Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Różne parametry obciążenia mechanicznego mogą indukować komórki macierzyste pochodzące ze ścięgien zróżnicowane w różne komórki. Przedstawiamy szczegółowy proces zastosowania tego trójwymiarowego jednoosiowego systemu bioreaktora do stymulacji mechanicznej do indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien. Tendinopatia jest jednym z najczęstszych urazów sportowych na oddziale ortopedycznym.

Obecność tendinopatii Achillesa jest najczęstsza i wynosi do 29% u biegaczy średnio- i długodystansowych, podczas gdy obecność tendinopatii rzepki jest również wysoka u sportowców siatkówki, koszykówki, lekkoatletyki, piłki ręcznej i piłki nożnej. Jednak ze względu na ograniczoną zdolność ścięgna do samoleczenia i brak skutecznego leczenia, tendinopatia nadal ma znaczący niekorzystny wpływ na jakość życia pacjentów. Komórki STEM pochodzące ze ścięgien, znane jako TDSC jako ważne komórki prekursorowe komórek ścięgien, odgrywają ważną rolę w rozwoju tendinopatii, a także w ich funkcjonalnym i strukturalnym odbudowie po tendinopatii.

Jednak różne od mechanicznych parametry obciążenia, takie jak naprężenie obciążenia, częstotliwość obciążenia, rodzaj obciążenia i okres obciążenia, mogą powodować różnicowanie TDSC w różne komórki. Tak więc skuteczny i ważny reżim obciążenia mechanicznego jest bardzo istotny dla genezy ścięgien. Istnieje siedem etapów obecnego protokołu, w tym izolacja TDSC myszy, hodowla i ekspansja TDSC myszy, przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego, tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej, przygotowanie konstrukcji komórek STEM ścięgien 3D, montaż jednoosiowego kompleksu stymulacji mechanicznej rozciągającej komórki oraz ocena mechanicznie stymulowanej tkanki przypominającej ścięgno in vitro.

Izolacja myszy TDSC. Stosowana u myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni przez zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz ścięgna rzepki i ścięgna Achillesa.

Trawić ścięgno sześciomililitrową kolagenazą typu 1 przez trzy godziny. Zebrać komórki i hodować je w kompletnym alfa MEM zawierającym 10% FBS i 1% mieszaniny streptomycyny i penicyliny przez siedem dni. zidentyfikować TDSC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej, ekspresji markerów powierzchniowych komórek, w tym CD44, CD90 i Sca-1.

Brak ekspresji CD34 i CD45. Przejście i zamrożenie komórek. Komórki pasażowe zostaną wykorzystane do dalszych kroków.

Hodowla i ekspansja myszy TDSC. Weźmy rozgrzane komórki macierzyste ścięgien myszy. Powoli dodawaj dodatkowe cztery do pięciu mililitrów kompletnego alpha MEM.

Przenieść mieszaninę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą pipety. Uzupełnij pożywką do łącznie ośmiu mililitrów za pomocą pipety. Umieść probówkę w wirówce, aby dobrze wyważyć.

Odwirować komórki o masie 347 g przez pięć minut. Wyjmij probówkę z wirówki. Sprawdź pellet na dole.

Zdekantować wolne podłoże. Delikatnie ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu o pojemności od jednego do dwóch mililitrów. Unikaj robienia zbyt wielu bąbelków.

Przenieść ponownie zawieszone komórki do kolby T75 za pomocą pipety. Za pomocą pipety dodaj do kolby kompletną pożywkę alfa MEM, aby osiągnąć całkowitą objętość 10 mililitrów przy końcowym stężeniu 13 000 komórek na centymetr kwadratowy. Umieścić kolbę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla.

Zmieniaj podłoże co trzy dni. Obserwuj i monitoruj komórki pod mikroskopem podczas zmiany pożywki, aż komórki zostaną wyhodowane do 100% zbieżności. Przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego.

Wlej 15 mililitrów kompletnej pożywki alpha MEM do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj sześć mikrolitrów kwasu askorbinowego do 15 mililitrów pożywki do końcowego stężenia 4,4 mikrograma na mililitr. Mieszaj delikatnie, odwracając górę idół.

Tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej. Ostrożnie wyrzuć nienormalną kompletną pożywkę alfa MEM. Unikać dotykania komórek przymocowanych do dna kolby.

Powoli dodawaj 10 mililitrów pożywki stymulującej. Unikaj powodowania jakichkolwiek zakłóceń w całkowicie zlewających się komórkach. Hoduj komórki w pożywce stymulacyjnej przez dziewięć dni i zmieniaj pożywkę co trzy dni, aby wystarczająco wytworzyć arkusz komórek w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenku węgla.

Przygotowanie konstrukcji komórek macierzystych ścięgien 3D. Wyjąć kolbę z inkubatora. Całkowicie wyrzuć pożywkę stymulującą.

Przemyć jednowarstwowy arkusz komórek PBS, obracając kolbą. Całkowicie wyrzuć PBS. Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny do rogu kolby.

Postukaj w róg kolby, aby odłączyć jednowarstwowy arkusz komórek, aż róg arkusza komórek zmyje się z dna kolby. Natychmiast dodaj dziewięć mililitrów kompletnej pożywki alpha MEM, aby zatrzymać reakcję trypsynizacji. Kontynuować obracanie kolby, aby całkowicie oderwać jednowarstwowy arkusz komórek.

Wylej całość, aby przymocować arkusz komórek do szalki Petriego z podłożem. Użyj sterylnej pęsety, aby podnieść jeden róg arkusza komórek i obróć w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara 15 razy. Podnieś drugi koniec arkusza komórkowego i obróć go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara przez 10 razy, aby sformułować konstrukcję in vitro przypominającą ścięgno.

Montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze. Połącz haczyki za pomocą złącza, a następnie dopasuj do dwóch centymetrów między dwoma haczykami. Delikatnie nawiń konstrukcję 3D TDSC na hak demonstracyjny trzy razy na każdym haku.

Przymocuj haki z konstrukcją komórkową do komory bioreaktora, dokręcając na dwóch końcach. Napełnij komorę kompletną pożywką alpha MEM. Podłącz akcelerator do komory hodowlanej za pomocą.

Przetnij łącznik haczyków za pomocą sterylnej pęsety. Włącz kontroler zasilania i kanałów, aby rozpocząć stymulację mechaniczną. Załóż pokrywę na komorę, śledź lampki kontrolne i upewnij się, że bioreaktor może działać prawidłowo.

Umieść bioreaktor w inkubatorze i poddaj konstrukcję komórkową 3D mechanicznemu rozciąganiu. Reżim obciążenia to 6% obciążenia, częstotliwość 0,25 Hz, osiem godzin, a następnie 16 godzin odpoczynku przez sześć dni. Ocena tkanki ścięgnistej stymulowanej mechanicznie in vitro.

Poluzuj śrubokrętem i ostrożnie zdejmij zespół. Umieść tkankę przypominającą ścięgno w 4% PFA w celu utrwalenia na 15 minut, umieść utrwaloną tkankę przypominającą ścięgno w kasecie biopsyjnej z biopsją od zwierząt domowych. Proces odwadniania próbki.

I na koniec, oceń na podstawie pozycji histologicznej HD. Powtórz cały protokół i wyekstrahuj RNA z tkanki przypominającej ścięgno w celu oceny ekspresji markerów tenogennych za pomocą qPCR. Przed stymulacją mechaniczną, TDSC osiągną 100% konfluencję w kompletnym pożywce i będą wykazywać zdezorganizowaną zewnętrzną morfologię strukturalną.

Po sześciu dniach można było zaobserwować rozciąganie, obciążenie mechaniczne, matrycę pozakomórkową, a wyrównanie komórek było dobrze zorientowane. Komórki były dobrze wypełnione i dobrze otoczone ECM po mechanicznym obciążeniu. Przedstawiono morfologię komórek zlokalizowanych i była bardziej podobna do normalnych komórek ścięgien w porównaniu do tych bez rozciągania.

Gęstość komórek w konstrukcji komórkowej z obciążeniem była wyższa niż w przypadku bez obciążenia. Wyniki qPCR wykazały, że obecne sprawy zwiększyły ekspresję markerów tenogennych, w tym twardziny, irokeza, tenomoduliny i kolagenu typu 1 w porównaniu z tymi leczonymi podaną hodowlą. Jeśli chodzi o system bioreaktora do stymulacji mechanicznej, w naszym obecnym protokole zastosowano oddzielną komorę z silnikiem liniowym.

Ponieważ może zapewnić dokładne obciążenie mechaniczne, jest przenośny i łatwy do regulacji w porównaniu ze sposobami, w jakie tradycyjny arkusz komórek 2D i rozciąganie dwuosiowe, konstrukcja komórki 3D jest bardziej podobna do rzeczywistego kształtu ścięgna. A rozciągnięcie jednoosiowe jest bardziej podobne do charakterystyki mocnych stron komórek ścięgien. Stanowi to teoretyczną podstawę wykorzystania jednoosiowego systemu rozciąganego 3D do stymulowania różnicowania TDSC.

W ten sposób arkusze komórek 2D zostały ostatecznie przekierowane do konstrukcji komórki 3D i przeszły jednoosiowe w obecnym protokole. Zgodnie z naszym systemem bioreaktorów, nasz reżim obciążenia to 6% obciążenie, częstotliwość 0,25 Hz, osiem godzin, a następnie 16-godzinny odpoczynek przez sześć dni. Na koniec wykazano skuteczność protokołu na podstawie morfologii i poziomu ekspresji markerów tenogennych.

Cały proces operacji jest prosty, ale operator musi zwracać uwagę, aby środowisko TDSC było zawsze wysterylizowane. Istnieje wiele zastosowań naszego protokołu. Proces stymulowania TDSC do naśladowania różnicowania in vivo jest pomocny w badaniu patologicznego procesu tendinopatii.

Poza tym protokół ten zapewnia powtarzalną metodę ukierunkowanego różnicowania TDSC w tkankę podobną do ścięgien. Dzięki temu można go łatwo i skutecznie wykorzystać do potencjalnej inżynieryjnej hodowli ścięgien. Podsumowując, zastosowanie jednoosiowego systemu bioreaktora do stymulacji mechanicznej 3D jest prostą, ekonomiczną, powtarzalną i ważną metodą indukowania różnicowania tenogennego TDSC.

Nasz protokół szczegółowo opisuje cały proces.