Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Ten protokół wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego jest istotny, ponieważ umożliwia precyzyjne wstrzyknięcia, codzienne monitorowanie i dokładny pomiar objętości guza w celu skuteczniejszego badania mechanizmów przerzutów do mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na seryjne monitorowanie wzrostu guza międzyczaszkowego. Procedurę zademonstrują Jonathan Spehar, doktorant naukowy z Sizemore Laboratory, oraz Anna Bratasz, naukowiec zajmujący się obrazowaniem z Ohio State University Small Animal Imaging Shared Resource.

Przed rozpoczęciem procedury przekręć blokadę stage na wiertarce, aby umożliwić włożenie adaptera wiertła i sterylnego wiertła o długości jednego milimetra do wiertła, a następnie ręcznie dokręć blokady wiertła, aby zablokować wiertło. Przymocuj wiertło do ramy stereotaktycznej i ustaw szybkość dostarczania wtryskiwacza cyfrowego na 0,4 mikrolitra na minutę, z celem dwóch mikrolitrów. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, umieść znieczuloną mysz na ramie i użyj końca aplikatora z bawełnianą końcówką, aby ustawić zęby w korycie paska ustnego.

Dociśnij lewą listwę uszną do przyśrodkowej kantu lewego ucha, aby ustabilizować czaszkę i użyj na ramie stereotaktycznej, aby zablokować czaszkę na miejscu. Następnie w ten sam sposób zabezpiecz drugą stronę czaszki prawym paskiem słuchowym. Aby wykonać okno kalwaryjne, oczyść skórę głowy trzema sekwencyjnymi naprzemiennymi roztworami Betadine i peelingami z 70% etanolu i użyj sterylnego skalpela, aby wykonać trzymilimetrowe nacięcie przez skórę wzdłuż centralnej środkowej części czaszki wzdłuż linii szwu strzałkowego.

Zidentyfikuj i zorientuj sterylne wiertło prostopadle do bregmy, upewniając się, że zresetowałeś cyfrową skalę noniusza do zera i przesuń wiertło dwa milimetry w bok do szwu strzałkowego i jeden milimetr do przodu do szwu koronalnego. Odsuń skórę od wiertła i używając najwyższej prędkości i zwracając uwagę na punkty orientacyjne, ostrożnie wywierć otwór o głębokości około 0,5 milimetra przez kalwarię, chłodząc miejsce wiercenia kroplami sterylnej soli fizjologicznej w razie potrzeby. Po wykonaniu okna kalwaryjnego ostrożnie podnieś wiertło i wyjmij wiertło z ramy stereotaktycznej.

W celu wstrzyknięcia komórek rakowych podłącz automatyczny wstrzykiwacz do aparatu stereotaktycznego i załaduj sześć do ośmiu mikrolitrów komórek dokładnie zawieszonych w DPBS do sterylnej strzykawki Hamiltona. Załadować strzykawkę do wstrzykiwacza i dozować niewielką objętość roztworu na jednorazową sterylną serwetkę, aby przygotować igłę do wstrzyknięcia. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby przetrzeć strzykawkę 70% etanolem i wyrównaj końcówkę igły do środka okienka kalwaryjnego, aż prawie dotknie odsłoniętego mózgu.

Zresetuj cyfrową skalę noniusza do zera i powoli włóż igłę na głębokość trzech milimetrów do mózgu. Pozostawić igłę w mózgu na co najmniej 60 sekund przed wybraniem opcji uruchomienia na ekranie wstrzykiwacza, aby rozpocząć podawanie komórek do miejsca wstrzyknięcia. Po dostarczeniu wszystkich komórek pozwól igle spoczywać w mózgu przez co najmniej trzy minuty, aby miąższ mózgu mógł przyzwyczaić się do wstrzyknięcia przed wycofaniem igły z mózgu z prędkością 0,75 milimetra na minutę.

W przypadku rezonansu magnetycznego obciążenia nowotworem, 10 do 20 minut przed obrazowaniem w odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, należy podać myszowi 100 mikrolitrów na 20 gramów masy ciała środków kontrastowych na bazie gadolinu w standardowym wstrzyknięciu dootrzewnowym. Znieczulić mysz po wstrzyknięciu i umieścić znieczuloną mysz na podgrzewanym uchwycie. Umieść uchwyt w magnesie 9,4 T wyposażonym w cewkę powierzchniową mózgu myszy i uzyskaj obraz lokalizatora.

Następnie zobrazuj mózg myszy za pomocą rzadkiej sekwencji ważonej T2 i rzadkiej sekwencji T1 ważonej kontrastem na bazie gadolinu. Aby zmierzyć całkowitą objętość guza, otwórz interesujący Cię plik danych MRI w ImageJ i użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby narysować kontur wokół guza. Następnie otwórz zakładkę analiza i wybierz miarę, aby uzyskać obszar wybranego regionu.

Po ocenie wszystkich wycinków zawierających guz dla pojedynczej myszy w tym konkretnym punkcie czasowym, wyeksportuj wartości do odpowiedniego programu do analizy danych. Tutaj można zaobserwować reprezentatywny przegląd kwantyfikacji objętości guza dla pojedynczej myszy w dniu 7 i dniu 10 po wstrzyknięciu mysich komórek guza sutka. Ocena 30 wycinków na skan wykazała, że w tej analizie, w siódmym dniu po wstrzyknięciu, pięć plasterków wykazywało obciążenie nowotworem.

Podczas gdy w 10 dniu dziewięć plasterków wykazywało obciążenie nowotworem. Obszar guza na każdym obrazie został następnie zmierzony zgodnie z demonstracją, co pozwoliło na śledzenie zmiany objętości guza w czasie. Każda linia komórkowa i każdy model myszy biorcy jest unikalny i dlatego wymaga optymalizacji liczby wstrzykiwanych komórek i harmonogramu MRI, aby zapewnić dokładność obrazowania.

Po tej procedurze mózg może zostać pobrany do zasadniczo każdego dalszego testu, w tym izolacji pojedynczej komórki lub analizy histopatologicznej.