Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Obecnie nie ma złotego standardu do analizy obciążeń przerzutowych guza płuc wywołanych iniekcją żyły ogonowej. Wykorzystaliśmy cyfrową analizę obrazu, aby dokładnie i powtarzalnie określić ilościowo przerzuty do płuc w bardzo skuteczny sposób. Ta metoda jest efektywna czasowo i kosztowo.

W połączeniu z cyfrową analizą obrazu umożliwia bardzo dokładną i kompleksową analizę wynikającego obciążenia guzem z przerzutami do płuc. Aby przygotować ludzkie komórki raka piersi do wstrzyknięcia, najpierw należy umieścić odpowiednią liczbę komórek w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowej, w zależności od liczby myszy i stężenia komórek, które mają być użyte. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, umyj płytki PBS i odłącz komórki w minimalnej objętości trypsyny, zgodnie ze standardowymi protokołami.

Gdy komórki się odłączą, ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej w celu zliczenia i zebrać komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić komórki w odpowiednim stężeniu w 100 mikrolitrach PBS na mysz na lodzie. Tuż przed wstrzyknięciem dokładnie zawieś komórki na lodzie, aby uniknąć zbrylania się, i załaduj 100 mikrolitrów komórek do strzykawki insulinowej o rozmiarze 28.

Trzymając strzykawkę w pozycji pionowej, postukać w trzonek, jednocześnie powoli regulując tłok, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Jeśli jest to dozwolone, ostrożnie ponownie nakryć igłę i zegnąć końcówkę igły pod kątem od 20 do 30 stopni. Utrzyj samicę myszy w wieku powyżej sześciu tygodni w plastikowym ograniczniku myszy i ustaw mysz na boku tak, aby jej boczna żyła ogonowa była dobrze widoczna.

Zlokalizuj tętnicę brzuszną w jednej linii z narządami płciowymi, żyłą grzbietową i dwiema bocznymi żyłami ogonowymi i użyj aseptycznej ściereczki, aby oczyścić powierzchnię ogona. Chwytając ogon między palcem wskazującym a kciukiem ręki niedominującej, lekko napręż i zaczynając od dystalnej części ogona, wbij igłę skośną stroną do góry, równolegle do żyły. Powoli dostarczaj całą objętość komórek do żyły.

Niewielka objętość krwi prawdopodobnie zostanie przemieszczona po wstrzyknięciu. Delikatnie uciskać sterylną gazą w miejscu wstrzyknięcia. Następnie wyrzuć strzykawkę do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty i umieść mysz w czystej, wentylowanej klatce z monitorowaniem.

W ciągu nie więcej niż jednej godziny od wstrzyknięcia żyły ogonowej należy wykonać obrazowanie in vivo na żywych zwierzętach, aby potwierdzić udane wstrzyknięcie komórki i uzyskać dane dotyczące czasu zero. Aby zachować strukturalny format płuc do histopatologii, przymocuj mysz do deski preparacyjnej i zwilż futro 70% etanolem. Otwórz klatkę piersiową z nacięciem w linii środkowej, przedłużając nacięcie czaszkowo i doogonowo przez otrzewną, a następnie chwyć wyrostek mieczykowaty, aby umożliwić usunięcie przepony.

Za pomocą drugiej pary nożyczek przetnij żebra po obu stronach mostka i ostrożnie usuń klatkę piersiową, aby pozostawić miejsce na rozszerzenie płuc. Aby wyizolować tchawicę, usuń gruczoły ślinowe podżuchwowe i mięśnie podgnykowe, a następnie umieść szpilki po obu stronach tchawicy, aby zapobiec niepożądanemu ruchowi podczas wprowadzania igły. Załaduj trzymililitrową strzykawkę, wyposażoną w igłę o rozmiarze 26, z dwoma do trzech mililitrów 10% neutralnego buforowanego formeliny i włóż igłę do tchawicy.

Powoli wstrzykiwać formelinę, obserwując, czy płuca się rozszerzają. Gdy formelina zacznie wyciekać z płuc, użyj kleszczy, aby uszczypnąć tchawicę i usunąć igłę. Następnie odłącz cały aparat oddechowy i umieść narządy bezpośrednio w pojemniku ze świeżą formeliną.

W celu analizy obciążenia przerzutowym guzem płuc należy zeskanować wybarwione H&E skrawki tkanki płucnej na skanerze slajdów o wysokiej rozdzielczości w 40-krotnym powiększeniu i zaimportować obrazy do odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Dostosuj parametry określające kształt i rzadkość, aby jak najlepiej pasowały do obrazów. Aby wyświetlić segmentowane obszary przerzutów nowotworowych i prawidłowej tkanki płucnej, używając różnych kolorowych etykiet dla każdego typu tkanki, otwórz program Decision Forest i postępuj zgodnie z wyświetlaną serią pytań tak lub nie, aby odpowiednio wytrenować każdą klasę dla obrazu.

Aby dostosować funkcje dla każdej klasy, zastosuj filtry w celu wyostrzenia, rozmycia lub sortowania według kształtu, aby zwiększyć dokładność algorytmu. W tej analizie przerzuty guza pojawiają się na niebiesko. Normalna tkanka jest zielona, a nabłonek oskrzelików jest żółty.

Czerwone krwinki można zaobserwować na czerwono, a przestrzenie powietrzne pojawiają się na różowo. Po ustawieniu wszystkich cech zapisz zmodyfikowane ustawienia i zastosuj algorytm do całego zestawu lub serii tkanek barwionych metodą H&E. Następnie wyeksportuj wszystkie zmienne wyjściowe, aby umożliwić ilościowe określenie powierzchni w mikronach do kwadratu dla każdego typu tkanki i umożliwić obliczenie procentów od całkowitej powierzchni tkanki netto.

Obecność sygnału bioluminescencji w przestrzeni piersiowej w czasie krótszym niż dwie godziny po wstrzyknięciu do żyły ogonowej ludzkich komórek nabłonkowego raka piersi znakowanych lucyferazą można uznać za potwierdzenie dokładnego wstrzyknięcia. W tym eksperymencie liczba fotonów w okolicy klatki piersiowej wzrosła z czasem, a silny sygnał bioluminescencji był nadal obecny w 24 dniu po wstrzyknięciu. W czasie sekcji zwłok u tych myszy zaobserwowano wiele makroskopowych zmian w płucach.

Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu i niestandardowego algorytmu, jak pokazano, cała tkanka płucna może być segmentowana według różnych cech tkanki. Segmentując tkankę płucną w ten sposób, oprogramowanie może określić ilościowo różne parametry. Przedstawiono surowe dane z analizy przeprowadzonej na tkance płucnej myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki nabłonkowego raka piersi, a następnie poddano leczeniu lekiem przeznaczonym do blokowania kolonizacji przerzutowej.

Jak pokazują te obrazy, różnica w obciążeniu guzem z przerzutami między tymi grupami leczenia mogła być łatwo przeoczona, ponieważ całkowita liczba guzków płuc nie różni się. Kompleksowa analiza wszystkich parametrów wykazała jednak znaczącą różnicę w procentowym obszarze przerzutów netto do płuc, podkreślając potrzebę dokładnego podejścia do analizy obciążenia przerzutowym guzem płuc Prawidłowe ponowne zawieszenie komórek bez pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania zatorowości płucnej, a skuteczna inflacja płuc pomaga utrzymać integralność struktury tkanki w celu uzyskania dokładnej analizy obrazu. Barwienie immunologiczne tkanki płucnej można przeprowadzić w celu określenia obecności komórek lub białek będących przedmiotem zainteresowania w zmianach w płucach lub mikrośrodowisku płuc.