Usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (Oikopleura dioica)
16 czerwca 2020
Oikopleura dioica to organizm modelowy osłonic w różnych dziedzinach biologii. Opisujemy metody pobierania próbek, identyfikację gatunków, konfigurację hodowli i protokoły hodowli zwierząt i paszy dla glonów. Zwracamy uwagę na kluczowe czynniki, które przyczyniły się do wzmocnienia systemu kultury oraz omawiamy możliwe problemy i rozwiązania.
Protokół ten wizualnie pokazuje, w jaki sposób ustanowić długoterminowy, niezawodny system hodowli osłonic morskich pelagicznych Oikopleura dioica. System hodowli Oikopleura zapewnia podstawowe zasoby do badania szerokiego zakresu dziedzin biologicznych związanych z ekologią, rozwojem, genomiką i ewolucją. Gatunek ten ma krótki cykl życiowy, wysoką płodność i można go łatwo zebrać z brzegu, co czyni go doskonałym organizmem modelowym.
Chociaż ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem O.dioica, mamy nadzieję, że można go zastosować do innych organizmów planktonowych. Na początek zainicjuj pokarm dla glonów, aby podtrzymać kulturę Oikopleura, zaczynając od autoklawowania przefiltrowanej wody morskiej. Aby zainicjować hodowlę podstawową Chaetoceros calcitrans, 60 mililitrów autoklawowanej wody morskiej uzupełniono następującymi składnikami: 30 mikrolitrów witamin, 30 mikrolitrów roztworu A, 15 mikrolitrów krzemianu sodu i 60 mikrolitrów streptomycyny.
Na koniec dodano 30 mikrolitrów C.calcitrans z poprzedniej kultury podstawowej jako inokulant. Patrz tabela druga w manuskrypcie dotycząca objętości suplementów i inokulacji dla innych gatunków glonów i typów kultur. Po zaszczepieniu stado i subkultury są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 17 stopni Celsjusza przy ciągłym oświetleniu.
Po około 10 dniach wzrost glonów potwierdza się poprzez zabarwienie kolb. W takim przypadku należy przenieść kultury wyjściowe do długoterminowego przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca, utrzymując subkulturę w tym samym inkubatorze. Aby stworzyć działającą kulturę, dodaj niezbędne suplementy do 400 milili autoklawizowanej wody morskiej i zaszczep 100 mililitrami poprzedniej subkultury.
Uszczelnij kolbę gumową nakrętką, włóż jednorazową pipetę o grubości jednego mili i przenieś je do stacji glonów i utrzymuj w temperaturze pokojowej z ośmiogodzinnym fotoperiodem i stałym napowietrzaniem. Ręcznie wirować kultury glonów dwa razy dziennie, aby zapobiec agregacji na dnie kolby. Po ustaleniu kultur glonów należy pobrać próbki terenowe w lokalnym miejscu.
Zarzuć sieć planktonową i pozwól, aby worek dorsza opadł od jednego do dwóch metrów pod powierzchnię. Holuj sieć z prędkością około 5 do jednego metra na sekundę. Kontynuuj holowanie tam iz powrotem przez od dwóch do pięciu minut.
Czas holowania powinien być dostosowany do obfitości planktonu na miejscu. Po zaholowaniu ostrożnie wyjmij siatkę i powoli przenieś zawartość worka dorsza do szklanej butelki o pojemności 500 milicali. Napełnij butelkę do krawędzi, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby powodować stres u zwierząt podczas transportu.
Na tym etapie obecność Oikopleura można potwierdzić, oglądając butelki z próbkami na ciemnym tle. Jednak do identyfikacji na poziomie gatunku wymagana jest obserwacja mikroskopowa. Powtarzaj ten proces, aż zostaną zebrane trzy butelki o pojemności 500 mil.
Zbierz powierzchniową wodę morską, aby zarejestrować zasolenie, temperaturę i stężenie chlorofilu za pomocą profilera CTD. Dodatkowo zbierz od 10 do 15 litrów wody morskiej na miejscu, aby pomóc zwierzętom zaaklimatyzować się do warunków laboratoryjnych. Aby zaaklimatyzować zwierzęta, należy przygotować stosunek jeden do jednego powierzchni wody morskiej z miejsca pobierania próbki i przefiltrowanej wody morskiej przechowywanej w laboratorium.
Ostateczna objętość powinna być dostosowana do od pięciu do 10 litrów, w zależności od stężenia próbki planktonu. Ostrożnie dodać 500-milimetrową próbkę do przygotowanej zlewki. Za pomocą łopatki przymocowanej do silnika synchronicznego obracającego się z prędkością 15 obr./min utrzymuj plankton w zawieszeniu przez noc.
Następnego ranka sprawdź ocznie obecność Oikopleura. Przenieś zwierzęta na szalkę Petriego i obserwuj pod mikroskopem ciemnego pola ustawionym na powiększenie od 20 do 40 razy w celu uzyskania pozytywnej identyfikacji. Oikopleura są scharakteryzowane jako zwierzęta w kształcie kijanek falujące ogonami wewnątrz półprzezroczystego domu.
Aby potwierdzić O.dioica, szukaj w pełni dojrzałych samców z żółtymi gonadami lub samic z jajami. Jeśli zwierzęta są niedojrzałe, poszukaj obecności dwóch komórek podstrunowych w dystalnej połowie ogona. Są one obecne zarówno u dojrzałych, jak i niedojrzałych zwierząt.
Gdy gatunek zostanie potwierdzony, przenieś je na nową szalkę Petriego. Powtarzaj ten proces, aż 10 do 20 osobników zostanie potwierdzonych na poziomie gatunku. Jeśli nie zostaną znalezione żadne O.dioica, trzymaj zlewkę w stanie mieszania przez dodatkowy dzień lub dwa.
Małe O.dioica, które początkowo nie były możliwe do zaobserwowania, będą nadal rosły i staną się łatwiejsze do zauważenia. Jeśli po upływie tygodnia nie wystąpi żaden plik, należy wyrzucić próbkę i spróbować ponownie pobrać próbę. W celu ustanowienia monokultury należy wyizolować 120 O.dioica z próbki polowej w pięciu litrach przefiltrowanej wody morskiej.
Następnego ranka szukaj w pełni dojrzałych samców zidentyfikowanych przez żółte gonady i samic z jajami, które wyglądają jak lśniące, złote kule. Przygotuj zlewkę tarłową, delikatnie przenosząc 15 samców i 30 samic za pomocą pięciomilimetrowej, pipety do zlewki zawierającej 2,5 litra przefiltrowanej wody morskiej. Aby zminimalizować stres fizyczny podczas ręcznego przenoszenia, powoli wypuszczaj zwierzęta pod powierzchnię nowej wody morskiej.
Pozwól odizolowanym dorosłym osobnikom na naturalne tarło. Po tarle udane zapłodnienie można potwierdzić, pobierając od pięciu do 10 mililitrów wody morskiej z dna zlewki tarłowej i identyfikując jaja z rozszczepieniami pod mikroskopem. Pierwszego ranka po tarle, pierwszego dnia, w zlewce powinno pojawić się nowe pokolenie młodych zwierząt z nadmuchanymi domami.
Użyj ręcznej zlewki o pojemności 500 milicali, aby delikatnie przenieść zwierzęta do nowej zlewki zawierającej 7,5 litra świeżej, przefiltrowanej wody morskiej. Powoli wylewaj zawartość na powierzchnię, aby zminimalizować turbulencje i siły ścinające. Drugiego dnia po tarle, drugiego dnia, ręcznie przenieś 150 zwierząt do nowej zlewki zawierającej pięć litrów świeżej, przefiltrowanej wody morskiej.
Trzeciego dnia po tarle, trzeciego dnia, ręcznie przenieś 120 zwierząt do nowej zlewki z pięcioma litrami świeżej, przefiltrowanej wody morskiej. Do czwartego dnia, dojrzałe płciowo, dorosłe zwierzęta powinny być obecne. Zbierz 15 samców i 30 samic, aby uzyskać nową zlewkę tarłową z 2,5 litra przefiltrowanej wody morskiej, aby zainicjować następne pokolenie.
Proces ten jest powtarzany i utrzymywany przez całe życie kultury. Aby utrzymać monokulturę O.dioica, pokarm z glonów jest przygotowywany codziennie z kultur roboczych. Zwierzęta karmione są trzy razy dziennie.
Przygotuj codzienne jedzenie, mierząc absorbancję kultury roboczej za pomocą spektrofotometru ustawionego na 660 nanometrów. Wartości absorbancji, docelowe objętości kultur O.dioica i dojrzałość zwierząt umieszcza się w przygotowanym arkuszu kalkulacyjnym na podstawie wcześniej wyznaczonej krzywej wzrostu glonów w celu obliczenia dokładnej objętości glonów potrzebnej do karmienia w ciągu dnia. Odpipetować obliczone objętości do probówek o grubości 50 mil i odwirować przy 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Powoli wylej supernatant i ostrożnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić granulowane glony. Napełnij probówki do ich pierwotnej objętości świeżą, przefiltrowaną wodą morską. Opierając się na dziennym wykresie nawożenia glonami z arkusza kalkulacyjnego, podaj określoną ilość do każdej zlewki o godzinie 9 rano.
godz. 12 i 17 Automatyczną pompę dozującą można ustawić tak, aby karmiła zwierzęta o godzinie 17:00.
w weekendy bez obecności personelu zajmującego się hodowlą. Po każdym karmieniu utrzymuj przygotowany pokarm dla glonów w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia przy następnym karmieniu. O.dioica może być zbierana z portu poprzez delikatne holowanie zmodyfikowanej sieci planktonowej wyposażonej w 100-mikronowe oczka i niefiltrujący worek włoka.
Pobieranie próbek w latach 2015-19 wykazało sezonową zmienność obecności O.dioica w portach Okinawy. Temperatura powierzchniowej wody morskiej wydawała się wpływać na obecność zwierząt. O.dioica dominowała, gdy temperatura powierzchniowej wody morskiej wynosiła 28 stopni lub więcej.
O.dioica współistniała z Oikopleura longicauda w temperaturach od 24 do 27 stopni. Jednak O.longicauda dominowała w temperaturach poniżej 23 stopni. Zmiany zasolenia nie korelowały z liczebnością O. dioica.
Trzy najważniejsze czynniki dla ustanowienia stabilnych systemów hodowli O.dioica to utrzymanie wysokiej jakości wody za pomocą wieloetapowego systemu filtracji, określenie optymalnego reżimu żywienia, najlepiej poprzez stworzenie standardowych krzywych glonów, oraz przygotowanie zlewek tarłowych z wystarczającą liczbą samców i samic. Zgodnie z dostarczonym protokołem, cykl życia O.dioica wynosi cztery dni w temperaturze 23 stopni. Udało nam się stworzyć sześć niezależnych populacji O.dioica, z których wszystkie przetrwały ponad 20 pokoleń.
Podsumowując, ustanowienie stabilnej kultury O.dioica może być wykonane szybko i tanio. Przy odpowiedniej konfiguracji stabilną kulturę można osiągnąć w ciągu jednego tygodnia. W połączeniu z małym genomem i szybkim cyklem życiowym sprawia to, że O.dioica jest potężnym gatunkiem modelowym.
O.dioica może być utrzymywana zarówno w sztucznej, jak i naturalnej wodzie morskiej. Długotrwałe przechowywanie pokarmu z glonów jest możliwe przy użyciu stałej kultury i kriokonserwacji. Ponadto plemniki O.dioica mogą być również kriokonserwowane i zachowują żywotność przez ponad rok.
O.dioica nadal dostarcza potężnych informacji na temat różnych dziedzin biologii. Zrozumienie lokalnej sezonowości, skrupulatny system hodowli i kilka oddanych osób pozwalają na stworzenie skutecznej kultury przy niewielkim wysiłku.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje ustanowienie niezawodnego systemu hodowli morskiego uropu Oikopleura dioica, organizmu modelowego wykorzystywanego w różnorodnych badaniach biologicznych. Przedstawiono w nim metody pobierania prób, identyfikację gatunku oraz protokoły hodowli, ze szczególnym uwzględnieniem kluczowych czynników warunkujących skuteczne utrzymanie kultur.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia morska
- Ekologia
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Oikopleura dioica to urokiszecznika o krótkim cyklu życiowym i wysokiej płodności.
- Można go łatwo pozyskać ze środowisk przybrzeżnych.
- Gatunek ten stanowi doskonały model do badania różnych procesów biologicznych.
- Zoptymalizowane protokoły mogą przynieść korzyści w badaniach nad innymi organizmami planktonowymi.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowego protokołu hodowli Oikopleura dioica.
- Ułatwienie badań w zakresie ekologii, rozwoju, genomiki i ewolucji.
- Pogłębienie zrozumienia systemów hodowlanych dla organizmów morskich.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki algowej z użyciem autoklawowanej wody morskiej i specyficznych suplementów.
- Pobieranie próbek terenowych przy użyciu sieci planktonowych.
- Mikroskopowa identyfikacja Oikopleura dioica.
- Tworzenie monokultur poprzez staranne protokoły przenoszenia i rozmnażania.
Główne wyniki
- Skuteczne ustanowienie systemu długoterminowej hodowli Oikopleura dioica.
- Metody identyfikacji potwierdziły obecność i dojrzałość gatunku.
- Opracowano protokoły tarła oraz utrzymywania hodowli.
- Przedstawiono wytyczne dotyczące aklimatyzacji i utrzymania hodowli.
Wnioski
- Badanie przedstawia kompleksowe podejście do hodowli Oikopleura dioica.
- Wyniki można zastosować do innych gatunków planktonowych.
- Ustanowienie wiarygodnych systemów hodowlanych jest kluczowe dla przyszłych badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie niezawodnych systemów hodowlanych dla morskich organizmów modelowych, takich jak Oikopleura dioica, wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odkrywaniu leków w biofarmacji. Szybki cykl życiowy tego gatunku, konserwatywne szlaki rozwojowe oraz podatność genomowa umożliwiają wysokoprzepustowe przesiewy fenotypowe i translacyjne badania biomarkerów. Przedstawiony schemat pracy zapewnia skalowalną i powtarzalną platformę do oceny wpływu związków w systemie istotnym dla danej choroby, co pozwala na zmniejszenie niepewności biologicznej przed optymalizacją związku wiodącego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie konserwowanych szlaków rozwojowych i sieci regulacji genów u chordatów, które mają znaczenie dla mechanizmów chorób ludzkich.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez szybkie fenotypowanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych w kontekście całego organizmu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie modulacji celu z obserwowalnymi efektami rozwojowymi lub behawioralnymi w modelu genetycznie podatnym na manipulacje.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Zapewnia zestandaryzowany, mierzalny system biologiczny do przygotowywania płytek do screeningu związków z jednolitym stopniem rozwoju.
- Skalowalność: Wysoka płodność i zapłodnienie zewnętrzne umożliwiają zbiór embrionów na dużą skalę do fenotypowych analiz w płytkach wielodołkowych.
- Powtarzalność: Określone reżimy karmienia i kontrola środowiskowa redukują zmienność, wspierając standaryzację analizy w różnych zespołach i ośrodkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Zachowane szlaki apoptozy, metabolizmu i sygnalizacji umożliwiają modelowanie fenotypów ludzkich chorób w celu potwierdzenia punktu uchwytu.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od walidacji trafienia w punkt uchwytu do przedklinicznych badań skuteczności w systemie strunowców z wykorzystaniem narzędzi genomowych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Umożliwia wczesną ocenę toksyczności związku oraz mechanizmu działania, co dostarcza informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań przed etapem badań na ssakach.
Integracja potoku i przepływu pracy
System hodowli Oikopleura dioica integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, wspierając walidację celów poprzez screening fenotypowy oraz analizy mechanistyczne przed identyfikacją związków wiodących i rozwojem przedklinicznym.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących funkcji genów i aktywności szlaków sygnałowych poprzez obserwowalne fenotypy w żywym modelu strunowca.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe odczyty o wysokiej zawartości informacji, takie jak morfologia, motywność i reportery fluorescencyjne, do oceny efektów działania związków.
- Analityka: Wspiera obrazowanie time-lapse, zautomatyzowaną analizę obrazu oraz statystyczne porównanie populacji traktowanych względem kontrolnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne ustalenia dotyczące mechanizmu działania z walidacją przedkliniczną poprzez konserwatywne szlaki związane z chorobami.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy odnawialny, niskokosztowy w utrzymaniu zasób biologiczny do powtarzalnych kampanii przesiewowych i projektów walidacji celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w genetycznie dostępnym modelu strunowców.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność dzięki zdefiniowanym protokołom karmienia, tarła oraz utrzymywania hodowli.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej biologicznej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko w oparciu o walidację fenotypową w systemie całego organizmu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli bezkręgowców morskich, mikroskopii oraz technikach hodowli alg.
- Wymaga dostępu do inkubatorów, spektrofotometrów do ilościowego oznaczania alg oraz systemów filtracji sterylnej do przygotowania wody morskiej.
- Wymaga standaryzacji harmonogramów karmienia, kontroli środowiskowych i procedur obchodzenia się ze zwierzętami pomiędzy zespołami.
- Uwzględnia kwestie adaptacji do różnych punktów końcowych eksperymentu, takich jak obrazowanie fluorescencyjne lub testy behawioralne.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak sezonowa dostępność podczas pobierania próbek w terenie oraz konieczność ciągłej produkcji pożywki z alg.
