borowsky, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+mouse+mammary+carcinoma+cell+lines%3A+two+closely+related+cell+lines+with+divergent+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+mouse+allograft+models+for+development+of+therapies+to+target+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis.</a> Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).</li>
<li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804(2016).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ naukowcy nadal stosują dożylne wstrzyknięcie komórek nowotworowych jako eksperymentalny model przerzutów, brakuje standardowych praktyk do analizy wynikowego obciążenia guzem z przerzutami. W niektórych przypadkach można zaobserwować istotne różnice w obciążeniu guzem przerzutowym po manipulacji poszczególnymi liniami komórkowymi i/lub zastosowaniu związków chemicznych w skali makroskopowej. Jednak w innych przypadkach subtelne różnice w wysiewie i wzroście przerzutów mogą zostać przeoczone lub błędnie zinterpre...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pomimo tego, że jest to bardzo skomplikowany i nieefektywny proces1, przerzuty są znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do zachorowalności i śmiertelności pacjentów z rakiem2. W rzeczywistości większość zgonów związanych z rakiem przypisuje się przerzutowemu rozprzestrzenianiu się choroby3,4. Aby komórki nowotworowe mogły pomyślnie dać przerzuty, muszą oderwać się od miejsca pierwotnego, zaatakować przez sąsiedni zrąb, wprowadzić się do krążenia krwi lub układu limfatycznego, przemieszczać się do łożyska naczynia włosowatego w miejscu wtórnym, wynaczyniać się do tkanki wtórnej i namnażać się lub rosnąć, tworząc zmiany przerzutowe5. Wykorzystanie modeli mysich miało kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za wysiew i wzrost przerzutów6,7. W tym artykule skupimy się na przerzutach raka piersi, w przypadku których często stosuje się zarówno genetycznie zmodyfikowane modele myszy, jak i metody przeszczepu – każda z nich ma swój własny zestaw zalet i ograniczeń.
Genetycznie modyfikowane modele guzów sutka wykorzystują promotory specyficzne dla gruczołów sutkowych, w tym MMTV-LTR (mysi wirus guza sutka długie końcowe powtórzenie) i WAP (kwaśne białko serwatkowe), do kierowania ekspresją transgenów w nabłonku sutka8. Onkogeny, w tym polioma średni antygen T (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 i małpi wirus 40 (SV40) zostały wyrażone w ten sposób9,10,11,12,13i chociaż te modele genetyczne są przydatne do badania inicjacji i progresji pierwotnego nowotworu, niewiele z nich łatwo daje przerzuty do odległych narządów. Co więcej, te genetyczne modele myszy są często bardziej czasochłonne i kosztowne niż spontaniczne lub eksperymentalne modele przerzutów. Biorąc pod uwagę ograniczenia większości genetycznie modyfikowanych modeli guza sutka do badania przerzutów, techniki transplantacji stały się atrakcyjnymi metodami badania tego złożonego procesu. Obejmuje to ortotopowe, dożylne, dosercowe i wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie odpowiednich linii komórkowych.
Chociaż kilka linii komórkowych raka piersi łatwo daje przerzuty po ortotopowym wstrzyknięciu do poduszeczki tłuszczowej sutka14,15, spójność i powtarzalność obciążenia przerzutami może być wyzwaniem, a czas trwania takich badań może być rzędu kilku miesięcy. W szczególności do oceny przerzutów do płuc wstrzyknięcie dożylne do żyły ogonowej jest często bardziej powtarzalną i efektywną czasowo metodą, przy czym przerzuty zwykle występują w ciągu kilku tygodni. Ponieważ jednak model wstrzyknięcia dożylnego omija początkowe etapy kaskady przerzutów, należy zachować ostrożność przy interpretacji wyników tych badań. W tej demonstracji pokazujemy wstrzyknięcie komórek guza sutka do żyły ogonowej wraz z dokładną i kompleksową metodą analizy.
Mimo że społeczność badawcza poczyniła znaczne postępy w zrozumieniu złożonego procesu przerzutów raka piersi, szacuje się, że obecnie ponad 150 000 kobiet ma raka piersi z przerzutami16. Spośród osób z rakiem piersi w IV stadium >36% pacjentów ma przerzuty do płuc17; Jednak specyficzny dla miejsca wzorzec i częstość występowania przerzutów mogą się różnić w zależności od podtypu molekularnego<klasa SUP = "xref" >18,<klasa SUP = "xref">19,< klasa SUP = "xref" >20,< klasa SUP = "XREF">21. Mediana przeżycia pacjentów z rakiem piersi wynosi zaledwie 21 miesięcy, co podkreśla potrzebę zidentyfikowania skutecznych metod leczenia i nowych biomarkerów tej choroby17. Wykorzystanie eksperymentalnych modeli przerzutów, w tym dożylnego wstrzykiwania komórek nowotworowych, będzie nadal pogłębiać naszą wiedzę na temat tego ważnego wyzwania klinicznego. W połączeniu z patologią obrazowania cyfrowego i metodą analizy obciążenia przerzutowym guzem płuc opisaną w tym protokole, iniekcje do żyły ogonowej są cennym narzędziem do badań nad przerzutami raka piersi.

<table><tbody><tr><td>Podkładki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td><mocny>do czyszczenia ogona przed wstrzyknięciem</mocne></td></tr><tr><td>nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>do preparowania myszy i nadmuchiwania tkanki płucnej</td></tr><tr><td>DMEM z L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>baza pożywek do hodowli komórkowych dla linii komórkowych MDA-MB-231 i MVT1</td></tr><tr><td>Roztwór soli buforowany fosforanami Dulbecco 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>stosowany do zawieszania komórek nowotworowych do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>etanol (70% roztwór)</td><td>OSU</td><td></td><td>stosowany w celu zminimalizowania sierści myszy podczas sekcji; Zachowaj ostrożność - łatwopalny</td></tr><tr><td>niebieski barwnik Evan's</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>stosowany w stężeniu 1 % w sterylnym PBS do ćwiczeń z metodą iniekcji do żyły ogonowej; Zachowaj ostrożność - niebezpieczny odczynnik</td></tr><tr><td>Fetal Bull Bydlęca Surowica</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>dodatek do pożywek do hodowli komórkowych; stosowany w 10% w</td></tr><tr><td>kleszczach</td> DMEM <td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>do rozwarstwiania i inflacji tkanki płucnej</td></tr><tr><td>Myszy FVB/NJ</td><td>Syngeniczny szczep myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001800</td> do</tr><tr><td>hemacytometru komórek MVT1 (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>do stosowania w hodowlach komórkowych w celu uzyskania liczby komórek</td></tr>, <tr><td>strzykawka insulinowa (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>do wstrzykiwań do żył ogonowych (BD 329424)</td></tr><tr><td>Komórki MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td></td>, <td>ludzka linia komórkowa raka piersi</td></tr>, <tr><td>komórki MVT1</td><td></td><td></td>, <td>igły do komórek guza sutka</td></tr><tr><td>myszy (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>używane do nadmuchiwania myszy płuca</td></tr><tr><td>neutralna buforowana formalina (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>stosowany jako utrwalacz tkanek i do nadmuchiwania tkanki płucnej; należy zachować ostrożność - niebezpieczny odczynnik</td></tr><tr><td>NOD. Myszy Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>005557</td><td>utrzymywane przez OSUCCC Walidacja celów Wspólny zasób</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>dodatek do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>sterylna gaza</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>do nakładania nacisku na ogon myszy w przypadku wystąpienia krwawienia</td></tr><tr><td>strzykawka (5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>używany do nadmuchiwania tkanki płucnej myszy</td></tr><tr><td>ograniczający żyły ogonowe</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>używany do krępowania myszy do wstrzykiwań do żył ogonowych</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy (0,4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>stosowany w hodowli komórkowej do oceny żywotności</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>stosowany w hodowli komórkowej do oddzielania komórek nowotworowych od płytki</td></tr></tbody></table>

analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Przerzuty, główna przyczyna zachorowalności i śmiertelności większości pacjentów z rakiem, mogą być trudne do modelowania przedklinicznie u myszy. Dostępnych jest niewiele modeli spontanicznych przerzutów. Tak więc eksperymentalny model przerzutów polegający na wstrzyknięciu odpowiednich linii komórkowych do żyły ogonowej jest podstawą badań nad przerzutami. Kiedy komórki rakowe są wstrzykiwane do bocznej żyły ogonowej, płuco jest ich preferowanym miejscem kolonizacji. Potencjalnym ograniczeniem tej techniki jest dokładne określenie ilościowe obciążenia przerzutowym guzem płuca. Podczas gdy niektórzy badacze liczą makroprzerzuty o wcześniej określonej wielkości i/lub obejmują mikroprzerzuty po przekroju tkanki, inni określają obszar zmian przerzutowych w stosunku do normalnego obszaru tkanki. Obie te metody oznaczania ilościowego mogą być niezwykle trudne, gdy obciążenie przerzutami jest wysokie. W tym miejscu demonstrujemy model przerzutów do płuc po wstrzyknięciu dożylnym, a następnie zaawansowaną metodę ilościowego określania obciążenia guzem z przerzutami za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Proces ten pozwala na badanie wielu parametrów punktu końcowego, w tym średniej wielkości przerzutów, całkowitej liczby przerzutów i całkowitego obszaru przerzutów, w celu zapewnienia kompleksowej analizy. Co więcej, metoda ta została sprawdzona przez komisję patologów weterynaryjnych certyfikowaną przez American College of Veterinary Pathologists (SEK) w celu zapewnienia dokładności.

W przypadku użycia nieoznaczeń komórek do wstrzyknięcia do żyły ogonowej, potwierdzenie kolonizacji płuc może być trudne aż do momentu (1) sekcji zwłok, jeśli widoczne są makrometastazy, lub (2) przeprowadzenia analizy histologicznej w przypadku występowania przerzutów mikroskopowych. Przy rozległym obciążeniu płuc guzem przerzutowym u myszy wystąpią trudności w oddychaniu. Jak przy każdym badaniu nad nowotworami, myszy powinny być uważnie monitorowane przez cały czas trwania badania. Użycie komórek znakowanych jest pros...

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Obecnie nie ma złotego standardu do analizy obciążeń przerzutowych guza płuc wywołanych iniekcją żyły ogonowej. Wykorzystaliśmy cyfrową analizę obrazu, aby dokładnie i powtarzalnie określić ilościowo przerzuty do płuc w bardzo skuteczny sposób. Ta metoda jest efektywna czasowo i kosztowo.W połączeniu z cyfrową analizą obrazu umożliwia bardzo dokładną i kompleksową analizę wynikającego obciążenia guzem z przerzutami do płuc. Aby przygotować ludzkie komórki raka piersi do wstrzyknięcia, najpierw należy umieścić odpowiednią liczbę komórek w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowej, w zależności od liczby myszy i stężenia komórek, które mają być użyte. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, umyj płytki PBS i odłącz komórki w minimalnej objętości trypsyny, zgodnie ze standardowymi protokołami.Gdy komórki się odłączą, ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej w celu zliczenia i zebrać komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić komórki w odpowiednim stężeniu w 100 mikrolitrach PBS na mysz na lodzie. Tuż przed wstrzyknięciem dokładnie zawieś komórki na lodzie, aby uniknąć zbrylania się, i załaduj 100 mikrolitrów komórek do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28.Trzymając strzykawkę w pozycji pionowej, postukać w trzonek, jednocześnie powoli regulując tłok, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Jeśli jest to dozwolone, ostrożnie ponownie nakryć igłę i zegnąć końcówkę igły pod kątem od 20 do 30 stopni. Utrzyj samicę myszy w wieku powyżej sześciu tygodni w plastikowym ograniczniku myszy i ustaw mysz na boku tak, aby jej boczna żyła ogonowa była dobrze widoczna.Zlokalizuj tętnicę brzuszną w jednej linii z narządami płciowymi, żyłą grzbietową i dwiema bocznymi żyłami ogonowymi i użyj aseptycznej ściereczki, aby oczyścić powierzchnię ogona. Chwytając ogon między palcem wskazującym a kciukiem ręki niedominującej, lekko napręż i zaczynając od dystalnej części ogona, wbij igłę skośną stroną do góry, równolegle do żyły. Powoli dostarczaj całą objętość komórek do żyły.Niewielka objętość krwi prawdopodobnie zostanie przemieszczona po wstrzyknięciu. Delikatnie uciskać sterylną gazą w miejscu wstrzyknięcia. Następnie wyrzuć strzykawkę do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty i umieść mysz w czystej, wentylowanej klatce z monitorowaniem.W ciągu nie więcej niż jednej godziny od wstrzyknięcia żyły ogonowej należy wykonać obrazowanie in vivo na żywych zwierzętach, aby potwierdzić udane wstrzyknięcie komórki i uzyskać dane dotyczące czasu zero. Aby zachować strukturalny format płuc do histopatologii, przymocuj mysz do deski preparacyjnej i zwilż futro 70% etanolem. Otwórz klatkę piersiową z nacięciem w linii środkowej, przedłużając nacięcie czaszkowo i doogonowo przez otrzewną, a następnie chwyć wyrostek mieczykowaty, aby umożliwić usunięcie przepony.Za pomocą drugiej pary nożyczek przetnij żebra po obu stronach mostka i ostrożnie usuń klatkę piersiową, aby pozostawić miejsce na rozszerzenie płuc. Aby wyizolować tchawicę, usuń gruczoły ślinowe podżuchwowe i mięśnie podgnykowe, a następnie umieść szpilki po obu stronach tchawicy, aby zapobiec niepożądanemu ruchowi podczas wprowadzania igły. Załaduj trzymililitrową strzykawkę, wyposażoną w igłę o rozmiarze 26, z dwoma do trzech mililitrów 10% neutralnego buforowanego formeliny i włóż igłę do tchawicy.Powoli wstrzykiwać formelinę, obserwując, czy płuca się rozszerzają. Gdy formelina zacznie wyciekać z płuc, użyj kleszczy, aby uszczypnąć tchawicę i usunąć igłę. Następnie odłącz cały aparat oddechowy i umieść narządy bezpośrednio w pojemniku ze świeżą formeliną.W celu analizy obciążenia przerzutowym guzem płuc należy zeskanować wybarwione H&E skrawki tkanki płucnej na skanerze slajdów o wysokiej rozdzielczości w 40-krotnym powiększeniu i zaimportować obrazy do odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Dostosuj parametry określające kształt i rzadkość, aby jak najlepiej pasowały do obrazów. Aby wyświetlić segmentowane obszary przerzutów nowotworowych i prawidłowej tkanki płucnej, używając różnych kolorowych etykiet dla każdego typu tkanki, otwórz program Decision Forest i postępuj zgodnie z wyświetlaną serią pytań tak lub nie, aby odpowiednio wytrenować każdą klasę dla obrazu.Aby dostosować funkcje dla każdej klasy, zastosuj filtry w celu wyostrzenia, rozmycia lub sortowania według kształtu, aby zwiększyć dokładność algorytmu. W tej analizie przerzuty guza pojawiają się na niebiesko. Normalna tkanka jest zielona, a nabłonek oskrzelików jest żółty.Czerwone krwinki można zaobserwować na czerwono, a przestrzenie powietrzne pojawiają się na różowo. Po ustawieniu wszystkich cech zapisz zmodyfikowane ustawienia i zastosuj algorytm do całego zestawu lub serii tkanek barwionych metodą H&E. Następnie wyeksportuj wszystkie zmienne wyjściowe, aby umożliwić ilościowe określenie powierzchni w mikronach do kwadratu dla każdego typu tkanki i umożliwić obliczenie procentów od całkowitej powierzchni tkanki netto.Obecność sygnału bioluminescencji w przestrzeni piersiowej w czasie krótszym niż dwie godziny po wstrzyknięciu do żyły ogonowej ludzkich komórek nabłonkowego raka piersi znakowanych lucyferazą można uznać za potwierdzenie dokładnego wstrzyknięcia. W tym eksperymencie liczba fotonów w okolicy klatki piersiowej wzrosła z czasem, a silny sygnał bioluminescencji był nadal obecny w 24 dniu po wstrzyknięciu. W czasie sekcji zwłok u tych myszy zaobserwowano wiele makroskopowych zmian w płucach.Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu i niestandardowego algorytmu, jak pokazano, cała tkanka płucna może być segmentowana według różnych cech tkanki. Segmentując tkankę płucną w ten sposób, oprogramowanie może określić ilościowo różne parametry. Przedstawiono surowe dane z analizy przeprowadzonej na tkance płucnej myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki nabłonkowego raka piersi, a następnie poddano leczeniu lekiem przeznaczonym do blokowania kolonizacji przerzutowej.Jak pokazują te obrazy, różnica w obciążeniu guzem z przerzutami między tymi grupami leczenia mogła być łatwo przeoczona, ponieważ całkowita liczba guzków płuc nie różni się. Kompleksowa analiza wszystkich parametrów wykazała jednak znaczącą różnicę w procentowym obszarze przerzutów netto do płuc, podkreślając potrzebę dokładnego podejścia do analizy obciążenia przerzutowym guzem płuc Prawidłowe ponowne zawieszenie komórek bez pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania zatorowości płucnej, a skuteczna inflacja płuc pomaga utrzymać integralność struktury tkanki w celu uzyskania dokładnej analizy obrazu. Barwienie immunologiczne tkanki płucnej można przeprowadzić w celu określenia obecności komórek lub białek będących przedmiotem zainteresowania w zmianach w płucach lub mikrośrodowisku płuc.

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania oznaczonych komórek rakowych za pomocą iniekcji żyły ogonowej do modelu mysiego. Ponadto monitorujemy powstawanie i wzrost przerzutów raka piersi za pomocą obrazowania żywych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Wstrzyknięcie żyły ogonowej: metoda podawania komórek rakowych do badań przerzutowych w modelu mysim

W tym filmie komórki czerniaka są wstrzykiwane dożylnie przez żyłę ogonową w modelu mysim. Komórki czerniaka przemieszczają się dalej przez układ krążenia, przystosowując się do odległego mikrośrodowiska i powodując przerzuty w narządach, takich jak płuca.

Eksperymentalny mysi model czerniaka z przerzutami: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek czerniaka w płucach

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów.  Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj metodę analizy przerzutów do płuc po wstrzyknięciu do żyły ogonowej u myszy. Wykorzystaj cyfrową analizę obrazu do precyzyjnej ilościowej oceny obciążenia nowotworowego w badaniach nad przerzutami.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Przeglądaj więcej filmów