Zastosowanie terapii fagowej w celu przeciwdziałania zakażeniu Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego z mukowiscydozą

Protokół ten ułatwia przygotowanie i podanie koktajlu wirusowego i fagowego przeciwko Pseudomonas aeruginosa w zarodkach danio pręgowanego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę in vivo skuteczności faga w przeciwdziałaniu infekcji bakteryjnej. Koktajl fagowy jest skuteczny zarówno w modelach danio pręgowanego typu dzikiego, jak i mukowiscydozy.

Otwarcie możliwości zastosowania terapii fagowej w zakażeniach bakteryjnych u pacjentów z mukowiscydozą. Terapia fagowa może być również stosowana do przeciwdziałania specyficznym infekcjom bakteryjnym w innych systemach modelowych. Przygotowanie materiału fagowego do eksperymentu.

Dodaj 1,25 razy 10 do siódmych fagów do OD 600 0,05 kultury P.aeruginosa do wielokrotności infekcji jeden razy 10 do ujemnych trzech i inkubować kulturę przez trzy do czterech godzin z wytrząsaniem, aż OD 600 spadnie do 0,1 do 0,3. Pod koniec inkubacji inkubować lizat z jednym mikrogramem na mililitr DNAzy i RNAzy przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. I granulować komórki przez odwirowanie.

Pod koniec wirowania przefiltrować supernatant przez pory o średnicy 0,8 mikrometra i dodać 58 gramów na litr chlorku sodu i 105 gramów na litr PEG 6000. Inkubuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka wytrącić faga przez odwirowanie.

Pod koniec centrofugacji usunąć supernatant i ostrożnie rozpuścić osad faga w 15 mililitrach buforu chlorku sodu Tris. Aby oczyścić fagi za pomocą gradientu gęstości chlorku cezu, najpierw rozwarstwić dwa mililitry czterech różnych roztworów chlorku cezu w probówkach ultrawirówek polialomerowych do wirnika SW 41 i dodać 3,5 mililitra zawiesiny fagowej do każdej probówki. Chlorek cezu jest toksyczny.

Zawsze stosuj odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z tym związkiem i wyrzucania. Po załadowaniu wszystkich rurek umieść je w wirniku, uważając, aby rurki były wyważone. I odwirowywać próbki przez dwie godziny w temperaturze 100 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza.

Pod koniec wirowania użyj strzykawki z igłą o rozmiarze 19, aby zassać białą warstwę między obszarami o gęstości D równej 1,5, a D równą 1,4. I przenieś zawiesiny do nowych rur polialomerowych w rozmiarze SW 60. Odwirowywać zawiesiny przez co najmniej 16 godzin w temperaturze 150 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

I przenieś widoczne pasma do probówek dializacyjnych z odcięciem 6 000 daltonów. Następnie pobrane próbki należy dializować dwa razy w 500 mililitrach wody przez 20 minut na dializę i przez noc w 500 mililitrach buforu chlorku sodu Tris. Następnego ranka przefiltruj powstały materiał fagowy za pomocą filtra porowego o średnicy 0,22 mikrometra i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W dniu mikroiniekcji rozcieńczyć dwa jednomikromolowe roztwory podstawowe morpholinos w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 0,25 picomolar na zarodek, aby otrzymać pięciomikrolitrowy roztwór do wstrzykiwań morpholino. I dodaj 0,5 mikrolitra czerwieni fenolowej do każdego roztworu. Następnie użyj mikropipety o pojemności 20 mikrolitrów z końcówką ładującą z drobnym żelem, aby załadować igłę do mikroiniekcji z całą objętością zmieszanego roztworu morpholino i przymocuj igłę do mikromanipulatora podłączonego do statywu pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie, za pomocą jednej lub dwóch komórek, zarodki zebry zebrane ułożone na szklanym szkiełku umieszczonym na szalce Petriego o średnicy 96 milimetrów, penetrują kosmówkę i żółtko za pomocą końcówki igły do mikroiniekcji i wstrzykują do zarodka dwa nanolitry mieszaniny morfliny. Po 26 godzinach od zapłodnienia naładować igłę do mikroiniekcji około pięcioma mikrolitrami inokulum P.aeruginosa i wprowadzić igłę grzbietowo do punktu początkowego przewodu Cuviera, w którym przewód zaczyna rozprzestrzeniać się po woreczku żółtkowym. Wstrzyknąć od jednego do trzech nanolitrów inokulum PAO1 do zarodka, upewniając się, że objętość rozszerza się bezpośrednio w przewodzie i wchodzi do krążenia.

Po wstrzyknięciu przenieść zarodek na jedną z dwóch nowych szalek Petriego zawierających świeżą pożywkę E3 uzupełnioną fenylotiomocznikiem przez 30 minut lub trzy godziny inkubacji w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnie załadować igłę do mikroiniekcji około pięcioma mikrolitrami koktajlu fagowego i przymocować igłę do mikrowstrzykiwacza. Następnie wstrzyknąć od jednego do trzech nanolitrów koktajlu fagowego do przewodu Cuviera każdego zarodka, któremu wcześniej wstrzyknięto bakterie i umieścić zarodki na jednej z dwóch nowych szalek Petriego zawierających świeżą pożywkę E3 uzupełnioną fenylotiomocznikiem w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Po czterech godzinach od zakażenia użyj plastikowej pipety, aby przenieść znieczulony zarodek do naczynia ze szklanym dnem. I napełnij naczynie ciepłym roztworem agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Gdy agaroza ostygnie, delikatnie napełnij naczynie podłożem E3 uzupełnionym roztworem znieczulającym.

Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą końcówki pipety ustaw zarodek w pożądanej orientacji. Następnie umieść naczynie pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym z filtrem fluorescencyjnym w poszukiwaniu bakterii GFP dodatnich do 18 godzin po zakażeniu i zobrazuj zarodek pod kątem progresji ekspresji GFP po dziewięciu, 14 i 18 godzinach po zakażeniu. Aby określić obciążenie bakteryjne po ośmiu godzinach od zakażenia, przenieś 15 znieczulonych zarodków z mikrowstrzyknięciami do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i zastąp roztwór znieczulający 300 mikrolitrami 1% Triton X-100 w PBS.

Przełóż igły przez sterylną igłę strzykawki insulinowej o rozmiarze 27 co najmniej 15 razy, aby homogenizować zarodki. I przygotować seryjne rozcieńczenia homogenatu, przenosząc 100 mikrolitrów powstałej mieszaniny do 900 mikrolitrów sterylnego PBS na rozcieńczenie. Aby wybrać naturalnie odporny na ampicylinę szczep P.aeruginosa, należy rozlać 10 mikrolitrów rozcieńczeń na agar LB uzupełniony ampicyliną i inkubować je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia policz liczbę kolonii. Aby umożliwić obliczenie całkowitej liczby jednostek tworzących kolonie i średniej liczby jednostek tworzących kolonie na zakażony zarodek. Aby ocenić śmiertelność zakażenia P.aeruginosa, należy ocenić wstrzyknięte zarodki po 20 godzinach od zakażenia pod mikroskopem stereoskopowym, licząc liczbę martwych, białych, nieprzezroczystych zarodków.

Następnie należy obliczyć połowę maksymalnej dawki 50 dawek P.aeruginosa o stężeniu śmiertelnym, która spowodowała śmierć 50% wstrzykniętych zarodków w ciągu 20 godzin po zakażeniu. Aby potwierdzić fenotyp mukowiscydozy, można ocenić upośledzoną pozycję narządów wewnętrznych, takich jak serce, wątroba i trzustka. Obciążenie bakteryjne jest zmniejszane przez terapię fagową w zarodkach mukowiscydozy zakażonych P.Aeruginosa.

W ciągu 48 godzin po zapłodnieniu zarodki mukowiscydozy zakażone bakterią P.Aeroginosa z dodatnim wynikiem GFP, 30 jednostek tworzących kolonie na dawkę zarodka wykazuje 50% śmiertelność po 20 godzinach od zakażenia. Terapia fagowa jest równie skuteczna po 20 godzinach od zakażenia, gdy jest dostarczana 30 minut po wstrzyknięciu bakterii, lub siedem godzin po wstrzyknięciu bakterii. Pokazano mukowiscydozę i GFP dodatni zarodek P.Aeruginosa, któremu wstrzyknięto zarodek po czterech, dziewięciu, 14 i 18 godzinach po zakażeniu.

Natomiast mukowiscydoza plus P.Aeruginosa plus zarodek, któremu wstrzyknięto fagi, wykazują zmniejszoną fluorescencję ze względu na działanie fagów przeciwko bakteriom. Odpowiedź zapalna wywołana przez zakażenie P.aeruginosa w zarodkach mukowiscydozy jest znacznie zwiększona, co ujawnia ekspresja cytokin prozapalnych, TNF alfa i interleukiny 1 beta po wstrzyknięciu P.aeruginosa w porównaniu z grupą kontrolną, której wstrzyknięto danio pręgowanego. Ekspresja obu cytokin zapalnych jest jednak zmniejszona u zwierząt, którym wstrzyknięto koktajl fagowy.

Fagi muszą być starannie oczyszczone w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających endotoksyn, które mogą zostać zatrzymane podczas przygotowania. Preparaty fagowe można analizować za pomocą mikroskopii elektronowej w celu oceny morfologii wirionu. Interesujące byłoby sprawdzenie, czy zakażenie u ludzi bakteriami innymi niż Pseudomonas aeruginosa można wyleczyć za pomocą terapii fagowej w modelu danio pręgowanego z mukowiscydozą.