Name: Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Poznaj zastosowanie trójwymiarowego bioreaktora z jednoosiową stymulacją mechaniczną do indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien w badaniach nad leczeniem tendinopatii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały przeprowadzone w czasie, gdy autor otrzymywał "stypendium University of Western Australia International Fee oraz University Postgraduate Award na Uniwersytecie Australii Zachodniej". Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81802214).

Opisane metody zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami Komitetu Etyki Zwierząt Uniwersytetu Australii Zachodniej.
1. Izolacja myszy TDSC
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 6-8-tygodniowe myszy C57BL/6 przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Żniwo ścięgien rzepki24 i ścięgna Achillesa25.</li>
	<li>Trawić ścięgna z jednego z 6 ml kolagenazy typu I (3 mg/ml) przez 3 godziny 
	UWAGA: Ponieważ rozmiar ścięgna u myszy jest mały, w tym kroku należy użyć wszystkich ścięgien pobranych od jednej myszy.</li>
	<li>Zebrać komórki i hodowlę w kompletnym minimalnym podłożu niezbędnym (Alpha-MEM) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% mieszaniny streptomycyny i penicyliny przez 7 dni.</li>
	<li>Identyfikacja TDSC za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej (ekspresja markerów powierzchniowych komórek, w tym CD44, CD90 i Sca-1; brak ekspresji CD34 i CD45).</li>
	<li>Przejście i zamrożenie komórek (pasaż 4 komórki zostaną wykorzystane do dalszych kroków).</li>
</ol>
2. Hodowla i ekspansja myszy TDSC
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Weź rozgrzane komórki (myszy TDSC, 1 milion komórek, pasaż 4, do 37 °C).</li>
	<li>Powoli dodawaj dodatkowe 4-5 ml kompletnego Minimal Essential Medium (Alpha-MEM).</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety.</li>
	<li>Uzupełnić pożywką do 8 ml za pomocą pipety.
	<ol>
		<li>Podgrzewanie podłoża w inkubatorze w piekarniku o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść probówkę w wirówce i zrównoważ.</li>
	<li>Odwirować i osadzać komórki przy 347 x g przez 5 min.</li>
	<li>Wyjmij po odwirowaniu i sprawdź osad na dnie.</li>
	<li>Zdekantuj pożywkę do zamrażania i delikatnie zawieś komórki w 1-2 ml kompletnego podłoża (unikaj tworzenia zbyt wielu pęcherzyków).</li>
	<li>Przenieść zawieszone komórki do kolby T-75 za pomocą pipety.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodaj kompletną pożywkę Alpha-MEM do kolby, aby osiągnąć całkowitą objętość 10 ml przy końcowym stężeniu 13 000 komórek/cm2.</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze i hodować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3 dni.</li>
	<li>Obserwuj i monitoruj komórki pod mikroskopem podczas zmiany pożywki, aż komórki zostaną wyhodowane do 100% zbiegu (około 40 000 komórek/cm2).</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkuszy komórkowych
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Wlać 15 ml kompletnej pożywki Alpha-MEM do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 6 μl kwasu askorbinowego (11 mg/ml) do 15 ml pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 4,4 μg/ml. 
	UWAGA: Dodatkowo dodanie czynnika wzrostu tkanki łącznej o stężeniu 25 ng / ml do pożywki hodowlanej stymulującej może przyspieszyć cały proces wzrostu i różnicowania.</li>
	<li>Mieszaj delikatnie, odwracając górę idół.</li>
</ol>
4. Tworzenie arkuszy komórkowych przez hodowlę w pożywce stymulacyjnej
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Ostrożnie wyrzucić normalną, kompletną pożywkę alfa-MEM i unikać dotykania komórek przymocowanych do dna kolby.</li>
	<li>Powoli dodawaj 10 ml pożywki stymulacyjnej, unikając powodowania jakichkolwiek zakłóceń w pełni zlewających się komórek.</li>
	<li>Hodować komórki w pożywce stymulacyjnej przez 9 dni (zmieniać pożywkę co 3 dni), aby w wystarczającym stopniu wytworzyć arkusz komórek w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkowa stanie się gruba i będzie mętna, gdy będzie obserwowana z dna kolby po stymulacji kwasem askorbinowym, co oznacza, że arkusz komórkowy jest wystarczająco wygenerowany.</li>
</ol>
5. Przygotowanie konstrukcji 3D z komórek macierzystych ścięgna
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Wyjąć kolbę z inkubatora.</li>
	<li>Całkowicie wyrzuć pożywkę stymulującą.</li>
	<li>Przepłukać jednowarstwowy arkusz komórek solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), obracając kolbą.</li>
	<li>Całkowicie wyrzuć PBS.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodaj 1 ml 0,25% trypsyny do rogu kolby.</li>
	<li>Postukaj w róg kolby, aby odczepić jednowarstwowy arkusz komórek, aż róg arkusza komórek znajdzie się poza dnem kolby.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 9 ml kompletnej pożywki Alpha-MEM, aby zatrzymać trypsynizację.</li>
	<li>Kontynuować obracanie kolby, aby całkowicie oderwać jednowarstwowy arkusz komórek.</li>
	<li>Wlej cały odczepiony arkusz komórek na szalkę Petriego z pożywką.</li>
	<li>Użyj sterylnej pęsety, aby podnieść jeden róg arkusza komórek i obróć w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara 15 razy.</li>
	<li>Podnieś drugi koniec arkusza komórkowego i obróć go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara 10 razy, aby mocno wytworzyć konstrukcję in vitro przypominającą ścięgno (ryc. 1A).</li>
</ol>
6. Montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Połącz haczyki za pomocą łącznika i ustaw żądaną odległość (2 cm) między dwoma hakami.</li>
	<li>Delikatnie nawiń konstrukcję 3D TDSC na zmontowany hak 3 razy na każdym haku (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przymocuj haki z konstrukcją komórkową do komory bioreaktora, dokręcając na dwóch końcach. 
	UWAGA: Cała komora, łącznie ze i haczykami, jest sterylna (autoklaw przez 1,5 h w temperaturze 134 °C i naświetlanie promieniami ultrafioletowymi (UV) przez 24 godziny przed użyciem). W przypadku metalowego uchwytu komór światło UV należy wystawiać na działanie promieni UV przez 48 godzin przed użyciem.</li>
	<li>Napełnij komorę kompletną pożywką Alpha-MEM.</li>
	<li>Podłącz siłownik do komory hodowlanej za pomocą.</li>
	<li>Przetnij łącznik haczyków sterylnymi nożyczkami.</li>
	<li>Włącz zasilanie i odpowiedni kontroler kanałów, aby rozpocząć stymulację mechaniczną.</li>
	<li>Załóż pokrywę na komorę.</li>
	<li>Sprawdź lampki kontrolne i upewnij się, że bioreaktor działa prawidłowo.</li>
	<li>Umieść bioreaktor w inkubatorze i poddaj konstrukcję komórki 3D mechanicznemu rozciąganiu przez 6 dni (6% rozciąganie, 0,25 Hz, 8 godzin, a następnie 16 godzin odpoczynku).</li>
</ol>
7. Ocena mechanicznie stymulowanej tkanki ścięgna in vitro
<ol>
	<li>Poluzuj śrubokrętem i ostrożnie zdejmij zespół.</li>
	<li>Umieść tkankę przypominającą ścięgno w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia na 15 minut.</li>
	<li>Umieść utrwaloną tkankę przypominającą ścięgno w kasecie biopsyjnej z podkładkami z pianki biopsyjnej.</li>
	<li>Proces odwadniania próbki i ostateczna ocena za pomocą barwienia histologicznego H&E.</li>
	<li>Powtórz cały protokół i wyekstrahuj RNA z tkanki przypominającej ścięgno w celu oceny ekspresji markerów tenogennych za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Startery dla wybranych genów są wymienione w tabeli 1. 
	UWAGA: Protokół histologiczny i protokół qPCR są standardowe i zgodne z poprzednim badaniem21.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ścięgno jest mechanicznie wrażliwą włóknistą tkanką łączną. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, nadmierne obciążenie mechaniczne może prowadzić do osteogennego różnicowania komórek macierzystych ścięgien, podczas gdy niewystarczające obciążenie prowadziłoby do zaburzenia struktury włókien kolagenowych podczas różnicowania ścięgien21.
Powszechny pogląd głosi, że kluczem do idealnego bioreaktora jest możliwość symulacji mikrośrodowiska komórkowego in vitro, w którym znajd...

Tendinopatia jest jednym z najczęstszych urazów sportowych. Objawia się głównie bólem, miejscowym obrzękiem, zmniejszonym napięciem mięśniowym w dotkniętym obszarze i dysfunkcją. Częstość występowania tendinopatii jest wysoka. Obecność tendinopatii Achillesa występuje najczęściej u biegaczy średnio- i długodystansowych (do 29%), podczas gdy obecność tendynopatii rzepki jest również wysoka u sportowców siatkówki (45%), koszykówki (32%), lekkoatletyki (23%), piłki ręcznej (15%) i piłki nożnej (13%)1,2,3,4,5. Jednak ze względu na ograniczoną zdolność ścięgna do samoleczenia i brak skutecznych metod leczenia, tendinopatia nadal negatywnie wpływa na życie pacjentów6,7. Ponadto patogeneza tendinopatii pozostaje niejasna. Przeprowadzono wiele badań nad jego patogenezą, w tym głównie "teorię zapalenia", "teorię zwyrodnienia", "teorię nadużywania" i tak dalej8. Obecnie wielu badaczy uważa, że tendinopatia jest spowodowana nieudaną samonaprawą mikrourazów spowodowanych nadmiernym obciążeniem mechanicznym, którego doświadcza ścięgno9,10.
Komórki macierzyste pochodzące ze ścięgien (TDSC), jako pierwotne komórki prekursorowe komórek ścięgien, odgrywają istotną rolę zarówno w rozwoju tendinopatii, jak i w funkcjonalnym i strukturalnym odbudowie po tendinopatii11,12,13. Doniesiono, że stymulacja stresem mechanicznym może powodować proliferację i różnicowanie osteocytów, osteoblastów, komórek mięśni gładkich, fibroblastów, mezenchymalnych komórek macierzystych i innych komórek wrażliwych na siłę14,15,16,17,18. Dlatego TDSC, jako jedna z mechanowrażliwych i multipotencjalnych komórek, może być podobnie stymulowana do różnicowania przez obciążenie mechaniczne19,20.
Jednak różne parametry obciążenia mechanicznego (siła obciążenia, częstotliwość obciążenia, typ obciążenia i okres obciążenia) mogą skłonić TDSC do różnicowania się w różne komórki21. W związku z tym skuteczny i ważny reżim obciążenia mechanicznego jest bardzo istotny dla tenogenezy. Ponadto istnieją różne rodzaje bioreaktorów jako systemów stymulacji, które są obecnie wykorzystywane do mechanicznego obciążania TDSC. Zasada działania każdego rodzaju bioreaktora jest inna, więc parametry obciążenia mechanicznego odpowiadające różnym bioreaktorom są również różne. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prosty, ekonomiczny i powtarzalny protokół stymulacji, obejmujący typ bioreaktora, odpowiednie medium stymulacyjne i reżim obciążenia mechanicznego.
Niniejszy artykuł opisuje metodę opartą na trójwymiarowym (3D) jednoosiowym systemie rozciągania, który stymuluje TDSC do różnicowania się w tkankę podobną do ścięgna. Protokół składa się z siedmiu etapów: izolacja TDSC myszy, hodowla i ekspansja TDSC myszy, przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego, tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej, przygotowanie konstrukcji komórek macierzystych ścięgna 3D, montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej oraz ocena mechanicznie stymulowanej tkanki przypominającej ścięgno in vitro. Cała procedura zajmuje mniej niż 3 tygodnie, aby uzyskać konstrukcję komórki 3D, czyli znacznie mniej niż niektóre istniejące metody22,23. Udowodniono, że obecny protokół jest w stanie skłonić TDSC do różnicowania się w tkankę ścięgna i jest bardziej niezawodny niż obecnie powszechnie stosowany dwuwymiarowy (2D) system rozciągania21. Skuteczność wykazano za pomocą badania histologicznego. Krótko mówiąc, obecny protokół jest prosty, ekonomiczny, powtarzalny i ważny.

<table><tbody><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-aldrich</td><td>PHR1008-2G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco&auml; od Life Technologies</td><td>1908361</td><td></td></tr><tr><td>Procesor histologiczny</td><td>Leica</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)</td><td>Gibco&auml; firmy Life Technologies</td><td>2003802</td><td></td></tr><tr><td>Komórka</td><td></td><td></td> <td>macierzysta pochodząca ze ścięgna myszyIzolowany ze ścięgien Achillesa myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni. Następnie trawiony kolagenazą typu I (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) przez 3 godziny i przepuszczono przez sitko o średnicy 70 mm, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina streptomycyny i penicyliny</td><td>Gibco&auml; firmy Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktorów do stymulacji mechanicznej</td><td>Centrum Ortopedycznych Badań Translacyjnych, Szkoła Medyczna, Uniwersytet Australii</td><td></td> <td>ZachodniejDostępne u autora korespondencyjnego na życzenie. Lub zrób to zgodnie z naszym projektem* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programowalna stymulacja mechaniczna wpływa na homeostazę ścięgien w układzie bioreaktora. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5):1495&ndash;1507. doi:10.1002/bit.24809</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco&auml; by Life Technologies</td><td>1858331</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Tendinopatia to powszechna przewlekła choroba ścięgien związana ze stanem zapalnym i zwyrodnieniem w okolicy ortopedycznej. Ze względu na wysoką zachorowalność, ograniczoną zdolność do samonaprawy i, co najważniejsze, brak ostatecznych metod leczenia, tendinopatia nadal negatywnie wpływa na jakość życia pacjentów. Komórki macierzyste pochodzące ze ścięgien (TDSC), jako pierwotne komórki prekursorowe komórek ścięgien, odgrywają istotną rolę zarówno w rozwoju tendinopatii, jak i w odbudowie funkcjonalnej i strukturalnej po tendinopatii. W związku z tym przydatna byłaby metoda, która może in vitro naśladować różnicowanie in vivo TDSC w komórki ścięgien. W tym przypadku niniejszy protokół opisuje metodę opartą na trójwymiarowym (3D) jednoosiowym systemie rozciągania w celu stymulacji TDSC do różnicowania się w tkanki przypominające ścięgna. Istnieje siedem etapów obecnego protokołu: izolacja TDSC myszy, hodowla i ekspansja TDSC myszy, przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego, tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej, przygotowanie konstrukcji komórek macierzystych ścięgna 3D, montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej oraz ocena mechanicznie stymulowanej tkanki przypominającej ścięgno in vitro. Skuteczność wykazano za pomocą badania histologicznego. Cała procedura trwa niecałe 3 tygodnie. Aby pobudzić odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej, w pożywce do hodowli stymulacyjnej zastosowano kwas askorbinowy o stężeniu 4,4 mg/mL. Oddzielona komora z silnikiem liniowym zapewnia dokładne obciążenie mechaniczne i jest przenośna i łatwa do regulacji, co jest stosowane w bioreaktorze. Reżim obciążenia w niniejszym protokole wynosił 6% obciążenia, 0,25 Hz, 8 godzin, po których następowało 16 godzin odpoczynku przez 6 dni. Protokół ten może naśladować różnicowanie komórek w ścięgnie, co jest pomocne w badaniu patologicznego procesu tendinopatii. Co więcej, tkanka przypominająca ścięgno jest potencjalnie wykorzystywana do wspomagania gojenia się ścięgien w urazie ścięgna jako zmodyfikowany przeszczep autologiczny. Podsumowując, obecny protokół jest prosty, ekonomiczny, powtarzalny i ważny.

Przed stymulacją mechaniczną komórki TDSCs hodowano do 10% konfluencji w medium kompletnym, wykazując niezorganizowaną morfologię ultrastrukturalną (Ryc. 2A). Po 6 dniach jednoosiowego rozciągania mechanicznego macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz ustawienie komórek były dobrze zorientowane (Ryc. 2B). Po obciążeniu mechanicznym komórki były liczne i dobrze otoczone przez ECM. Wykazano, że morfologia komórek była wydłużona i bardziej zbliżona do normalnych komórek ścięgnistych w porównani...

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

Różne parametry obciążenia mechanicznego mogą indukować komórki macierzyste pochodzące ze ścięgien zróżnicowane w różne komórki. Przedstawiamy szczegółowy proces zastosowania tego trójwymiarowego jednoosiowego systemu bioreaktora do stymulacji mechanicznej do indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien. Tendinopatia jest jednym z najczęstszych urazów sportowych na oddziale ortopedycznym.Obecność tendinopatii Achillesa jest najczęstsza i wynosi do 29% u biegaczy średnio- i długodystansowych, podczas gdy obecność tendinopatii rzepki jest również wysoka u sportowców siatkówki, koszykówki, lekkoatletyki, piłki ręcznej i piłki nożnej. Jednak ze względu na ograniczoną zdolność ścięgna do samoleczenia i brak skutecznego leczenia, tendinopatia nadal ma znaczący niekorzystny wpływ na jakość życia pacjentów. Komórki STEM pochodzące ze ścięgien, znane jako TDSC jako ważne komórki prekursorowe komórek ścięgien, odgrywają ważną rolę w rozwoju tendinopatii, a także w ich funkcjonalnym i strukturalnym odbudowie po tendinopatii.Jednak różne od mechanicznych parametry obciążenia, takie jak naprężenie obciążenia, częstotliwość obciążenia, rodzaj obciążenia i okres obciążenia, mogą powodować różnicowanie TDSC w różne komórki. Tak więc skuteczny i ważny reżim obciążenia mechanicznego jest bardzo istotny dla genezy ścięgien. Istnieje siedem etapów obecnego protokołu, w tym izolacja TDSC myszy, hodowla i ekspansja TDSC myszy, przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego, tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej, przygotowanie konstrukcji komórek STEM ścięgien 3D, montaż jednoosiowego kompleksu stymulacji mechanicznej rozciągającej komórki oraz ocena mechanicznie stymulowanej tkanki przypominającej ścięgno in vitro.Izolacja myszy TDSC. Stosowana u myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni przez zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz ścięgna rzepki i ścięgna Achillesa.Trawić ścięgno sześciomililitrową kolagenazą typu 1 przez trzy godziny. Zebrać komórki i hodować je w kompletnym alfa MEM zawierającym 10% FBS i 1% mieszaniny streptomycyny i penicyliny przez siedem dni. zidentyfikować TDSC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej, ekspresji markerów powierzchniowych komórek, w tym CD44, CD90 i Sca-1.Brak ekspresji CD34 i CD45. Przejście i zamrożenie komórek. Komórki pasażowe zostaną wykorzystane do dalszych kroków.Hodowla i ekspansja myszy TDSC. Weźmy rozgrzane komórki macierzyste ścięgien myszy. Powoli dodawaj dodatkowe cztery do pięciu mililitrów kompletnego alpha MEM.Przenieść mieszaninę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą pipety. Uzupełnij pożywką do łącznie ośmiu mililitrów za pomocą pipety. Umieść probówkę w wirówce, aby dobrze wyważyć.Odwirować komórki o masie 347 g przez pięć minut. Wyjmij probówkę z wirówki. Sprawdź pellet na dole.Zdekantować wolne podłoże. Delikatnie ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu o pojemności od jednego do dwóch mililitrów. Unikaj robienia zbyt wielu bąbelków.Przenieść ponownie zawieszone komórki do kolby T75 za pomocą pipety. Za pomocą pipety dodaj do kolby kompletną pożywkę alfa MEM, aby osiągnąć całkowitą objętość 10 mililitrów przy końcowym stężeniu 13 000 komórek na centymetr kwadratowy. Umieścić kolbę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla.Zmieniaj podłoże co trzy dni. Obserwuj i monitoruj komórki pod mikroskopem podczas zmiany pożywki, aż komórki zostaną wyhodowane do 100% zbieżności. Przygotowanie pożywki do hodowli stymulacyjnej do tworzenia arkusza komórkowego.Wlej 15 mililitrów kompletnej pożywki alpha MEM do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj sześć mikrolitrów kwasu askorbinowego do 15 mililitrów pożywki do końcowego stężenia 4,4 mikrograma na mililitr. Mieszaj delikatnie, odwracając górę idół.Tworzenie arkusza komórkowego przez hodowlę w pożywce stymulującej. Ostrożnie wyrzuć nienormalną kompletną pożywkę alfa MEM. Unikać dotykania komórek przymocowanych do dna kolby.Powoli dodawaj 10 mililitrów pożywki stymulującej. Unikaj powodowania jakichkolwiek zakłóceń w całkowicie zlewających się komórkach. Hoduj komórki w pożywce stymulacyjnej przez dziewięć dni i zmieniaj pożywkę co trzy dni, aby wystarczająco wytworzyć arkusz komórek w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenku węgla.Przygotowanie konstrukcji komórek macierzystych ścięgien 3D. Wyjąć kolbę z inkubatora. Całkowicie wyrzuć pożywkę stymulującą.Przemyć jednowarstwowy arkusz komórek PBS, obracając kolbą. Całkowicie wyrzuć PBS. Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny do rogu kolby.Postukaj w róg kolby, aby odłączyć jednowarstwowy arkusz komórek, aż róg arkusza komórek zmyje się z dna kolby. Natychmiast dodaj dziewięć mililitrów kompletnej pożywki alpha MEM, aby zatrzymać reakcję trypsynizacji. Kontynuować obracanie kolby, aby całkowicie oderwać jednowarstwowy arkusz komórek.Wylej całość, aby przymocować arkusz komórek do szalki Petriego z podłożem. Użyj sterylnej pęsety, aby podnieść jeden róg arkusza komórek i obróć w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara 15 razy. Podnieś drugi koniec arkusza komórkowego i obróć go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara przez 10 razy, aby sformułować konstrukcję in vitro przypominającą ścięgno.Montaż jednoosiowo-rozciągającego kompleksu stymulacji mechanicznej w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze. Połącz haczyki za pomocą złącza, a następnie dopasuj do dwóch centymetrów między dwoma haczykami. Delikatnie nawiń konstrukcję 3D TDSC na hak demonstracyjny trzy razy na każdym haku.Przymocuj haki z konstrukcją komórkową do komory bioreaktora, dokręcając na dwóch końcach. Napełnij komorę kompletną pożywką alpha MEM. Podłącz akcelerator do komory hodowlanej za pomocą.Przetnij łącznik haczyków za pomocą sterylnej pęsety. Włącz kontroler zasilania i kanałów, aby rozpocząć stymulację mechaniczną. Załóż pokrywę na komorę, śledź lampki kontrolne i upewnij się, że bioreaktor może działać prawidłowo.Umieść bioreaktor w inkubatorze i poddaj konstrukcję komórkową 3D mechanicznemu rozciąganiu. Reżim obciążenia to 6% obciążenia, częstotliwość 0,25 Hz, osiem godzin, a następnie 16 godzin odpoczynku przez sześć dni. Ocena tkanki ścięgnistej stymulowanej mechanicznie in vitro.Poluzuj śrubokrętem i ostrożnie zdejmij zespół. Umieść tkankę przypominającą ścięgno w 4% PFA w celu utrwalenia na 15 minut, umieść utrwaloną tkankę przypominającą ścięgno w kasecie biopsyjnej z biopsją od zwierząt domowych. Proces odwadniania próbki.I na koniec, oceń na podstawie pozycji histologicznej HD. Powtórz cały protokół i wyekstrahuj RNA z tkanki przypominającej ścięgno w celu oceny ekspresji markerów tenogennych za pomocą qPCR. Przed stymulacją mechaniczną, TDSC osiągną 100% konfluencję w kompletnym pożywce i będą wykazywać zdezorganizowaną zewnętrzną morfologię strukturalną.Po sześciu dniach można było zaobserwować rozciąganie, obciążenie mechaniczne, matrycę pozakomórkową, a wyrównanie komórek było dobrze zorientowane. Komórki były dobrze wypełnione i dobrze otoczone ECM po mechanicznym obciążeniu. Przedstawiono morfologię komórek zlokalizowanych i była bardziej podobna do normalnych komórek ścięgien w porównaniu do tych bez rozciągania.Gęstość komórek w konstrukcji komórkowej z obciążeniem była wyższa niż w przypadku bez obciążenia. Wyniki qPCR wykazały, że obecne sprawy zwiększyły ekspresję markerów tenogennych, w tym twardziny, irokeza, tenomoduliny i kolagenu typu 1 w porównaniu z tymi leczonymi podaną hodowlą. Jeśli chodzi o system bioreaktora do stymulacji mechanicznej, w naszym obecnym protokole zastosowano oddzielną komorę z silnikiem liniowym.Ponieważ może zapewnić dokładne obciążenie mechaniczne, jest przenośny i łatwy do regulacji w porównaniu ze sposobami, w jakie tradycyjny arkusz komórek 2D i rozciąganie dwuosiowe, konstrukcja komórki 3D jest bardziej podobna do rzeczywistego kształtu ścięgna. A rozciągnięcie jednoosiowe jest bardziej podobne do charakterystyki mocnych stron komórek ścięgien. Stanowi to teoretyczną podstawę wykorzystania jednoosiowego systemu rozciąganego 3D do stymulowania różnicowania TDSC.W ten sposób arkusze komórek 2D zostały ostatecznie przekierowane do konstrukcji komórki 3D i przeszły jednoosiowe w obecnym protokole. Zgodnie z naszym systemem bioreaktorów, nasz reżim obciążenia to 6% obciążenie, częstotliwość 0,25 Hz, osiem godzin, a następnie 16-godzinny odpoczynek przez sześć dni. Na koniec wykazano skuteczność protokołu na podstawie morfologii i poziomu ekspresji markerów tenogennych.Cały proces operacji jest prosty, ale operator musi zwracać uwagę, aby środowisko TDSC było zawsze wysterylizowane. Istnieje wiele zastosowań naszego protokołu. Proces stymulowania TDSC do naśladowania różnicowania in vivo jest pomocny w badaniu patologicznego procesu tendinopatii.Poza tym protokół ten zapewnia powtarzalną metodę ukierunkowanego różnicowania TDSC w tkankę podobną do ścięgien. Dzięki temu można go łatwo i skutecznie wykorzystać do potencjalnej inżynieryjnej hodowli ścięgien. Podsumowując, zastosowanie jednoosiowego systemu bioreaktora do stymulacji mechanicznej 3D jest prostą, ekonomiczną, powtarzalną i ważną metodą indukowania różnicowania tenogennego TDSC.Nasz protokół szczegółowo opisuje cały proces.

applying-three-dimensional-uniaxial-mechanical-stimulation-bioreactor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Powszechnie wiadomo, że siły mechaniczne w organizmie mogą wpływać na różnicowanie i proliferację komórek. Przedstawiamy protokół wideo demonstrujący zastosowanie bioreaktora zbudowanego na zamówienie do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek macierzystych hodowanych na elastycznych podłożach z mikrowzorami.

Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.

Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych

Przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (TMS) jest nieinwazyjnym narzędziem służącym do badania fizjologii i funkcji ludzkiego układu nerwowego. W niniejszym materiale przedstawiamy nasze techniki TMS wykorzystywane do badania pobudliwości korowej mięśni kończyny górnej oraz mięśni lędźwiowych.

Wykorzystanie przezczaszkowej stymulacji magnetycznej do badania ludzkiego układu nerwowo-mięśniowego

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Badamy zastosowanie powtarzalnej przezczaszkowej stymulacji magnetycznej (rTMS) w celu poprawy zdolności językowych u pacjentów z przewlekłym udarem mózgu i niepłynną afazją.  Po zidentyfikowaniu miejsca w prawym zakręcie czołowym dla każdego pacjenta, które optymalnie reaguje na stymulację, celujemy w to miejsce podczas dziesięciu dni leczenia rTMS.

Wykorzystanie powtarzalnej przezczaszkowej stymulacji magnetycznej w celu poprawy funkcji językowych u pacjentów po udarze mózgu z przewlekłą afazją niepłynną

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Poznaj zastosowanie trójwymiarowego bioreaktora z jednoosiową stymulacją mechaniczną do indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien w badaniach nad leczeniem tendinopatii.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Przeglądaj więcej filmów