Name: Usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (Oikopleura dioica) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Poznaj metodę pobierania próbek i hodowlę Oikopleura dioica, modelowego organizmu morskiego o krótkim cyklu życiowym. Protokół umożliwia badania w ekologii, rozwoju i genomice.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Garthowi Ilsleyowi za jego wsparcie w ustanowieniu systemu kultury. Doceniamy wkład Ritsuko Suyamy i Sylvaina Guillota we wczesne pobieranie próbek i identyfikację gatunków. Specjalne podziękowania należą się Hiroki Nishidzie, Takeshiemu Onumie i Tatsuyi Omotezako za ich hojne wsparcie i wskazówki przez cały czas, w tym za początkowe ustanowienie lokalnego systemu hodowli oraz dzielenie się zwierzętami i kulturą mikroglonów. Dziękujemy również Danielowi Chourroutowi, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristianowi Cañestro i Alfonso Ferrándezowi-Roldánowi za podzielenie się swoją wiedzą na temat pobierania próbek i hodowli. Jai Denton, Charles Plessy i Jeffrey Jolly dostarczyli bezcennych informacji zwrotnych na temat rękopisu. Charlotte West sformułowała uogólnione równanie do obliczania glonów. Na koniec dziękujemy OIST za dofinansowanie, Mary Collins i Komitetowi Bezpieczeństwa Pracy w Terenie OIST za porady dotyczące bezpiecznych procedur pobierania próbek, personelowi warsztatu mechanicznego OIST za budowę sprzętu do hodowli i pobierania próbek oraz Koichi Toda za dostarczanie wody morskiej.

Autor nie ma nic do zadeklarowania.

Aby ułatwić elastyczność w zakładaniu hodowli O. dioica, ważne jest zrozumienie naturalnego środowiska zwierząt. Dane sezonowe dostarczają informacji o zakresach parametrów fizycznych, które można wykorzystać do określenia warunków hodowli laboratoryjnej. Pomaga również w zrozumieniu sezonowych wahań liczebności zwierząt. Na Okinawie O. dioica jest najbardziej niezawodnie spotykany od czerwca do października. Jednak w Zatoce Tokijskiej szczyt populacji przypada na luty i październik41 roku. Chociaż hodowla O. dioica jest często zgłaszana w temperaturze 20 °C lub niższej 27,28,29, O. dioica z Okinawy wykazuje lepszą przeżywalność w temperaturach powyżej 20 °C; Można to wytłumaczyć faktem, że minimalna temperatura powierzchniowej wody morskiej na Okinawie wynosi ~20 °C (rys. 6). Na liczebność O. dioica mogą mieć również wpływ zakwity fitoplanktonu42 i liczebność drapieżników43,44. Niezależnie od tego, gdzie zbierane są O. dioica, zrozumienie sezonowości lokalnych populacji maksymalizuje szansę na pobranie próbek i sukces hodowlany.
Biorąc pod uwagę odpowiednią porę roku i lokalizację, pobieranie próbek netto jest skutecznym sposobem zbierania dużych ilości Oikopleura przy minimalnym wysiłku. Siatki planktonowe o mniejszym rozmiarze oczek (60-70 μm) mogą być również używane do zbierania wszystkich stadiów zwierząt. W pełni dojrzałe zwierzęta rzadko znajdują się w sieci, być może ze względu na ich kruchość pod koniec cyklu życia. W związku z tym identyfikację gatunków, a następnie pobieranie próbek, uzyskuje się poprzez obserwację mikroskopową komórek podstrunowcowych. Dojrzałe osobniki zwykle pojawiają się jeden lub dwa dni po pobraniu próbki, ponieważ zwierzęta nadal rosną w laboratorium. Chociaż pobieranie próbek netto jest skuteczne, w innych okolicznościach mogą być konieczne alternatywne metody pobierania próbek. Na przykład pobieranie próbek netto w pobliżu obszarów miejskich może gromadzić duże ilości fitoplanktonu, co utrudnia wyizolowanie Oikopleury. W takich przypadkach zaleca się proste pobieranie próbek z wiadra w celu pobrania próbek wody powierzchniowej z morza lub z łodzi z obszarów poza portem. Wyniki pokazały, że stopniowa zmiana zasolenia spowodowana kolejnymi dniami opadów deszczu nie wpłynęła na liczebność O. dioica; Należy jednak unikać pobierania próbek z brzegu bezpośrednio po ekstremalnych zdarzeniach pogodowych, takich jak cyklony tropikalne. Zdarzenia te powodują nagłe i drastyczne zmiany biogeochemiczne w osłoniętym zbiorniku wodnym45,46. Spływ wód burzowych może przenosić zanieczyszczenia, osady i nadmiar składników odżywczych, które zwiększają zmętnienie i obniżają jakość wody47. Plankton filtrujący, taki jak Oikopleura, może być szczególnie podatny na te zmiany ze względu na swój sposób odżywiania się i ograniczoną mobilność. W takiej sytuacji zalecamy odroczenie pobrania próbek o kilka dni, aż lokalne warunki powrócą do normy.
Wprowadzenie wielostopniowego systemu filtracji jest niezbędne do utrzymania małych, filtrujących organizmów, takich jak O. dioica. Wykorzystując słabo przefiltrowaną wodę morską (na przykład siatkę 25 μm w poprzednim systemie hodowli), kultura była często niestabilna, zwłaszcza latem, potencjalnie ze względu na większą obfitość fitoplanktonu. Chociaż niektóre fitoplanktony są korzystne dla wzrostu O. dioica , inne wytwarzają biotoksyny, które mogą powodować nieprawidłowy rozwój zarodków O. dioica 48. Ponadto wysokie stężenie okrzemek, takich jak Chaetoceros spp., jest potencjalnie szkodliwe dla wzrostu O. dioica, ponieważ mogą posiadać długie szczeciny, które mogą zatykać kurnik i uniemożliwiać efektywne żerowanie49. Często obserwowaliśmy, jak domy małych zwierząt są zapychane przez C. calcitrans setae; dlatego teraz karmimy C. calcitrans tylko zwierzętami w 2. dniu i starszych (Tabela 3).
Chociaż nie stanowiło to tutaj problemu, długotrwała hodowla O. dioica na małą skalę może doświadczyć nagłych spadków liczebności populacji z powodu wąskiego gardła genetycznego; w takich przypadkach Martí-Solans i wsp.29 zalecają dodawanie nowych dzikich osobników do kultury co 20 pokoleń.
System hodowli Oikopleura jest elastyczny. Stabilną kulturę można ustanowić w ciągu tygodnia. Długotrwała hodowla O. dioica jest możliwa przy skromnym budżecie przy użyciu niespecjalistycznego sprzętu. Dzienny wysiłek wymagany do utrzymania 5-10 zlewek Oikopleura wynosi na ogół mniej niż 2 godziny przy 2 osobach. O. dioica może być również utrzymywana w sztucznej wodzie morskiej, co jest korzystne dla osób bez dostępu do naturalnej wody morskiej28. Długotrwałe przechowywanie pokarmu z glonów jest możliwe dzięki zastosowaniu hodowli ciał stałych i kriokonserwacji29. Co więcej, plemniki O. dioica mogą być kriokonserwowane i pozostają żywotne przez ponad rok50. Wszystkie te czynniki oznaczają, że kultury można łatwo odtworzyć. Wreszcie, wcześniejsze doświadczenia z przypadkowym hodowlą Pleurobrachia sp. może sugerować, że system hodowli opracowany dla Oikopleura może potencjalnie zostać rozszerzony na szerszą społeczność delikatnych organizmów pelagicznych.
O. dioica nadal dostarcza potężnych informacji na temat różnych dziedzin biologii. Zrozumienie lokalnej sezonowości, skrupulatny system hodowli i kilka oddanych osób pozwalają na stworzenie skutecznej kultury przy niewielkim wysiłku. System hodowli Oikopleura zapewnia podstawowe zasoby do badania szerokiego zakresu dziedzin biologicznych związanych z ekologią, rozwojem, genomiką i ewolucją tego wyjątkowego morskiego strunowca.

Organizmy modelowe odegrały kluczową rolę w rozwiązywaniu wielu problemów biologicznych, w tym związanych z rozwojem, genetyką i fizjologią. Co więcej, dodatkowe organizmy modelowe ułatwiają nowe odkrycia, a zatem mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia natury1,2. Zooplankton morski to zróżnicowane grupy organizmów, które odgrywają ważną rolę w ekosystemach oceanicznych3,4,5,6. Pomimo swojej liczebności i znaczenia ekologicznego, galaretowate organizmy, takie jak osłonice planktonowe, są często niedostatecznie reprezentowane w badaniach nad bioróżnorodnością planktonu, ponieważ ich przezroczystość i kruchość sprawiają, że zbieranie i identyfikacja w terenie są trudne7,8. Dostosowane techniki pobierania próbek i hodowla laboratoryjna pozwalają na dokładniejszą obserwację zwierząt in vitro, co przyczyniło się do pogłębienia wiedzy w zakresie biologii osłonic planktonowych9,10,11,12.
Larwy (Wyrostki robaczkowe) to klasa swobodnie pływających osłonic morskich, obejmująca około 70 opisanych gatunków na całym świecie8,13. Ponieważ są jedną z najliczniejszych grup w zbiorowiskach zooplanktonu14,15,16,17, larwy stanowią główne źródło pożywienia dla większych organizmów planktonowych, takich jak larwy ryb18,19. W przeciwieństwie do workowatych - siedzących osłonic - larw zachowują morfologię podobną do kijanki i pozostają planktoniczne przez całe życie20. Każde zwierzę żyje w samodzielnie zbudowanej, skomplikowanej strukturze filtracyjnej, zwanej domem. Gromadzą cząstki stałe w swoich domach, tworząc prądy wodne poprzez falujący ruch swoich ogonów21. Zapchane domy są wyrzucane w ciągu dnia, niektóre z nich tworzą agregaty węglowe i ostatecznie opadają na dno morskie22; Tak więc larwy odgrywają główną rolę w globalnym przepływie węgla23. Według doniesień większość gatunków żyje w strefie pelagicznej w obrębie górnych 100 m słupa wody13; jednak wiadomo, że gigantyczna larwa Bathochordaeus zamieszkuje głębokości 300 m24. Badanie przeprowadzone na Bathochordaeus w Monterey Bay w Kalifornii ujawniło, że zwierzęta te służą również jako biologiczny wektor mikroplastików, co sugeruje potencjalne znaczenie w zrozumieniu roli wyrostka robaczkowego w pionowym transporcie i dystrybucji mikroplastików w oceanach25.
Oikopleura dioica, gatunek larw, przyciągnął uwagę w ostatnich latach jako organizm modelowy ze względu na kilka niezwykłych cech. Jest powszechnie zgłaszany we wszystkich oceanach świata. Jest szczególnie obfity w wodach przybrzeżnych26, co umożliwia łatwe pobieranie próbek z brzegu. Długotrwała, stabilna hodowla jest możliwa zarówno przy użyciu naturalnej, jak i sztucznej wody morskiej27,28,29. Czas generacji zależny od temperatury wynosi zaledwie 4-9 dni w warunkach laboratoryjnych. Ma wysoką płodność, a każda samica jest w stanie wyprodukować > 300 jaj przez cały rok. Jako osłonica zajmuje ważną pozycję filogenetyczną dla zrozumienia ewolucji strunowców30,31. Przy 70 Mb O. dioica ma najmniejszy zidentyfikowany genom spośród wszystkich strunowców32. Wśród larw O. dioica jest jak dotąd jedynym opisanym gatunkiem niehermafrodytycznym33.
Pierwsza udana hodowla O. dioica z mikroalgami hodowanymi w laboratorium została zgłoszona przez Paffenhöfer34. Oryginalny protokół hodowli wykorzystujący silniki synchroniczne i łopatki został opracowany przez Fenaux i Gorsky35, a następnie przyjęty przez wiele laboratoriów. Niedawno Fujii et al.36 zgłosili hodowlę O. dioica w sztucznej wodzie morskiej, solidny system hodowli i kolekcję terenową zostały opisane przez Bouquet et al.27, a zoptymalizowany protokół dla uproszczonego, przystępnego cenowo systemu został zgłoszony przez Marti-Solans et al.29. Oprócz tradycyjnego systemu hodowli Oikopleura, nowo zgłoszony projekt z podwójnym zbiornikiem hodowlanym ma również potencjał do hodowli Oikopleura sp.37.
Przedstawiamy szczegółowy protokół inicjacji monokultury O. dioica oparty na kombinacji protokołów opracowanych przez główne grupy badawcze Oikopleura w Międzynarodowym Centrum Morskiej Biologii Molekularnej Sars27, Uniwersytet w Barcelonie29, Osaka University28oraz nasze własne obserwacje. We wcześniej opublikowanych protokołach hodowli szczegółowe informacje dotyczące składu pożywek glonów, technik pobierania próbek z brzegu i identyfikacji Oikopleura zostały opisane tylko z grubsza, pozostawiając wiele niejasności. Tutaj, za pomocą informacji wizualnych zawartych w protokole wideo, zebraliśmy wszystkie krytyczne informacje potrzebne do stworzenia kultury O. dioica od podstaw w prosty sposób, krok po kroku. Opisujemy, jak odróżnić O. dioica od innego powszechnie opisywanego gatunku, O. longicauda, co jest jednym z najtrudniejszych kroków. Chociaż istniejące systemy hodowli mają zastosowanie do uprawy O. dioica na całym świecie, podkreślamy znaczenie dostosowania protokołu w oparciu o lokalne warunki środowiskowe. Prezentowane informacje łączą w sobie powszechnie publikowane dane, a także wiedzę zdobytą poprzez doświadczenie. Obecny protokół idealnie nadaje się dla badaczy zainteresowanych stworzeniem kultury od podstaw.

<table><tbody><tr><td>Węgiel aktywny</td><td>Sigma</td><td>C2764-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowe koło pasowe</td><td>Rainbow Products</td><td>10604-10607</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Wako</td><td>021-02195</td><td></td></tr><tr><td>Kobalamina (B12)</td><td>Sigma</td><td>V2876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek kobaltu(II)</td><td>Wako</td><td>036-03682</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II) pięciowodny</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat wersenianu disodowego</td><td>Wako</td><td>044-29525</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat heptamolibdenianu heksaamonu</td><td>Wako</td><td>019-03212</td><td></td></tr><tr><td>Klucz sześciokątny</td><td>Anex</td><td>No.6600</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Żelazo(III) sześciowodny chlorek</td><td>Wako</td><td>091-00872</td><td></td></tr><tr><td>Programowalna automatyczna pompa dozująca Jebao</td><td></td><td>DP-4</td><td></td></tr><tr><td>Pompa magnetyczna</td><td>REI-SEA</td><td>RMD-201</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek manganu(II)</td><td>Wako</td><td>134-15302</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowy filtr z wkładem nawiniętym</td><td>Advantec</td><td>TCW-10N-PPS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TCW-5N-PPS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TCW-1N-PPS Bezśrubowa listwa zaciskowa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SATO PARTS</td><td>SL4500</td><td></td></tr><tr><td>Prosta siatka planktonowa</td><td>RIGO, Japonia</td><td>5512-C</td><td></td></tr><tr><td>Metakrzemian sodu</td><td>Sigma</td><td>307815-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Wako</td><td>195-02545</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny</td><td>MP Biomedicals</td><td>194740</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Synchroniczny silnik elektryczny</td><td>Serwo</td><td>D5N6Z15M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tiaminy</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator UV</td><td>Iwaki</td><td>UVF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>MP Biomedicals</td><td>194858</td><td></td></tr></tbody></table>

usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (oikopleura dioica)

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica to planktoniczny strunowca o wyjątkowej zdolności filtrowania, szybkim czasie generacji, zachowanym wczesnym rozwoju i zwartym genomie. Z tych powodów jest uważany za użyteczny organizm modelowy do morskich badań ekologicznych, ewolucyjnej biologii rozwoju i genomiki. Ponieważ badania często wymagają stałego dopływu zasobów zwierzęcych, przydatne jest stworzenie niezawodnego, łatwego w utrzymaniu systemu hodowli. Tutaj opisujemy krok po kroku metodę tworzenia kultury O. dioica. Opisujemy, w jaki sposób wybrać potencjalne miejsca pobierania próbek, metody pobierania, identyfikację docelowych zwierząt oraz konfigurację systemu hodowli. Udzielamy porad dotyczących rozwiązywania problemów w oparciu o własne doświadczenia. Zwracamy również uwagę na kluczowe czynniki, które pomagają utrzymać solidny system hodowli. Chociaż przedstawiony tutaj protokół hodowli jest zoptymalizowany pod kątem O. dioica, mamy nadzieję, że nasza technika pobierania próbek i konfiguracja hodowli zainspirują nowe pomysły na utrzymanie innych delikatnych bezkręgowców pelagicznych.

Oikopleura dioica to organizm modelowy osłonic w różnych dziedzinach biologii. Opisujemy metody pobierania próbek, identyfikację gatunków, konfigurację hodowli i protokoły hodowli zwierząt i paszy dla glonów. Zwracamy uwagę na kluczowe czynniki, które przyczyniły się do wzmocnienia systemu kultury oraz omawiamy możliwe problemy i rozwiązania.

Usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (Oikopleura dioica)

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Protokół ten wizualnie pokazuje, w jaki sposób ustanowić długoterminowy, niezawodny system hodowli osłonic morskich pelagicznych Oikopleura dioica. System hodowli Oikopleura zapewnia podstawowe zasoby do badania szerokiego zakresu dziedzin biologicznych związanych z ekologią, rozwojem, genomiką i ewolucją. Gatunek ten ma krótki cykl życiowy, wysoką płodność i można go łatwo zebrać z brzegu, co czyni go doskonałym organizmem modelowym.Chociaż ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem O.dioica, mamy nadzieję, że można go zastosować do innych organizmów planktonowych. Na początek zainicjuj pokarm dla glonów, aby podtrzymać kulturę Oikopleura, zaczynając od autoklawowania przefiltrowanej wody morskiej. Aby zainicjować hodowlę podstawową Chaetoceros calcitrans, 60 mililitrów autoklawowanej wody morskiej uzupełniono następującymi składnikami: 30 mikrolitrów witamin, 30 mikrolitrów roztworu A, 15 mikrolitrów krzemianu sodu i 60 mikrolitrów streptomycyny.Na koniec dodano 30 mikrolitrów C.calcitrans z poprzedniej kultury podstawowej jako inokulant. Patrz tabela druga w manuskrypcie dotycząca objętości suplementów i inokulacji dla innych gatunków glonów i typów kultur. Po zaszczepieniu stado i subkultury są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 17 stopni Celsjusza przy ciągłym oświetleniu.Po około 10 dniach wzrost glonów potwierdza się poprzez zabarwienie kolb. W takim przypadku należy przenieść kultury wyjściowe do długoterminowego przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca, utrzymując subkulturę w tym samym inkubatorze. Aby stworzyć działającą kulturę, dodaj niezbędne suplementy do 400 milili autoklawizowanej wody morskiej i zaszczep 100 mililitrami poprzedniej subkultury.Uszczelnij kolbę gumową nakrętką, włóż jednorazową pipetę o grubości jednego mili i przenieś je do stacji glonów i utrzymuj w temperaturze pokojowej z ośmiogodzinnym fotoperiodem i stałym napowietrzaniem. Ręcznie wirować kultury glonów dwa razy dziennie, aby zapobiec agregacji na dnie kolby. Po ustaleniu kultur glonów należy pobrać próbki terenowe w lokalnym miejscu.Zarzuć sieć planktonową i pozwól, aby worek dorsza opadł od jednego do dwóch metrów pod powierzchnię. Holuj sieć z prędkością około 5 do jednego metra na sekundę. Kontynuuj holowanie tam iz powrotem przez od dwóch do pięciu minut.Czas holowania powinien być dostosowany do obfitości planktonu na miejscu. Po zaholowaniu ostrożnie wyjmij siatkę i powoli przenieś zawartość worka dorsza do szklanej butelki o pojemności 500 milicali. Napełnij butelkę do krawędzi, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby powodować stres u zwierząt podczas transportu.Na tym etapie obecność Oikopleura można potwierdzić, oglądając butelki z próbkami na ciemnym tle. Jednak do identyfikacji na poziomie gatunku wymagana jest obserwacja mikroskopowa. Powtarzaj ten proces, aż zostaną zebrane trzy butelki o pojemności 500 mil.Zbierz powierzchniową wodę morską, aby zarejestrować zasolenie, temperaturę i stężenie chlorofilu za pomocą profilera CTD. Dodatkowo zbierz od 10 do 15 litrów wody morskiej na miejscu, aby pomóc zwierzętom zaaklimatyzować się do warunków laboratoryjnych. Aby zaaklimatyzować zwierzęta, należy przygotować stosunek jeden do jednego powierzchni wody morskiej z miejsca pobierania próbki i przefiltrowanej wody morskiej przechowywanej w laboratorium.Ostateczna objętość powinna być dostosowana do od pięciu do 10 litrów, w zależności od stężenia próbki planktonu. Ostrożnie dodać 500-milimetrową próbkę do przygotowanej zlewki. Za pomocą łopatki przymocowanej do silnika synchronicznego obracającego się z prędkością 15 obr./min utrzymuj plankton w zawieszeniu przez noc.Następnego ranka sprawdź ocznie obecność Oikopleura. Przenieś zwierzęta na szalkę Petriego i obserwuj pod mikroskopem ciemnego pola ustawionym na powiększenie od 20 do 40 razy w celu uzyskania pozytywnej identyfikacji. Oikopleura są scharakteryzowane jako zwierzęta w kształcie kijanek falujące ogonami wewnątrz półprzezroczystego domu.Aby potwierdzić O.dioica, szukaj w pełni dojrzałych samców z żółtymi gonadami lub samic z jajami. Jeśli zwierzęta są niedojrzałe, poszukaj obecności dwóch komórek podstrunowych w dystalnej połowie ogona. Są one obecne zarówno u dojrzałych, jak i niedojrzałych zwierząt.Gdy gatunek zostanie potwierdzony, przenieś je na nową szalkę Petriego. Powtarzaj ten proces, aż 10 do 20 osobników zostanie potwierdzonych na poziomie gatunku. Jeśli nie zostaną znalezione żadne O.dioica, trzymaj zlewkę w stanie mieszania przez dodatkowy dzień lub dwa.Małe O.dioica, które początkowo nie były możliwe do zaobserwowania, będą nadal rosły i staną się łatwiejsze do zauważenia. Jeśli po upływie tygodnia nie wystąpi żaden plik, należy wyrzucić próbkę i spróbować ponownie pobrać próbę. W celu ustanowienia monokultury należy wyizolować 120 O.dioica z próbki polowej w pięciu litrach przefiltrowanej wody morskiej.Następnego ranka szukaj w pełni dojrzałych samców zidentyfikowanych przez żółte gonady i samic z jajami, które wyglądają jak lśniące, złote kule. Przygotuj zlewkę tarłową, delikatnie przenosząc 15 samców i 30 samic za pomocą pięciomilimetrowej, pipety do zlewki zawierającej 2,5 litra przefiltrowanej wody morskiej. Aby zminimalizować stres fizyczny podczas ręcznego przenoszenia, powoli wypuszczaj zwierzęta pod powierzchnię nowej wody morskiej.Pozwól odizolowanym dorosłym osobnikom na naturalne tarło. Po tarle udane zapłodnienie można potwierdzić, pobierając od pięciu do 10 mililitrów wody morskiej z dna zlewki tarłowej i identyfikując jaja z rozszczepieniami pod mikroskopem. Pierwszego ranka po tarle, pierwszego dnia, w zlewce powinno pojawić się nowe pokolenie młodych zwierząt z nadmuchanymi domami.Użyj ręcznej zlewki o pojemności 500 milicali, aby delikatnie przenieść zwierzęta do nowej zlewki zawierającej 7,5 litra świeżej, przefiltrowanej wody morskiej. Powoli wylewaj zawartość na powierzchnię, aby zminimalizować turbulencje i siły ścinające. Drugiego dnia po tarle, drugiego dnia, ręcznie przenieś 150 zwierząt do nowej zlewki zawierającej pięć litrów świeżej, przefiltrowanej wody morskiej.Trzeciego dnia po tarle, trzeciego dnia, ręcznie przenieś 120 zwierząt do nowej zlewki z pięcioma litrami świeżej, przefiltrowanej wody morskiej. Do czwartego dnia, dojrzałe płciowo, dorosłe zwierzęta powinny być obecne. Zbierz 15 samców i 30 samic, aby uzyskać nową zlewkę tarłową z 2,5 litra przefiltrowanej wody morskiej, aby zainicjować następne pokolenie.Proces ten jest powtarzany i utrzymywany przez całe życie kultury. Aby utrzymać monokulturę O.dioica, pokarm z glonów jest przygotowywany codziennie z kultur roboczych. Zwierzęta karmione są trzy razy dziennie.Przygotuj codzienne jedzenie, mierząc absorbancję kultury roboczej za pomocą spektrofotometru ustawionego na 660 nanometrów. Wartości absorbancji, docelowe objętości kultur O.dioica i dojrzałość zwierząt umieszcza się w przygotowanym arkuszu kalkulacyjnym na podstawie wcześniej wyznaczonej krzywej wzrostu glonów w celu obliczenia dokładnej objętości glonów potrzebnej do karmienia w ciągu dnia. Odpipetować obliczone objętości do probówek o grubości 50 mil i odwirować przy 5 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Powoli wylej supernatant i ostrożnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić granulowane glony. Napełnij probówki do ich pierwotnej objętości świeżą, przefiltrowaną wodą morską. Opierając się na dziennym wykresie nawożenia glonami z arkusza kalkulacyjnego, podaj określoną ilość do każdej zlewki o godzinie 9 rano.godz. 12 i 17 Automatyczną pompę dozującą można ustawić tak, aby karmiła zwierzęta o godzinie 17:00.w weekendy bez obecności personelu zajmującego się hodowlą. Po każdym karmieniu utrzymuj przygotowany pokarm dla glonów w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia przy następnym karmieniu. O.dioica może być zbierana z portu poprzez delikatne holowanie zmodyfikowanej sieci planktonowej wyposażonej w 100-mikronowe oczka i niefiltrujący worek włoka.Pobieranie próbek w latach 2015-19 wykazało sezonową zmienność obecności O.dioica w portach Okinawy. Temperatura powierzchniowej wody morskiej wydawała się wpływać na obecność zwierząt. O.dioica dominowała, gdy temperatura powierzchniowej wody morskiej wynosiła 28 stopni lub więcej.O.dioica współistniała z Oikopleura longicauda w temperaturach od 24 do 27 stopni. Jednak O.longicauda dominowała w temperaturach poniżej 23 stopni. Zmiany zasolenia nie korelowały z liczebnością O. dioica.Trzy najważniejsze czynniki dla ustanowienia stabilnych systemów hodowli O.dioica to utrzymanie wysokiej jakości wody za pomocą wieloetapowego systemu filtracji, określenie optymalnego reżimu żywienia, najlepiej poprzez stworzenie standardowych krzywych glonów, oraz przygotowanie zlewek tarłowych z wystarczającą liczbą samców i samic. Zgodnie z dostarczonym protokołem, cykl życia O.dioica wynosi cztery dni w temperaturze 23 stopni. Udało nam się stworzyć sześć niezależnych populacji O.dioica, z których wszystkie przetrwały ponad 20 pokoleń.Podsumowując, ustanowienie stabilnej kultury O.dioica może być wykonane szybko i tanio. Przy odpowiedniej konfiguracji stabilną kulturę można osiągnąć w ciągu jednego tygodnia. W połączeniu z małym genomem i szybkim cyklem życiowym sprawia to, że O.dioica jest potężnym gatunkiem modelowym.O.dioica może być utrzymywana zarówno w sztucznej, jak i naturalnej wodzie morskiej. Długotrwałe przechowywanie pokarmu z glonów jest możliwe przy użyciu stałej kultury i kriokonserwacji. Ponadto plemniki O.dioica mogą być również kriokonserwowane i zachowują żywotność przez ponad rok.O.dioica nadal dostarcza potężnych informacji na temat różnych dziedzin biologii. Zrozumienie lokalnej sezonowości, skrupulatny system hodowli i kilka oddanych osób pozwalają na stworzenie skutecznej kultury przy niewielkim wysiłku.

streamlined-sampling-cultivation-pelagic-cosmopolitan-larvacean

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisana metoda przedstawia procedurę, zgodnie z którą mątwka hawajska Euprymna scolopes oraz jej bakteryjny symbiont Vibrio fischeri są hodowane oddzielnie, a następnie łączone w celu umożliwienia specyficznej kolonizacji organu świetlnego mątwy przez bakterie. Opisano metody wykrywania kolonizacji za pomocą luminescencji bakteryjnej oraz poprzez bezpośrednie liczenie kolonii.

Kolonizacja mątwy Euprymna scolopes przez Vibrio fischeri

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej...

Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Protokoły szybkiej oceny biologicznej wykorzystujące makrobezkręgowce bentosowe są często używane do monitorowania i oceny jakości wody. Skuteczny protokół obejmuje kolekcje wysięków poczwarkowych Chironomidae unoszących się na powierzchni (SFPE). Opisano tu techniki zbierania w terenie, obróbki laboratoryjnej, montażu szkiełek i identyfikacji Chironomidae SFPE.

Wykorzystanie pływających powierzchniowo wysięków poczwarkowych Chironomidae (Dipterae) jako protokołu szybkiej oceny biologicznej zbiorników wodnych

Tutaj prezentujemy małe inkubacje rdzenia do pomiaru wymiany gazu osad-woda i substancji rozpuszczonej. Umożliwią one wiarygodne pomiary wymiany osad-woda, które ocenią rolę osadów we wpływie na procesy biologiczne i biogeochemiczne w ekosystemach wodnych.

Bentosowa wymianaO2, N2 i rozpuszczonych składników odżywczych przy użyciu inkubacji z małym rdzeniem

Długoterminowe badania są niezbędne do zrozumienia procesu ewolucji i mechanizmów adaptacji. Ogólnie rzecz biorąc, badania te wymagają zobowiązań wykraczających poza okres życia badaczy. W tym miejscu opisano potężną metodę, która radykalnie przyspiesza najnowocześniejsze gromadzenie danych w celu generowania danych podłużnych w systemach naturalnych.

Wskrzeszenie uśpionej rozwielitki magna: protokół i zastosowania

Plankton i zawieszone cząstki odgrywają główną rolę w cyklach biogeochemicznych w oceanie. W tym przypadku zapewniamy ultraczystą, bezstresową metodę zbierania różnych rozmiarów cząstek i planktonu na morzu, która jest w stanie poradzić sobie z dużymi ilościami wody morskiej.

Ultra-czyste, wielowarstwowe urządzenie do zbierania frakcjonowanego planktonu morskiego i zawieszonych cząstek

Doliolidy, w tym gatunek Dolioletta gegenbauri, to mały, galaretowaty zooplankton morski o znaczeniu ekologicznym, występujący na produktywnych systemach szelfu subkontynentalnego na całym świecie. Trudność w hodowli tych delikatnych organizmów ogranicza ich badania. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania doliolid Dolioletta gegenbauri.

Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych

Zmiany klimatyczne wpływają na ekosystemy raf koralowych na całym świecie. Koralowce pochodzące z systemów akwakultury ex situ mogą pomóc w odbudowie i badaniach naukowych. W tym artykule przedstawiono techniki karmienia i hodowli koralowców, które można wykorzystać do promowania długoterminowego utrzymania wysiadujących koralowców skleraktyńskich ex situ.

Skuteczne techniki karmienia i hodowli ex situ wysiadującego koralowca skleraktynowego, Pocillopora acuta

Artykuł przedstawia metody hodowli larw ślimaka Crepidula fornicata w systemie laboratoryjnym o małej objętości oraz w systemie mezokosmosu z otaczającą wodą morską, który może być stosowany w terenie.

Hodowla laboratoryjna i terenowa larw skałoczepa pantofelkowego, Crepidula fornicata

Tutaj prezentujemy nowatorski protokół odzyskiwania morskiego eDNA poprzez zbieranie i filtrację próbek wody morskiej z działających promów i innych statków handlowych.

Pływające laboratorium: Standardowa procedura operacyjna pobierania i filtrowania próbek wody morskiej z działających promów do analizy środowiskowej DNA

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj metodę pobierania próbek i hodowlę Oikopleura dioica, modelowego organizmu morskiego o krótkim cyklu życiowym. Protokół umożliwia badania w ekologii, rozwoju i genomice.

Usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (Oikopleura dioica)

Przeglądaj więcej filmów