Name: Zastosowanie terapii fagowej w celu przeciwdziałania zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj protokół terapii fagowej przeciwko Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą. Ta metoda umożliwia ocenę skuteczności fagów w zwalczaniu zakażenia bakteryjnego in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Włoską Fundację Mukowiscydozy (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo i FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

Dorosłe rybo pręgowane (Danio rerio) ze szczepu AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) są utrzymywane zgodnie z międzynarodowymi (dyrektywa UE 2010/63/UE) i krajowymi wytycznymi (włoski dekret z 4 marca 2014r., nr 26) w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. W pomieszczeniu dla ryb panują standardowe warunki z cyklem 14 godzin światła/10 godzin ciemności i temperaturą wody w zbiorniku 28°C.
1. Przygotowanie rozwiązań i narzędzi
<ol>
	<li>Przygotować 50 razy roztwór podstawowy i 1 raz roztwór roboczy dla pożywki zarodkowej E3 do hodowli zarodków danio pręgowanego (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Przygotować roztwór blokujący pigmentację, aby zablokować pigmentację zarodka od 24 godzin po zapłodnieniu (24 hpf) (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Przygotować 25x zapas i 1x roboczy roztwór znieczulający Tricane, jak opisano w Tabeli 1. 
	UWAGA: Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu, które mogłoby uszkodzić roztwór podstawowy, należy przygotować porcje 2 ml 25x trikainy i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować ścieżki do mikroiniekcji zarodka, rozpuszczając 1 g agarozy w 100 ml destylowanegoH2Ow kolbie lub butelce nadającej się do kuchenki mikrofalowej. Kuchenka mikrofalowa przez 1-3 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Formy do mikroiniekcji danio pręgowanego (patrz tabela materiałów) umieścić odwrócone do góry nogami na szalce Petriego (90 mm x 15 mm) i przykryć całą powierzchnię, wlewając płynny żel agarozowy o szerokości około 10 mm.</li>
	<li>Usuń pleśń, gdy agaroza zastygnie. Napełnij szalkę Petriego 1x pożywką dla zarodków E3. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez około tydzień. Przed użyciem należy zastąpić świeżą pożywką E3 zawierającą Tricaine. 
	UWAGA: Na starszych pleśniach mogą rozwijać się zanieczyszczenia grzybowe lub bakteryjne.</li>
	<li>Użyj polerowanych ogniowo 10 cm kapilar borokrzemianowych, aby przygotować igły do mikroiniekcji i przymocuj je do ściągacza do mikropipet, dokręcając uchwyty. Ustaw ściągacz z następującymi ustawieniami: ciepło 500, prędkość 100, czas 150, ciąg 150.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum P. aeruginosa (PAO1)
<ol>
	<li>Zaszczepić 1 kolonię szczepu GFP+ P. aeruginosa PAO119 w 5 ml bulionu LB (patrz Tabela 1) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 obr./min).</li>
	<li>Rozcieńczyć powyższą kulturę przez noc do OD600 = 0,1 w 10 ml bulionu LB i wyhodować do OD600 = 0,5 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 obr./min).</li>
	<li>Odwirować 2 ml kultury przez 2 minuty w temperaturze 4 °C przy 16 100 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy do OD600 = 1, co odpowiada około 1 x 109 jtk/ml, w 1 ml roztworu fizjologicznego (patrz tabela 1).</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek do około 5 x 107jtk/ml w roztworze fizjologicznym i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie materiału fagowego
<ol>
	<li>Zaszczepić 1 kolonię szczepu PAO1 P. aeruginosa w 5 ml bulionu LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Rozcieńczyć kulturę przez noc do OD600 = 0,01 w 500 ml bulionu LB i rosnąć w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem do OD600 = 0,05, co odpowiada około 2,5 x 107 jtk/ml.</li>
	<li>Do rozcieńczonej kultury P. aeruginosa dodaj około 1,25 x 107 fagów, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) 10-3. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż OD600 spadnie do około 0,1-0,3 (w ciągu około 3 do 5 godzin, w zależności od użytego faga). 
	UWAGA: Do tego eksperymentu wybrano cztery fagi, które infekują szczep PAO1: dwa Podoviridae, numery dostępu GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 i vB_PaeP_DEV, MF490238 oraz dwa Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 i vB_PaeM_E217, MF490240. Wykonaj poniższe czynności dla każdego faga indywidualnie.</li>
	<li>Inkubować lizat z 1 mg/ml DNazy i RNazy przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Wirować przy 5 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odzyskać supernatant (SN). Przefiltruj SN za pomocą filtra o średnicy porów 0,8 μm.</li>
	<li>Do SN dodać 58 g/l NaCl i 105 g/l PEG6000. Rozpuścić mieszając w temperaturze 20 minut, a następnie przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Odwirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia fagów. Usunąć SN i ostrożnie rozpuścić osad faga w 15 ml buforu TN (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Oczyść fagi za pomocą gradientu gęstości CsCl, jak opisano w poniższych krokach.
	<ol>
		<li>W probówkach ultrawirówek polialomerowych do wirnika SW41 przygotować skokowy gradient gęstości CsCl poprzez stratyfikację 2 ml czterech roztworów CsCl opisanych w Tabeli 1. Dodać 3,5 ml zawiesiny fagowej do każdej z 4 probówek. 
		UWAGA: CsCl jest toksyczny, należy zastosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa, aby się z nim obchodzić i wyrzucać.</li>
		<li>Włóż rurki do wirnika i upewnij się, że rurki są wyważone (różnica masy między dwiema rurami czołowymi musi wynosić ≤ 0,01 g).</li>
		<li>Wirować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C i 100 000 x g (25 000 obr./min dla wirnika SW41). Po odwirowaniu powoli wyjmij probówki i ostrożnie unieruchamiaj je na podporze. Za pomocą strzykawki z igłą 19 G narysuj białą/opalizującą prążek, który zwykle znajduje się między obszarem gęstości d=1,5 a d=1,4.</li>
		<li>Przenieś zawiesiny ze strzykawki do nowych probówek poliallomerowych do wirnika SW60 i użyj roztworu d=1,4 do precyzyjnego zrównoważenia probówek.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C i 150 0000 x g (38 000 obr./min dla wirnika SW60) przez co najmniej 16 godzin.</li>
		<li>Zebrać widoczne pasmo jak powyżej (patrz krok 3.3.3) i przenieść je do probówek dializacyjnych z odcięciem 6 000 Da. Uzyskane widoczne prążki dializować 2x przez 20 minut w 500 ml wody i przez noc w 500 ml buforu TN. Przefiltrować za pomocą filtra porowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie koktajlu fagowego
<ol>
	<li>Stwórz mieszankę czterech fagów, które infekują szczep PAO1, wcześniej wyizolowany i scharakteryzowany8. Przed zmieszaniem oszacuj miano każdego stada fagów za pomocą testu płytki nazębnej20.</li>
	<li>Zebrać koktajl fagowy o ogólnym mianie 5 × 108 pfu/ml, równo mieszając cztery preparaty fagowe w tym samym pfu/ml bezpośrednio przed każdym eksperymentem, aby zapewnić dokładne miana fagów. </li>
</ol>
5. Pobieranie i przygotowanie zarodków danio pręgowanego do mikroiniekcji cftr morpholinos
UWAGA: Zbierz 1-2 zarodki komórkowe od dzikiego typu danio pręgowanego do mikroiniekcji cftr morpholinos (cftr-MOs).
<ol>
	<li>Dwa dni przed eksperymentem z mikroiniekcją bakteryjną ustaw pary hodowlane i zbierz zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem21. Dorosłe rybo pręgowane (Danio rerio) szczepu AB zakupiono w Europejskim Centrum Zasobów Danio Pręgowanego, EZRC.</li>
	<li>Następnego dnia należy pobrać zarodki natychmiast po zapłodnieniu za pomocą plastikowej pipety lub sitka o drobnych oczkach. Umieść pobrane zarodki na szalce Petriego zawierającej pożywkę dla zarodków E3 i ostrożnie usuń resztki plastikową pipetą, aby uniknąć zanieczyszczenia, które mogłoby uszkodzić rozwój zarodka.</li>
	<li>Przygotować 5 μl roztworu do wstrzykiwań morfolino, rozcieńczając dwa roztwory podstawowe morfolino (1 mM) w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 0,25 pmol/zarodek ATG-MO + 0,25 pmol/splice-MO zarodka. Aby prześledzić wstrzyknięcie zarodka, dodaj 0,5 μl czerwieni fenolowej do mieszaniny roztworu do wstrzykiwań morfolino.</li>
	<li>Umieścić na igłę do mikroiniekcji około 5 μl roztworu mieszaniny morfolino za pomocą mikropipety o pojemności 20 μl z końcówką ładującą z drobnym żelem. Przymocuj igłę do mikromanipulatora podłączonego do statywu i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. 
	UWAGA: Nie jest konieczne, aby roztwór dotarł do końcówki igły, ponieważ ciśnienie pompy mikroiniektora będzie ją wypychać.</li>
	<li>Odetnij końcówkę igły, przecinając końcówkę igły drobną sterylną pęsetą. Zmierz średnicę kropli za pomocą skali w oku mikroskopu. Alternatywnie, należy utworzyć kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i ustawić objętość mikroiniekcji, wstrzykując roztwór do kropli oleju, aby ocenić wielkość kropli. Użyj kropli o średnicy 156 μm, aby wstrzyknąć objętość 2 nL.</li>
	<li>Ustaw mikrowtryskiwacz, regulując ciśnienie kompensacji na 15 hPa, czas wtrysku na 0,5 s, a ciśnienie wtrysku w zakresie od 300 do 600 hPa, aby uzyskać prawidłową objętość wtrysku w zależności od użytej igły.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety ułóż zarodki z kroku 5.2 na szklance umieszczonej na szalce Petriego o średnicy 96 mm. 
	UWAGA: Zbyt duża ilość pożywki E3 uniemożliwi prawidłowe wniknięcie igły do mikroiniekcji do kosmówki zarodków.</li>
	<li>Przeniknąć igłą do kosmówki, a następnie do żółtka, aby wstrzyknąć 2 nL do zarodka, jak opisano wcześniej22.</li>
	<li>Umieścić wstrzyknięte zarodki na szalce Petriego z pożywką E3 i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 28 °C, aby mogły rozwijać się do następnego dnia.</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego za pomocą bakterii i koktajlu fagowego
UWAGA: Aby przeprowadzić infekcję ogólnoustrojową, zarodek musi mieć krążenie krwi, które zwykle zaczyna się po 26 hpf.
<ol>
	<li>Po 26 hpf (dla stadiów rozwojowych danio pręgowanego patrz Kimmel21) dekorionate zarodków roztworem pronazy przygotowanym przez rozpuszczenie proszku pronazy w pożywce E3 w stężeniu 2 mg/ml. Delikatnie odpipetuj zarodki, aby przerwać kosmówkę. Wyrzuć pożywkę pronazy/E3 i kilkakrotnie opłucz naczynie świeżym E3, aby usunąć całą pronazę.</li>
	<li>Znieczulić zarodki danio pręgowanego w pożywce E3 zawierającej trikainę na około 5 minut przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Odpipetować znieczulone zarodki do toru przygotowanego w kroku 1. Użyj cienkiej końcówki ładującej żel, aby wyłożyć zarodki w pozycji bocznej.</li>
	<li>Umieścić igłę do mikroiniekcji w ilości około 5 μl preparatu P. aeruginosa zgodnie z opisem w części 5.</li>
	<li>Wbić igłę grzbietowo do punktu początkowego przewodu Cuviera, gdzie zaczyna rozprowadzać się po woreczku żółtkowym. Wstrzyknąć objętość 1-3 nL i upewnić się, że objętość rozszerza się bezpośrednio w kanale i wchodzi do krążenia.</li>
	<li>Mniej więcej po każdych 50 wstrzykniętych zarodkach wstrzyknij kroplę bakterii do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml ze 100 μl sterylnego PBS, aby sprawdzić, czy objętość wstrzykniętego zarodka pozostaje taka sama. Umieścić inokulum na agarze LB (patrz Tabela 1) w temperaturze 37 °C przez noc w celu oceny CFU.</li>
	<li>Przenieść zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami na dwie czyste płytki Petriego ze świeżą pożywką E3 + PTU i inkubować je w temperaturze 28 °C. </li>
	<li>W dwóch wybranych punktach czasowych: 30 minut lub 3 godziny po wstrzyknięciu bakterii, wyjąć z inkubatora jedną z szalek Petriego z zarodkami wstrzykniętymi bakteriami i ustawić je na ścieżce opisanej w ppkt 6.3 w celu wstrzyknięcia koktajlu fagowego.</li>
	<li>Załadować igłę do mikroiniekcji około 5 μl koktajlu fagowego (przygotowanego w kroku 4) za pomocą końcówki ładującej z drobnym żelem i przymocować ją do mikrowstrzykiwacza (patrz krok 5).</li>
	<li>Koktajl fagowy należy wstrzyknąć do przewodu Cuviera z zarodków, którym wcześniej wstrzyknięto bakterie.</li>
	<li>Przenieść zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami na dwie czyste płytki Petriego ze świeżą pożywką E3 + PTU i inkubować je w temperaturze 28 °C.</li>
</ol>
7. Ocena obciążenia bakteryjnego zarodków, którym wstrzyknięto PAO1 i fagi
<ol>
	<li>Przy ciśnieniu 8 hpi pipetować 15 znieczulonych zarodków z szalki Petriego do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zastąp roztwór znieczulający 300 μl 1% Triton X-100 w PBS (PBSTritonX) i homogenizuj zarodki, przepuszczając je co najmniej 15 razy przez strzykawkę insulinową ze sterylną igłą 27-G.</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia homogenatów w sterylnym PBS, przenosząc 100 μl rozcieńczonego homogenatu do 900 μl sterylnego PBS.</li>
	<li>Aby wybrać naturalnie odporny na amp szczep PAO1, należy rozlać 100 μl rozcieńczeń na agarze LB z dodatkiem ampicyliny (100 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia policz liczbę kolonii, pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia, aby określić całkowitą liczbę CFU, i podziel przez liczbę homogenizowanych zarodków, aby uzyskać średnią liczbę CFU/zakażonego zarodka.</li>
</ol>
8. Ocena śmiertelności zarodków, którym wstrzyknięto PAO1 i fagi
<ol>
	<li>Aby ocenić śmiertelność infekcji PAO1, należy ocenić wstrzyknięte zarodki przy 20 hpi pod mikroskopem stereoskopowym i policzyć martwe zarodki (białe/nieprzezroczyste).</li>
	<li>Obliczyć połowę maksymalnej dawki PAO1 o stężeniu śmiertelnym 50 (LD50), która określa śmierć 50% wstrzykniętych zarodków przy 20 hpf.</li>
</ol>
9. Przygotowanie zarodków do stereomikroskopowego obrazowania poklatkowego zakażenia GFP+ PAO1
<ol>
	<li>Przygotować formę do obrazowania żywych zarodków, rozpuszczając 1,5% niskotopliwej agarozy w 100 ml roztworu E3.</li>
	<li>Dodać 1% trikainy (patrz Tabela 1) w celu znieczulenia zarodków.</li>
	<li>Przy 4 hpi przenieść jeden zarodek za pomocą plastikowej pipety do naczynia ze szklanym dnem i dodać ciepły roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia.</li>
	<li>Umieść szklane dno naczynia pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą końcówki ustaw zarodek w pożądanej orientacji. Za pomocą plastikowej pipety ostrożnie dodaj kroplę agarozy na zarodek.</li>
	<li>Pozwól agarozie ostygnąć przez 5-10 minut i delikatnie napełnij szklane naczynie E3 zawierającym roztwór znieczulający, aby zarodek był wilgotny.</li>
	<li>Umieść szklane naczynie z zarodkiem pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym z filtrem fluorescencyjnym (kanał 488 nm) dla bakterii GFP+. Nie należy usuwać szalki Petriego do czasu kolejnych akwizycji o tych samych parametrach przy 9, 14 i 18 hpi.</li>
</ol>
10. Analizy ekspresji cytokin prozapalnych
<ol>
	<li>Przy 20 hpi znieczulić zarodki roztworem tricaine 1x i przenieść je z szalki Petriego do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Pod wyciągiem wyciągowym usunąć roztwór znieczulający i zastąpić go 200 μl odczynnika chlorowodorku guanidu.</li>
	<li>Homogenizować zarodki, pipetując je powtarzalnie najpierw przez pipetę o pojemności 200 μl, a następnie co najmniej 15 razy za pomocą strzykawki insulinowej ze sterylną igłą o pojemności 27 g.</li>
	<li>Ekstrahować całkowite RNA z homogenizowanych zarodków zebry danio pręgowanego za pomocą dostępnych w handlu odczynników chlorowodorku guanidu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Traktować 1 μg każdej próbki RNA 2 μl 1U/μL DNazy I (bez RNaz), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj 1 μg RNA poddanego działaniu DNazy I do reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz tabela materiałów), w całkowitej objętości 20 μl zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję RT qPCR w całkowitej objętości 10 μL zawierającej 1x SYBR Green mastermix, używając 1,5 μl reakcji RT rozcieńczonej w stosunku 1:6. W celu normalizacji należy użyć starterów dla genów porządkowych rpl8, a dla cytokin prozapalnych należy użyć starterów dla TNF-α i IL-1β (patrz Tabela 2). Protokół qPCR był następujący: cykl 1 etap 1: 95 °C, 2 min, powtórzyć raz; cykl 2: krok 1 95 °C, 10 s, etap 2 55 °C, 30 s, powtórzyć 40x; cykl 3: krok 1 72 °C, 15 min.</li>
</ol>

<ol><li>Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment%3A+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+phage+therapy+in+cystic+fibrosis%3A+Essential+human-bacterial-phage+interactions+and+delivery+considerations+for+use+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).</li>
<li>Pacios, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+combat+multidrug-resistant+and+persistent+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases.</a> Antibiotics. 9 (2), 65(2020).</li>
<li>Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplication+of+bacteriophage+in+vivo+and+its+protective+effect+against+an+experimental+infection+with+shigella+dysenteriae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae.</a> Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).</li>
<li>Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+therapeutically+administered+bacteriophages+in+Pseudomonas+aeruginosa+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients.</a> Burns. 32 (5), 644-656 (2006).</li>
<li>Heo, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+efficacy+of+phages+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+mice+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646(2009).</li>
<li>McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+a+mouse+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028(2007).</li>
<li>Forti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+broad-range+bacteriophage+cocktail+that+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+treats+acute+infections+in+two+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573(2018).</li>
<li>Jault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+a+cocktail+of+bacteriophages+to+treat+burn+wounds+infected+by+Pseudomonas+aeruginosa+%28PhagoBurn%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial.</a> Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).</li>
<li>Clatworthy, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+of+zebrafish+involves+both+host+and+pathogen+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants.</a> Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).</li>
<li>Bernut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Protects+against+Mycobacterium+abscessus+Infection+by+Fine-Tuning+Host+Oxidative+Defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses.</a> Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).</li>
<li>Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+phage+therapy+efficacy+in+Burkholderia+cepacia+complex+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388(2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Doring, G., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+innate+immunity%3A+how+chloride+channel+mutations+provoke+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease.</a> Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).</li>
<li>Navis, A., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cftr+function+leads+to+pancreatic+destruction+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish.</a> Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).</li>
<li>Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cftr+controls+lumen+expansion+and+function+of+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 140, 1703-1712 (2013).</li>
<li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979(2015).</li>
<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym manuskrypcie opisaliśmy protokół przeprowadzania infekcji P. aeruginosa (PAO1) w zarodkach danio pręgowanego oraz sposób stosowania terapii fagowej koktajlem fagów wcześniej zidentyfikowanych jako zdolne do zakażenia PAO1 w celu jego rozwiązania. Stosowanie bakteriofagów jako alternatywy dla antybiotykoterapii cieszy się rosnącym zainteresowaniem od kilku lat. Wynika to głównie z rozprzestrzeniania się zakażeń bakteryjnych wielolekoopornych (MDR), które stanowią poważny problem dla zdrowia publicznego. Ocz...

Terapia fagowa, wykorzystanie naturalnych wrogów bakterii do zwalczania infekcji bakteryjnych, cieszy się nowym zainteresowaniem, ponieważ oporność bakterii na antybiotyki staje się powszechna1,2. Terapia ta, stosowana od dziesięcioleci w Europie Wschodniej, może być uważana za leczenie uzupełniające antybiotyki w leczeniu infekcji płuc u pacjentów z mukowiscydozą i możliwą alternatywę terapeutyczną dla pacjentów zakażonych bakteriami, które są oporne na wszystkie obecnie stosowane antybiotyki2,3. Zaletą antybiotykoterapii jest to, że bakteriofagi namnażają się w miejscu zakażenia, podczas gdy antybiotyki są metabolizowane i eliminowane z organizmu4,5. Rzeczywiście, podawanie koktajli zjadliwych fagów wyizolowanych w różnych laboratoriach okazało się skuteczne w leczeniu zakażeń Pseudomonas aeruginosa w modelach zwierzęcych tak różnych, jak owady i ssaki6,7,8. Wykazano również, że terapia fagowa jest w stanie zmniejszyć obciążenie bakteryjne w ranach oparzeniowych zakażonych P. aeruginosa i Escherichia coli w randomizowanym badaniu klinicznym9.
Danio rerio (Danio rerio) stał się ostatnio cennym modelem do badania zakażeń kilkoma patogenami, w tym P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus i Burkolderia cepacia12,13. Poprzez mikrowstrzykiwanie bakterii bezpośrednio do krążenia krwi w zarodku14 łatwo jest ustalić infekcję ogólnoustrojową, której przeciwdziała wrodzony układ odpornościowy danio pręgowanego, który jest ewolucyjnie konserwatywny z neutrofilami i generacją makrofagów podobnymi do ludzkiego odpowiednika. Co więcej, w pierwszym miesiącu życia zarodki danio pręgowanego nie mają adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, co czyni je idealnymi modelami do badania odporności wrodzonej, która jest krytycznym mechanizmem obronnym w infekcjach płuc u ludzi15. Danio pręgowany pojawił się ostatnio jako potężny system modeli genetycznych, aby lepiej zrozumieć początek mukowiscydozy i opracować nowe metody leczenia farmakologicznego10,16,17. Model CF danio pręgowanego wygenerowany przez wstrzyknięcie morfolinu u danio pręgowanego wykazał stłumioną reakcję wyrzutu oddechowego i zmniejszoną migrację neutrofili10 , podczas gdy nokaut cftr prowadzi do upośledzenia pozycji narządów wewnętrznych i zniszczenia zewnątrzwydzielniczej trzustki, fenotypu, który odzwierciedla ludzką chorobę16,17. Największym zainteresowaniem cieszyło się stwierdzenie, że obciążenie bakteriami P. aeruginosa było znacznie wyższe w zarodkach z utratą funkcji cftr niż w grupie kontrolnej po 8 godzinach od zakażenia (hpi), co jest zbieżne z wynikami uzyskanymi na myszach i ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli2,18.
W tej pracy pokazujemy, że terapia fagowa jest skuteczna przeciwko infekcjom P. aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>nazwa zwyczajowa tricaina</td></tr><tr><td>Femtojet Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/brązowy P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Niskotopliwa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Błękit</td> <td>metylowySigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Igły do mikroiniekcji</td><td>Aparat</td><td></td><td></td>Harvarda</tr><tr><td>N-fenylotiomocznik >=98%</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td> genu<td>oligo morpholino</td><td>zaprojektowane przez badacza</td></tr><tr><td></td><td>PEG6000 Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik ACS chlorek sodu, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td></td><td></td> z LP0042B Tryptonu Oxoid LP0021B <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Z-MOLDS Mikroiniekcja Słowo <td></td></tr><tr><td></td><td> Instrumenty</td><td></td><td></td> precyzyjne</tr></tbody></table>

zastosowanie terapii fagowej w celu przeciwdziałania zakażeniu pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, główna konsekwencja niepewności diagnostycznej i nadmiernego przepisywania środków przeciwdrobnoustrojowych, jest coraz częściej rozpoznawaną przyczyną poważnych infekcji, powikłań i śmiertelności na całym świecie, co ma ogromny wpływ na nasze społeczeństwo i system opieki zdrowotnej. W szczególności pacjenci z osłabionym układem odpornościowym lub istniejącymi wcześniej i przewlekłymi patologiami, takimi jak mukowiscydoza (CF), są poddawani częstym antybiotykoterapii w celu kontrolowania zakażeń związanych z pojawianiem się i dyfuzją izolatów wielolekoopornych. Dlatego istnieje pilna potrzeba zajęcia się alternatywnymi terapiami w celu przeciwdziałania infekcjom bakteryjnym. Możliwym rozwiązaniem może być zastosowanie bakteriofagów, naturalnych wrogów bakterii. Protokół szczegółowo opisany w tej pracy opisuje zastosowanie terapii fagowej przeciwko zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą. Zarodki danio pręgowanego zostały zakażone P. aeruginosa, aby wykazać, że terapia fagowa jest skuteczna w przypadku zakażeń P. aeruginosa, ponieważ zmniejsza śmiertelność, obciążenie bakteryjne i prozapalną odpowiedź immunologiczną w zarodkach mukowiscydozy.

Wyniki i rysunki przedstawione w niniejszym opracowaniu odnoszą się do embrionów CF uzyskanych poprzez wstrzyknięcie morfolinów cftr, zgodnie z opisem wcześniejszym10 oraz w kroku 5. Aby potwierdzić fenotyp CF, wzięto pod uwagę zaburzone położenie narządów wewnętrznych, takich jak serce, wątroba i trzustka, zgodnie z wcześniejszym opisem17 (Rysunek 1). Podobne wyniki uzyskano w przypadku embrionów WT, co zostało opisane w naszej poprze...

Prezentowany tutaj jest protokół do zastosowania infekcji Pseudomonas aeruginosa i terapii fagowej w zarodkach danio pręgowanego chorego na mukowiscydozę (CF).

Zastosowanie terapii fagowej w celu przeciwdziałania zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Protokół ten ułatwia przygotowanie i podanie koktajlu wirusowego i fagowego przeciwko Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę in vivo skuteczności faga w przeciwdziałaniu infekcji bakteryjnej. Koktajl fagowy jest skuteczny zarówno w modelach danio pręgowanego typu dzikiego, jak i mukowiscydozy.Otwarcie możliwości zastosowania terapii fagowej w zakażeniach bakteryjnych u pacjentów z mukowiscydozą. Terapia fagowa może być również stosowana do przeciwdziałania specyficznym infekcjom bakteryjnym w innych systemach modelowych. Przygotowanie materiału fagowego do eksperymentu.Dodaj 1,25 razy 10 do siódmych fagów do OD 600 0,05 kultury P.aeruginosa do wielokrotności infekcji jeden razy 10 do ujemnych trzech i inkubować kulturę przez trzy do czterech godzin z wytrząsaniem, aż OD 600 spadnie do 0,1 do 0,3. Pod koniec inkubacji inkubować lizat z jednym mikrogramem na mililitr DNAzy i RNAzy przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. I granulować komórki przez odwirowanie.Pod koniec wirowania przefiltrować supernatant przez pory o średnicy 0,8 mikrometra i dodać 58 gramów na litr chlorku sodu i 105 gramów na litr PEG 6000. Inkubuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka wytrącić faga przez odwirowanie.Pod koniec centrofugacji usunąć supernatant i ostrożnie rozpuścić osad faga w 15 mililitrach buforu chlorku sodu Tris. Aby oczyścić fagi za pomocą gradientu gęstości chlorku cezu, najpierw rozwarstwić dwa mililitry czterech różnych roztworów chlorku cezu w probówkach ultrawirówek polialomerowych do wirnika SW 41 i dodać 3,5 mililitra zawiesiny fagowej do każdej probówki. Chlorek cezu jest toksyczny.Zawsze stosuj odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z tym związkiem i wyrzucania. Po załadowaniu wszystkich rurek umieść je w wirniku, uważając, aby rurki były wyważone. I odwirowywać próbki przez dwie godziny w temperaturze 100 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza.Pod koniec wirowania użyj strzykawki z igłą o rozmiarze 19, aby zassać białą warstwę między obszarami o gęstości D równej 1,5, a D równą 1,4. I przenieś zawiesiny do nowych rur polialomerowych w rozmiarze SW 60. Odwirowywać zawiesiny przez co najmniej 16 godzin w temperaturze 150 000 g i czterech stopniach Celsjusza.I przenieś widoczne pasma do probówek dializacyjnych z odcięciem 6 000 daltonów. Następnie pobrane próbki należy dializować dwa razy w 500 mililitrach wody przez 20 minut na dializę i przez noc w 500 mililitrach buforu chlorku sodu Tris. Następnego ranka przefiltruj powstały materiał fagowy za pomocą filtra porowego o średnicy 0,22 mikrometra i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W dniu mikroiniekcji rozcieńczyć dwa jednomikromolowe roztwory podstawowe morpholinos w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 0,25 picomolar na zarodek, aby otrzymać pięciomikrolitrowy roztwór do wstrzykiwań morpholino. I dodaj 0,5 mikrolitra czerwieni fenolowej do każdego roztworu. Następnie użyj mikropipety o pojemności 20 mikrolitrów z końcówką ładującą z drobnym żelem, aby załadować igłę do mikroiniekcji z całą objętością zmieszanego roztworu morpholino i przymocuj igłę do mikromanipulatora podłączonego do statywu pod mikroskopem stereoskopowym.Następnie, za pomocą jednej lub dwóch komórek, zarodki zebry zebrane ułożone na szklanym szkiełku umieszczonym na szalce Petriego o średnicy 96 milimetrów, penetrują kosmówkę i żółtko za pomocą końcówki igły do mikroiniekcji i wstrzykują do zarodka dwa nanolitry mieszaniny morfliny. Po 26 godzinach od zapłodnienia naładować igłę do mikroiniekcji około pięcioma mikrolitrami inokulum P.aeruginosa i wprowadzić igłę grzbietowo do punktu początkowego przewodu Cuviera, w którym przewód zaczyna rozprzestrzeniać się po woreczku żółtkowym. Wstrzyknąć od jednego do trzech nanolitrów inokulum PAO1 do zarodka, upewniając się, że objętość rozszerza się bezpośrednio w przewodzie i wchodzi do krążenia.Po wstrzyknięciu przenieść zarodek na jedną z dwóch nowych szalek Petriego zawierających świeżą pożywkę E3 uzupełnioną fenylotiomocznikiem przez 30 minut lub trzy godziny inkubacji w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnie załadować igłę do mikroiniekcji około pięcioma mikrolitrami koktajlu fagowego i przymocować igłę do mikrowstrzykiwacza. Następnie wstrzyknąć od jednego do trzech nanolitrów koktajlu fagowego do przewodu Cuviera każdego zarodka, któremu wcześniej wstrzyknięto bakterie i umieścić zarodki na jednej z dwóch nowych szalek Petriego zawierających świeżą pożywkę E3 uzupełnioną fenylotiomocznikiem w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Po czterech godzinach od zakażenia użyj plastikowej pipety, aby przenieść znieczulony zarodek do naczynia ze szklanym dnem. I napełnij naczynie ciepłym roztworem agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Gdy agaroza ostygnie, delikatnie napełnij naczynie podłożem E3 uzupełnionym roztworem znieczulającym.Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą końcówki pipety ustaw zarodek w pożądanej orientacji. Następnie umieść naczynie pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym z filtrem fluorescencyjnym w poszukiwaniu bakterii GFP dodatnich do 18 godzin po zakażeniu i zobrazuj zarodek pod kątem progresji ekspresji GFP po dziewięciu, 14 i 18 godzinach po zakażeniu. Aby określić obciążenie bakteryjne po ośmiu godzinach od zakażenia, przenieś 15 znieczulonych zarodków z mikrowstrzyknięciami do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i zastąp roztwór znieczulający 300 mikrolitrami 1% Triton X-100 w PBS.Przełóż igły przez sterylną igłę strzykawki insulinowej o rozmiarze 27 co najmniej 15 razy, aby homogenizować zarodki. I przygotować seryjne rozcieńczenia homogenatu, przenosząc 100 mikrolitrów powstałej mieszaniny do 900 mikrolitrów sterylnego PBS na rozcieńczenie. Aby wybrać naturalnie odporny na ampicylinę szczep P.aeruginosa, należy rozlać 10 mikrolitrów rozcieńczeń na agar LB uzupełniony ampicyliną i inkubować je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia policz liczbę kolonii. Aby umożliwić obliczenie całkowitej liczby jednostek tworzących kolonie i średniej liczby jednostek tworzących kolonie na zakażony zarodek. Aby ocenić śmiertelność zakażenia P.aeruginosa, należy ocenić wstrzyknięte zarodki po 20 godzinach od zakażenia pod mikroskopem stereoskopowym, licząc liczbę martwych, białych, nieprzezroczystych zarodków.Następnie należy obliczyć połowę maksymalnej dawki 50 dawek P.aeruginosa o stężeniu śmiertelnym, która spowodowała śmierć 50% wstrzykniętych zarodków w ciągu 20 godzin po zakażeniu. Aby potwierdzić fenotyp mukowiscydozy, można ocenić upośledzoną pozycję narządów wewnętrznych, takich jak serce, wątroba i trzustka. Obciążenie bakteryjne jest zmniejszane przez terapię fagową w zarodkach mukowiscydozy zakażonych P.Aeruginosa.W ciągu 48 godzin po zapłodnieniu zarodki mukowiscydozy zakażone bakterią P.Aeroginosa z dodatnim wynikiem GFP, 30 jednostek tworzących kolonie na dawkę zarodka wykazuje 50% śmiertelność po 20 godzinach od zakażenia. Terapia fagowa jest równie skuteczna po 20 godzinach od zakażenia, gdy jest dostarczana 30 minut po wstrzyknięciu bakterii, lub siedem godzin po wstrzyknięciu bakterii. Pokazano mukowiscydozę i GFP dodatni zarodek P.Aeruginosa, któremu wstrzyknięto zarodek po czterech, dziewięciu, 14 i 18 godzinach po zakażeniu.Natomiast mukowiscydoza plus P.Aeruginosa plus zarodek, któremu wstrzyknięto fagi, wykazują zmniejszoną fluorescencję ze względu na działanie fagów przeciwko bakteriom. Odpowiedź zapalna wywołana przez zakażenie P.aeruginosa w zarodkach mukowiscydozy jest znacznie zwiększona, co ujawnia ekspresja cytokin prozapalnych, TNF alfa i interleukiny 1 beta po wstrzyknięciu P.aeruginosa w porównaniu z grupą kontrolną, której wstrzyknięto danio pręgowanego. Ekspresja obu cytokin zapalnych jest jednak zmniejszona u zwierząt, którym wstrzyknięto koktajl fagowy.Fagi muszą być starannie oczyszczone w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających endotoksyn, które mogą zostać zatrzymane podczas przygotowania. Preparaty fagowe można analizować za pomocą mikroskopii elektronowej w celu oceny morfologii wirionu. Interesujące byłoby sprawdzenie, czy zakażenie u ludzi bakteriami innymi niż Pseudomonas aeruginosa można wyleczyć za pomocą terapii fagowej w modelu danio pręgowanego z mukowiscydozą.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Film demonstruje technikę terapii fagowej ukierunkowaną na zakażenie Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą. Terapia fagowa skutecznie zmniejsza obciążenie bakteryjne i łagodzi prozapalne odpowiedzi immunologiczne w zarodkach danio pręgowanego mukowiscydozy zakażonych bakteriami, co prowadzi do zmniejszenia śmiertelności zarodków mukowiscydozy.

Terapia fagowa przeciwko zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokół immunizacji dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) szczepionką opartą na DNA i pokazujemy walidację udanego szczepienia. Metoda ta jest odpowiednia do przedklinicznych badań przesiewowych kandydatów na szczepionki w różnych modelach infekcji.

Uodparnianie dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Poznaj protokół terapii fagowej przeciwko Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą. Ta metoda umożliwia ocenę skuteczności fagów w zwalczaniu zakażenia bakteryjnego in vivo.

Zastosowanie terapii fagowej w celu przeciwdziałania zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie terapii fagowej w celu przeciwdziałania zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą

Przeglądaj więcej filmów