Name: 2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Poznaj metodę 2D-HELS MS Seq do bezpośredniego sekwencjonowania RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów bez pośrednictwa cDNA. Technika LC-MS umożliwia jednoczesną analizę epitranskryptyczną z pojedynczą precyzją nukleotydową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za grant R21 od National Institutes of Health (1R21HG009576) dla S. Z. i W. L. oraz granty New York Institute of Technology (NYIT) Institutional Support for Research and Creativity dla S. Z., które wsparły tę pracę. Autorzy pragną podziękować doktorantowi Xuantingowi Wangowi (Columbia University) za pomoc w tworzeniu figur, a także podziękować prof. Michaelowi Hadjiargyrou (NYIT), prof. Jingyue Ju (Columbia University), dr Jamesowi Russo, Shiv Kumarowi, Xiaoxu Li, Steffenowi Jockuschowi i innym członkom laboratorium Ju (Columbia University), dr Yongdong Wang (Cerno Bioscience), Meinie Aziz (NYIT) i Wenhao Ni (NYIT) za pomocne dyskusje i sugestie dotyczące naszego manuskryptu.

1. Projektowanie oligonukleotydów RNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj syntetyczne oligonukleotydy RNA o różnych długościach (19 nt, 20 nt i 21 nt), w tym jeden (RNA #6) zarówno z kanonicznymi, jak i zmodyfikowanymi nukleotydami. ψ jest stosowany jako model dla modyfikacji niezmieniających masy, co jest wyzwaniem dla sekwencjonowania MS, ponieważ ma identyczną masę jak U. m5C jest wybierany jako model dla modyfikacji zmieniających masę, aby zademonstrować solidność podejścia. 
	 
	RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3' 
	RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3' 
	RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3' 
	RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUUCCCCUUUAU-OH-3' 
	RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3' 
	RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm5CUGAG-OH-3' 
	 </li>
	<li>Rozpuścić każdy syntetyczny RNA w wodzie poddanej działaniu pirowęglanu dietylu (DEPC) bez nukleaz (wyrażonej jako H2O poddane działaniu DEPC), aby otrzymać roztwór podstawowy 100 mM RNA. Roztwory podstawowe są przechowywane przez długi czas w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Aby uniknąć możliwej degradacji próbki RNA, należy używać materiałów eksperymentalnych wolnych od RNaz, w tym wody uzdatnionej DEPC, probówek do mikrowirówek i końcówek do pipet. Często wycieraj powierzchnie materiałów laboratoryjnych za pomocą chusteczek do usuwania RNazy.</li>
</ol>
2. Oznacz koniec 3' RNA biotyną
<ol>
	<li>Dwuetapowy protokół reakcji (adenylacja i ligacja)
	<ol>
		<li>Dodać 1 μL 10x buforu do reakcji adenylacji zawierającego 50 mM octanu sodu, pH 6,0, 10 mM MgCl2, 5 mM dichlorodifenylotrichloroetanu (DTT), 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1 μL 1 mM ATP, 1 μL 100 μM biotynylowanego bisfosforanu cytydyny (pCp-biotyny), 1 μL 50 μM ligazy Mth RNA, i 6 μl2 Opoddanego działaniu DEPC (całkowita objętość 10 μl) do cienkościennej probówki PCR o pojemności 0,2 ml bez RNaz. 
		UWAGA: Odczynniki należy przechowywać w temperaturze -20 °C przed reakcją dwuetapową. Rozmrozić odczynniki w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać przez wirowanie i odwirowanie przed dodaniem do reakcji.</li>
		<li>Inkubować reakcję w maszynie do PCR w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę i dezaktywować reakcję w temperaturze 85 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Przeprowadzić etap ligacji w wolnej od RNaz, cienkościennej probówce PCR o pojemności 0,2 ml zawierającej 10 μl roztworu reakcyjnego z poprzedniego etapu, dodając 3 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy T4 RNA zawierającego 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1,5 μl 100 mM próbki RNA, która ma być sekwencjonowana, 3 μl bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) do osiągnięcia 10% (v/v), 1 μl ligazy RNA T4 (10 jednostek/μl) i 11,5 μlH2Opoddanego działaniu DEPC (dla całkowitej objętości 30 ml). Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C w maszynie do PCR. 
		UWAGA: Połączyć składniki reakcji w temperaturze pokojowej ze względu na wysoką temperaturę zamarzania DMSO (18,45 °C).</li>
		<li>Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Stłumić i oczyścić reakcję przez oczyszczanie kolumnowe w celu usunięcia enzymów i wolnej pCp-biotyny za pomocą Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, USA). W zestawie znajduje się bufor wiążący oligo, bufor do przemywania DNA, kolumny wirowe i probówki zbiorcze. Dodać 20 ml H2O poddanego działaniu DEPC do roztworu reakcyjnego, aby osiągnąć objętość 50 ml próbki przed dodaniem buforu wiążącego.</li>
		<li>Dodać 100 ml buforu wiążącego do każdego roztworu reakcyjnego. Dodać 400 μl etanolu, wymieszać pipetując i przenieść mieszaninę do kolumny. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Dodać 750 μl buforu do przemywania DNA do kolumny. Wirować przy 10 000 x g i maksymalnej prędkości odpowiednio przez 30 s i 1 minutę.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 15 μl H2O poddanego działaniu DEPC do kolumny i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s w celu elucji produktu RNA. 
		UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu wykonania następnego etapu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednoetapowy protokół reakcji
	<ol>
		<li>Przeprowadzić jednoetapową reakcję znakowania, łącząc 2 μl 150 μM adenozyno-5'-5'-difosforanu-{5'-(cytydyno-2'-O-metylo-3'-fosforanu-TEG}C-biotyny (AppCp-biotyny), 3 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy, 1,5 μL 100 mM próbki RNA, która ma być sekwencjonowana, 3 μL bezwodnego DMSO do osiągnięcia 10% (v/v), 1 μl ligazy T4 RNA (10 jednostek/μl) i 19,5 μlH2Opoddanych działaniu DEPC (dla całkowitej objętości 30 ml) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.</li>
		<li>Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C w maszynie do PCR.</li>
		<li>Wykonaj oczyszczanie kolumny zgodnie z powyższym opisem w krokach 2.1.5-2.1.8. 
		UWAGA: Przygotuj oddzielną/wyłączną probówkę reakcyjną dla każdej próbki RNA (skala 150 pmol RNA). Może być konieczne znakowanie końca 5' RNA za pomocą sulfocyjaniny3 (Cy3) lub Cy3 (np. do weryfikacji sekwencjonowania dwukierunkowego). Metoda ta różni się od metody 3'-biotynylacji i została opisana w poprzedniej publikacji9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przechwytywanie próbki biotynylowanego RNA na kulkach streptawidyny
<ol>
	<li>Aktywuj 200 μl kulek magnetycznych streptawidyny C1, dodając 200 μl 1x bufor czarno-biały (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml bez RNaz. Zwiruj ten roztwór i umieść go na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Następnie wyrzucić supernatant, ostrożnie odpipetowując roztwór.</li>
	<li>Przemyć kulki dwukrotnie 200 μl roztworu A (0,1 M NaOH poddanego działaniu DEPC i 0,05 M NaCl poddanego działaniu DEPC) i raz w 200 μl roztworu B (0,1 M NaCl poddanego działaniu DEPC). Na każdym etapie płukania należy wymieszać roztwór i umieścić go na stojaku magnetycznym na 2 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 100 μL 2x B&W buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl).</li>
	<li>Dodać 1x bufor czarno-biały do biotynylowanej próbki RNA, aż objętość osiągnie 100 μl. Następnie dodaj ten roztwór do umytych kulek przechowywanych w 100 μL 2x bufora czarno-białego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z platformą kołyszącą z prędkością 100 obr./min. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Umyj powlekane kulki 3 razy w 1x buforze czarno-białym i zmierz końcowe stężenie supernatantu w każdym kroku płukania za pomocą Nanodrop w celu analizy odzysku, aby potwierdzić, że docelowe cząsteczki RNA pozostają na kulkach.</li>
	<li>Inkubować kulki w 10 mM EDTA, pH 8,2 z 95% formamidem w temperaturze 65 °C przez 5 minut w maszynie do PCR. Trzymaj probówkę na stojaku magnetycznym przez 2 minuty i zbierz supernatant (zawierający biotynylowane RNA uwolnione z kulek streptawidyny) pipetą. 
	UWAGA: Ten fizyczny etap separacji przed degradacją kwasu jest używany tylko do sekwencjonowania RNA#1 na rysunku 1c i nie jest obowiązkowy dla 2D-HELS MS Seq, ponieważ hydrofobowa etykieta biotyny może spowodować, że fragmenty drabiny znakowane 3' będą miały znacznie opóźnione tR podczas pomiaru LC-MS, co może wyraźnie odróżnić oznakowane fragmenty drabiny 3' od nieznakowanych fragmentów drabiny 5' na wykresie2D mass-t R.</li>
</ol>
4. Kwasowa hydroliza RNA w celu wytworzenia drabinek MS do sekwencjonowania
<ol>
	<li>Podziel każdą próbkę RNA na trzy równe podwielokrotności. Na przykład próbkę RNA o objętości 15 μl RNA podzielić na trzy porcje po 5 μl.</li>
	<li>Dodać równą objętość kwasu mrówkowego, aby uzyskać 50% (v/v) kwasu mrówkowego w mieszaninie reakcyjnej8,9.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 40 °C w maszynie do PCR, przy czym jedna reakcja trwa odpowiednio 2 minuty, druga 5 minut, a druga 15 minut.</li>
	<li>Degradację kwasu należy stłumić poprzez natychmiastowe zamrożenie próbki na suchym lodzie po zakończeniu każdej reakcji.</li>
	<li>Do wysuszenia próbki należy użyć odśrodkowego koncentratora próżni. Próbka jest zazwyczaj całkowicie suszona w ciągu 30 minut, a kwas mrówkowy jest usuwany wraz zH2Opodczas procesu suszenia, ponieważ kwas mrówkowy ma temperaturę wrzenia (100,8 °C) podobną doH2O(100 °C).</li>
	<li>Zawiesić i połączyć łącznie trzy wysuszone próbki w 20 μlH2Opoddanego działaniu DEPC w celu pomiaru LC-MS. 
	UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w oczekiwaniu na pomiar LC-MS.</li>
</ol>
5. Konwersja ψ na CMC-ψ addduct
<ol>
	<li>Dodać 80 μl 2O Hpoddanegodziałaniu DEPC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz zawierającej 0,0141 g N-cykloheksylo-Nʹ-(2-morfolinoetylo)-karbodimidu meto-p-toluenosulfonianu (CMC) i 0,07 g mocznika. Dodać 10 μl 100 μM próbki RNA do sekwencjonowania, 8 μl 1 M buforu bicyny (pH 8,3) i 1,28 μl 0,5 M EDTA. Dodać H2O poddane działaniu DEPC, aby osiągnąć całkowitą objętość 160 μL. Końcowe stężenia wynoszą 0,17 M CMC, 7 M mocznika i 4 mM EDTA w 50 mM bicine (pH 8,3)11. 
	UWAGA: Protokół ten ma zastosowanie zarówno do pojedynczej syntetycznej sekwencji RNA, jak i mieszanin RNA.</li>
	<li>Podzielić 160 μl roztworu reakcyjnego na cztery równe podwielokrotności w wolnych od RNaz, cienkościennych probówkach PCR o pojemności 0,2 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w maszynie do PCR. 
	UWAGA: 50 μL na probówkę to maksymalna objętość reakcji, jaką można zastosować w maszynie do PCR.</li>
	<li>Każdą reakcję ugasić 10 μl 1,5 M octanu sodu i 0,5 mM EDTA (pH 5,6).</li>
	<li>Przeprowadzić oczyszczanie kolumny za pomocą czterech równoległych kolumn wirowych w celu usunięcia nadmiaru reagentów zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1.5-2.1.8. Rozpuścić oczyszczony produkt w 15 μlH2Opoddanego działaniu DEPC w każdej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.</li>
	<li>Przenieś oczyszczony produkt do czterech niezawierających RNaz, cienkościennych probówek PCR o pojemności 0,2 ml. Dodać 20 μl 0,1 M Na2buforu CO3 (pH 10,4) do każdych 15 μl oczyszczonego produktu i dodać H2O poddane działaniu DEPC, aby uzyskać końcową objętość 40 μl dla każdej probówki reakcyjnej (w sumie cztery probówki). Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w maszynie do PCR.</li>
	<li>Schładzić i oczyścić reakcję przez oczyszczanie kolumnowe za pomocą czterech równoległych kolumn wirowych, jak opisano w kroku 2.1.5. Eluować produkt przekształcony w CMC-ψ do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz, z której każda zawiera 15 μl2Opoddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Połączyć oczyszczoną CMC-ψ przekształconą próbkę z czterech probówek zbiorczych w jedną probówkę. Przeprowadzić degradację kwasu mrówkowego w 50% (v/v) zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 4.1-4.6 w celu wygenerowania drabinek MS do sekwencjonowania.</li>
</ol>
6. Pomiar LC-MS
<ol>
	<li>Przygotowanie faz ruchomych do pomiaru LC-MS. Faza ruchoma A to 25 mM heksafluoro-2-propanol z 10 mM diizopropyloaminą w wodzie klasy LC-MS; faza ruchoma B to metanol.</li>
	<li>Przenieść próbkę do fiolki z próbką LC-MS w celu analizy. Każda objętość wstrzyknięcia próbki wynosi 20 μl i zawiera 100-400 pmol RNA.</li>
	<li>Stosować następujące warunki LC: temperatura kolumny 35 °C, natężenie przepływu 0,3 ml/min; gradient liniowy od 2–20% fazy ruchomej B przez 15 minut, a następnie 2-minutowy etap mycia z fazą ruchomą B. 
	UWAGA: W przypadku bardziej hydrofobowych etykiet końcowych, takich jak Cy3 i sulfo-Cy3, jak wspomniano w sekcji 2, do elucji próbki może być konieczny wyższy procent rozpuszczalnika organicznego (tj. można zastosować podobny gradient, ale ze zwiększonym zakresem procentowym fazy ruchomej B). Na przykład 2–38% mobilna faza B w ciągu 30 minut z 2-minutowym krokiem mycia z 90% ruchoma faza B.</li>
	<li>Oddziel i przeanalizuj próbki na spektrometrze mas Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) sprzężonym z systemem LC wyposażonym w automatyczny podajnik próbek i system MS HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Kolumna LC to kolumna C18 o wymiarach 50 mm x 2,1 mm i wielkości cząstek 1,7 μm. Użyj następujących ustawień MS: tryb jonów ujemnych; zasięg, od 350 m/z do 3200 m/z; szybkość skanowania, 2 widma/s; przepływ gazu suszącego, 17 l/min; temperatura gazu schnącego, 250 °C; ciśnienie nebulizatora, 30 psig; napięcie kapilarne, 3500 V; i napięcie fragmentora, 365 V. Należy pamiętać, że parametry te są specyficzne dla typu lub modelu używanego spektrometru masowego.</li>
	<li>Pozyskiwanie danych za pomocą oprogramowania do akwizycji Agilent MassHunter. Użyj przepływu pracy ekstrakcji cech molekularnych (MFE) Agilent, aby wyodrębnić informacje o związkach, w tym masę, czas retencji, objętość (obfitość MFE dla odpowiednich gatunków jonów) i wynik jakości itp. Użyj następujących ustawień MFE: "format danych centroidu, małe cząsteczki (chromatograficzne), pik o wysokości ≥ 100, do maksimum 1000, wynik jakości ≥ 50". 
	UWAGA: Zoptymalizuj ustawienia MFE, aby wyodrębnić jak najwięcej potencjalnych związków, maksymalnie do 1000, z wynikami jakości ≥ 50.</li>
</ol>
7. Automatyzacja generowania sekwencji RNA za pomocą algorytmu obliczeniowego
UWAGA: Ta procedura jest pokazana tylko dla RNA #1 w <silna klasa="xfig">Rysunek 1c.
<ol>
	<li>Sortuj związki wyekstrahowane MFE w kolejności malejącej objętości (intensywności szczytu) i tR. Dokonaj wstępnej selekcji danych poprzez: 1) ustawienie tR od 4 do 10 minut, aby wybrać fragmenty RNA znakowane biotyną, ponieważ tRskładników drabinki masowej znakowanych biotyną jest przesuwane do tego oknat R (4 min do 10 min) oraz 2) przy użyciu o rząd wielkości więcej związków wejściowych niż liczba fragmentów drabinki do obliczeń algorytmu w celu zmniejszenia ilości danych na podstawie objętości. Na przykład dla 20 nt RNA do sekwencjonowania 20 nt RNA wymagane będzie 20 znakowanych składnikówdrabinki R o masie 20 nt, a zatem 200 związków z pliku danych MFE zostanie wybranych na podstawie objętości. Należy pamiętać, że oknot R może być inne, gdy używany jest inny typ lub model spektrometru mas.</li>
	<li>Przeprowadź przetwarzanie danych i wygenerowanie sekwencji RNA #1 przy użyciu poprawionej wersji opublikowanego algorytmu8. Kody źródłowe poprawionego algorytmu są opisane wcześniej (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)9.</li>
	<li>Oprócz automatyzacji generowania sekwencji za pomocą algorytmu, należy ręcznie obliczyć różnice mas między dwoma sąsiednimi komponentami drabinki w celu wywołania bazy. Wszystkie zasady w RNA mogą być wywoływane ręcznie i dopasowywane do teoretycznych w bazie danych nukleotydów i modyfikacji RNA8; w ten sposób cała sekwencja nici RNA może być dokładnie odczytana ręcznie, co służy do potwierdzenia dokładności odczytanej sekwencji zgłoszonej przez algorytm. Więcej struktur modyfikacji RNA można znaleźć w bazach danych modyfikacji RNA12, a odpowiadające im masy teoretyczne są uzyskiwane przez ChemBioDraw. W tabelach S1–S2 różnica masy ppm (części na milion) jest pokazana podczas porównywania obserwowanej masy z jej masą teoretyczną dla określonego komponentu drabiny, a wartość mniejsza niż 10 ppm jest uważana za dobre dopasowanie dla każdego wywołania bazy.</li>
</ol>
8. Sekwencjonowanie mieszanin RNA
<ol>
	<li>Oznacz mieszaninę pięciu nici RNA (RNA #1 do #5) na ich końcach 3' biotyną A(5')pp(5')Cp-TEG-biotyna, stosując jednoetapowy protokół opisany w kroku 2.2. W całkowitej objętości 150 μL roztworu reakcyjnego dodać 15 μL 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA T4, 1,5 μL każdej nici RNA (100 μM zapasu RNA #1 do #5, odpowiednio, dla całkowitej objętości 7,5 μL), 10 μL 150 μM A(5')pp(5')Cp-TEG-biotyny, 15 μl bezwodnego DMSO, 5 μl ligazy RNA T4 (10 jednostek/μl) i 97,5 μl H2O poddanych działaniu DEPC. Równomiernie rozprowadzić roztwór reakcyjny na pięć podwielokrotności. Każda probówka wirówkowa bez RNaz zawiera 30 μl roztworu reakcyjnego.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C w maszynie do PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić oczyszczanie kolumny zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1.5-2.1.8 za pomocą pięciu równoległych kolumn wirujących. Eluować próbkę mieszaniny 3'-biotynylowanych 5 nici RNA (mieszanina RNA #1 do #5) do 1,5 ml probówki wirówkowej bez RNaz każda z 15 μlH2O poddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Połączyć oczyszczone próbki mieszaniny z pięciu probówek zbiorczych w jedną probówkę. Przeprowadzić degradację kwasu mrówkowego zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale 4.</li>
	<li>Zmierz próbki za pomocą LC-MS zgodnie z opisem w sekcji 6 i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych ze zoptymalizowanymi ustawieniami MFE, aby wyodrębnić dane zawierające masę,t R i objętość, jak opisano w kroku 6.5. Typowy algorytm przetwarzania i wywoływania zasad nie jest stosowany ze względu na znacznie zwiększoną złożoność danych wynikającą z mieszaniny. Wszystkie zasady w RNA zmieszanej próbki są wywoływane ręcznie w metodzie podobnej do sekcji 7.3 i dobrze pasują do zasad teoretycznych w bazie danych nukleotydów i modyfikacji RNA8, dzięki czemu pełne sekwencje wszystkich pięciu nici RNA w mieszanej próbce są dokładnie odczytywane. W tabelach S7–S11 wymieniono wszystkie informacje, w tym obserwowaną masę,t R, objętość, wynik jakości i różnicę masy w ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+ribonuclease+activity+of+cusativin+from+Cucumis+sativus+for+mapping+nucleoside+modifications+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).</li>
<li>Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+confirmation+of+chemically+modified+RNAs+using+exonuclease+digestion+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).</li>
<li>McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Glish, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+small%2C+multiply+charged+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 3 (1), 60-70 (1992).</li>
<li>Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+native+and+chemically+modified+oligonucleotides+by+tandem+ion-pair+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (7), 646-653 (2003).</li>
<li>Taucher, M., Breuker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+modified+RNA+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Characterization of modified RNA by top-down mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51 (45), 11289-11292 (2012).</li>
<li>Kellner, S., Burhenne, J., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of RNA modifications.</a> RNA Biology. 7 (2), 237-247 (2010).</li>
<li>Thomas, B., Akoulitchev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of RNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (3), 173-181 (2006).</li>
<li>Bjorkbom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+direct+sequencing+of+noncanonical+RNA+by+two-dimensional+analysis+of+mass+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+LC-MS-based+RNA+sequencing+method+for+direct+analysis+of+multiple-base+modifications+in+RNA+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures.</a> Nucleic Acids Research. 47 (20), 125(2019).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+tRNA+by+2D-HELS-AA+MS+Seq+reveals+its+different+isoforms+and+dynamic+base+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications.</a> ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).</li>
<li>Bakin, A., Ofengand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+newly+located+pseudouridylate+residues+in+Escherichia+coli+23S+ribosomal+RNA+are+all+at+the+peptidyltransferase+center%3A+analysis+by+the+application+of+a+new+sequencing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique.</a> Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Modification+Database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).</li>
</ol>

Autorzy złożyli tymczasowy patent związany z technologią omawianą w tym manuskrypcie.

W przeciwieństwie do fragmentacji MS opartej na tandemie, wysoce kontrolowana hydroliza kwasowa jest stosowana w podejściu 2D-HELS MS Seq do fragmentacji RNA przed analizą za pomocą spektrometru mas 9,10. W rezultacie, każdy zdegradowany kwasem fragment może zostać wykryty przez urządzenie, tworząc odpowiednik drabinki sekwencjonowania. W optymalnych warunkach metoda ta tworzy "idealną" drabinę sekwencji z RNA poprzez średnio jedno na cząsteczkę specyfic...

Metody sekwencjonowania oparte na spektrometrii mas (MS), w tym MS z góry na dół i tandemowe MS1,2,3,4, zostały opracowane do bezpośredniego sekwencjonowania RNA. Jednak techniki fragmentacji in situ do skutecznego generowania wysokiej jakości drabinek RNA w spektrometrach mas nie mogą być obecnie stosowane do sekwencjonowania de novo5,6. Co więcej, analiza tradycyjnych jednowymiarowych (1D) danych MS do sekwencjonowania de novo nawet jednej oczyszczonej sekwencji RNA nie jest zbyt trywialna, a jeszcze trudniejsze byłoby dla sekwencjonowania MS mieszanych próbek RNA7,8. W związku z tym opracowano dwuwymiarową (2D) metodę sekwencjonowania RNA opartą na chromatografii cieczowej (LC)-MS, obejmującą produkcję drabinek czasu retencji masy 2D (tR) w celu zastąpienia drabinek masowych 1D, co znacznie ułatwia identyfikację komponentów drabinki potrzebnych do sekwencjonowania de novo RNAs8. Jednak metoda sekwencjonowania RNA oparta na 2D LC-MS ogranicza się głównie do oczyszczonego syntetycznego krótkiego RNA, ponieważ nie może odczytać pełnej sekwencji wyłącznie w oparciu o jedną drabinkę, ale musi polegać na dwóch współistniejących sąsiednich drabinkach (drabinkach 5' i 3')<klasa sup = "xref">8. Mówiąc dokładniej, podejście to wymaga dwukierunkowych odczytów sparowanych końców do odczytu końcowych zasad nukleotydowych w regionie o niskiej masie8. Dodatkowa złożoność odczytu sparowanych końców powoduje, że metoda ta jest nie do utrzymania w przypadku sekwencjonowania mieszanin RNA, ponieważ powstaje zamieszanie co do tego, który fragment drabiny należy do której drabiny dla nieznanych próbek. 
Aby pokonać wyżej wymienione bariery w podejściu do sekwencjonowania RNA opartego na MS i rozszerzyć takie zastosowania w bezpośrednim sekwencjonowaniu RNA, należy zająć się dwoma kwestiami: 1) jak wygenerować wysokiej jakości drabinkę masy, która może być użyta do odczytania pełnej sekwencji, od pierwszego nukleotydu do ostatniego w nici RNA, oraz 2) jak skutecznie zidentyfikować każdą drabinkę RNA/masa w złożonym zestawie danych MS. Wraz z dobrze kontrolowaną degradacją kwasów, opracowaliśmy nową metodę sekwencjonowania, wprowadzając hydrofobową strategię znakowania końców (HELS) do techniki sekwencjonowania opartej na MS i z powodzeniem rozwiązaliśmy te dwa problemy, dodając znacznik hydrofobowy na końcu 5' i/lub 3' RNA, które mają być sekwencjonowane9. Ta metoda tworzy "idealną" drabinkę sekwencji z RNA - każdy fragment drabinki pochodzi z rozszczepienia RNA specyficznego dla miejsca wyłącznie na każdym wiązaniu fosfodiestrowym, a różnica masy między dwoma sąsiednimi fragmentami drabinki jest dokładną masą modyfikacji nukleotydu lub nukleotydu w tej pozycji 8,9,10. Jest to możliwe, ponieważ uwzględniamy wysoce kontrolowany etap hydrolizy kwasowej, w którym RNA jest fragmentowane średnio raz na cząsteczkę, zanim zostanie wstrzyknięte do urządzenia. W rezultacie, każdy produkt degradacji fragmentu jest wykrywany na spektrometrze mas, a wszystkie fragmenty razem tworzą drabinkę sekwencjonowania8,9,10. Ta nowa strategia umożliwia pełny odczyt sekwencji RNA z jednej pojedynczej drabinki nici RNA bez odczytu sparowanego końca z drugiej drabinki RNA, a dodatkowo umożliwia sekwencjonowanie MS mieszanin RNA z wieloma różnymi niciami, które zawierają kombinatoryczne modyfikacje nukleotydów9. Dodając znacznik na końcu 5' i/lub 3' RNA, znakowane fragmenty drabinki wykazują znaczne opóźnienie tR, co może pomóc w odróżnieniu dwóch drabinek masowych od siebie, a także od hałaśliwego obszaru o niskiej masie. Przesunięciemasy R spowodowane dodaniem znacznika hydrofobowego ułatwia identyfikację drabinki masy i upraszcza analizę danych w celu generowania sekwencji. Co więcej, dodanie znacznika hydrofobowego może pomóc w identyfikacji końcowej zasady w nici, zapobiegając znajdowaniu się odpowiadającego mu fragmentu drabinki w hałaśliwym obszarzeR o niskiej masie z powodu wzrostu masy i hydrofobowości spowodowanego przez znacznik, umożliwiając w ten sposób identyfikację pełnej sekwencji RNA z pojedynczej drabinki; Nie są wymagane żadne odczyty sparowanych końców. W rezultacie, wcześniej wykazaliśmy udane sekwencjonowanie złożonej mieszaniny do 12 odrębnych nici RNA bez użycia jakiegokolwiek zaawansowanego algorytmu sekwencjonowania9, co otwiera drzwi do sekwencjonowania de novo MS RNA zawierającego zarówno kanoniczne, jak i zmodyfikowane nukleotydy i sprawia, że sekwencjonowanie mieszanych i bardziej złożonych próbek RNA jest bardziej wykonalne. W rzeczywistości, korzystając z 2D-HELS MS Seq, udało nam się nawet zsekwencjonować mieszaną populację próbek tRNA10 i aktywnie rozszerzamy jego zastosowanie na inne złożone próbki RNA. 
Aby ułatwić 2D-HELS MS Seq bezpośrednie sekwencjonowanie szerszego zakresu próbek RNA, tutaj skupimy się na technicznych aspektach tego podejścia do sekwencjonowania i omówimy wszystkie niezbędne kroki potrzebne do zastosowania techniki bezpośredniego sekwencjonowania próbek RNA. Konkretne przykłady zostaną wykorzystane do zilustrowania techniki sekwencjonowania, w tym syntetycznych pojedynczych sekwencji RNA, mieszanin wielu odrębnych sekwencji RNA oraz zmodyfikowanych RNA zawierających zarówno kanoniczne, jak i zmodyfikowane nukleotydy, takie jak pseudourydyna (ψ) i 5-metylocytozyna (m5C). Ponieważ wszystkie RNA zawierają wiązania fosfodiestrowe, każdy rodzaj RNA może być hydrolizowany kwasem w celu wygenerowania idealnej drabiny sekwencji dla 2D-HELS MS Seq w optymalnych warunkach8,9. Jednak wykrycie wszystkich fragmentów drabinkowych danego RNA jest zależne od instrumentu. W standardowym LC-MS o wysokiej rozdzielczości (40K) minimalna ilość ładunku do sekwencjonowania oczyszczonej próbki krótkiego RNA (<35 nt) wynosi 100 pmol na serię. Potrzeba jednak więcej materiału (do 400 pmol na próbkę RNA), gdy konieczne jest przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów (np. w celu rozróżnienia modyfikacji zasad izomerycznych, które mają identyczne masy). Protokół stosowany w sekwencjonowaniu modelowych syntetycznych zmodyfikowanych RNA będzie miał również zastosowanie do sekwencjonowania szerszych próbek RNA, w tym próbek biologicznego RNA z nieznanymi modyfikacjami zasad. Jednak do sekwencjonowania kompletnego tRNA ze wszystkimi modyfikacjami wymagana jest jeszcze większa ilość próbki, taka jak 1000 pmol do sekwencjonowania tRNA (~76 nt) przy użyciu standardowego instrumentu LC-MS, a do jego sekwencjonowania de novo należy opracować zaawansowany algorytm sekwencjonowania de novo10.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do denylacji DNA 5'</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610S</td><td>Stężenie 50uM</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Q-TOF</td><td>Agilent Technologies</td><td>5991-2116EN</td><td>Sprzężony z systemem 1290 Infinity LC</td></tr><tr><td>A(5&acute;)pp(5&acute;)Cp-TEG-biotyna-3&ostry;</td><td>ChemGenes</td><td>91718</td><td>HPLC oczyszczony</td></tr><tr><td>ATP&gamma; S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td>Sól litowa</td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8660</td><td>BioXtra, &ge; 99% (miareczkowanie)</td></tr><tr><td>Maleimid biotyny</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1501</td> Kolumna C18 <td>z długim ramieniem</td></tr><tr><td></td><td>Wody</td><td></td><td>186003532 50 mm i razy 2,1 mm Kolumna Xbridge C18 o wielkości cząstek 1,7 &mu; </td></tr><tr><td>m Odśrodkowy koncentrator próżni</td><td>Labconco</td><td>Refrig 115v/60hz 7310022</td><td>Labconco CentriVap</td></tr><tr><td>ChemBioDraw</td><td>PerkinElmer</td><td>ChemDraw Prime</td><td>Generuj dane o strukturze chemicznej i właściwościach struktur i fragmentów</td></tr><tr><td>CMC (N-cykloheksylo-N?-(2-morfolinoetylo)-karbodimid meto-p-toluenosulfonian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2491-17-0</td><td>95% Oczyszczanie</td></tr><tr><td>Cyjanina3 maleimid (Cy3)</td><td>Lumiprobe</td><td>11080</td><td>Nierozpuszczalna</td></tr><tr><td>w wodzie woda uzdatniona DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td>Autoklawowana, certyfikowana</td></tr><tr><td>diizopropyloamina (DIPA)</td> wolna od nukleazThermo <td>Fisher Scientific</td><td>108-18-9</td><td>99% Alfa Aesar</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Bezwodny dimetylosulfotlenek, 99,9%</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Bezwodny, krystaliczny, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Merck</td><td>64-18-6</td><td>98-100%, ACS reag, Ph Eur</td></tr><tr><td>Heksafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>920-66-1</td><td>99% Fiolki na próbki Acros Organics</td></tr><tr><td>LC-MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-11</td><td>Fiolki z plastikowym gwintem gwintowanym</td></tr><tr><td>LC-MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-54A</td><td>Nasadki gwintowane fiolki autosamplera</td></tr><tr><td>Na2CO3 bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88975</td><td>BioUltra, >0,1 M Na2CO3, >0,2 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Oligo Clean & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>Kolumna wirowa</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro</td><td>Oprogramowanie do analizy i tworzenia wykresów</td></tr><tr><td>danych pCp-biotyna</td><td>TriLink BioTechnologies</td><td>NU-1706-BIO</td><td>20 ul (1 mM)</td></tr><tr><td>RNA #1--#6</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowe oligonukleotydy</td><td>19nt-21nt jednoniciowe RNA, używane bez dalszego oczyszczania</td></tr><tr><td>Kołysanie wytrząsarka platformowa</td><td></td><td>Wytrząsarka orbitalna VWR Standard 1000</td><td>Zakres prędkości od 40 do 300 obr./min</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Streptawidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td>Wiązanie ok. 55ug biotynylowany królik lgG na mg kulek</td></tr><tr><td>Sulfonowany cyjaninin3 maleimid</td><td>Lumiprobe</td><td>11380</td><td>Rozpuszczalna</td></tr><tr><td>w wodzie ligaza DNA T4 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>400 jednostek/uL</td></tr><tr><td>T4 kinaza polinukleotydowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4PNK-RO</td><td>Z faga T4 am N81 pse T1 zakażony Escherichia coli</td></tr><tr><td>BB Bufor Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455</td><td>Tris-HCl Buffer, pH 10, 10& razy;, Antigen Retriever</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81871</td><td>Mocznik do syntezy. Numer CAS 57-13-6, numer WE 200-315-5.</td></tr></tbody></table>

2d-hels ms seq: ogólna metoda oparta na lc-ms do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin rna z różnymi modyfikacjami nukleotydów

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Metody sekwencjonowania oparte na spektrometrii mas (MS) okazały się przydatne w bezpośrednim sekwencjonowaniu RNA bez potrzeby stosowania komplementarnego DNA (cDNA) pośredniego. Jednak takie podejścia są rzadko stosowane jako metoda sekwencjonowania de novo RNA, ale stosowane głównie jako narzędzie, które może pomóc w zapewnieniu jakości w celu potwierdzenia znanych sekwencji oczyszczonych jednoniciowych próbek RNA. Niedawno opracowaliśmy metodę bezpośredniego sekwencjonowania RNA, integrując dwuwymiarową strategię hydrofobowego znakowania końców w czasie zatrzymywania masy z sekwencjonowaniem opartym na MS (2D-HELS MS Seq). Metoda ta jest w stanie dokładnie sekwencjonować pojedyncze sekwencje RNA, a także mieszaniny zawierające do 12 różnych sekwencji RNA. Oprócz czterech kanonicznych rybonukleotydów (A, C, G i U), metoda ma zdolność sekwencjonowania oligonukleotydów RNA zawierających zmodyfikowane nukleotydy. Jest to możliwe, ponieważ zmodyfikowana zasada nukleotydowa ma albo wewnętrznie unikalną masę, która może pomóc w jej identyfikacji i lokalizacji w sekwencji RNA, albo może zostać przekształcona w produkt o unikalnej masie. W tym badaniu wykorzystaliśmy RNA, zawierający dwa reprezentatywne zmodyfikowane nukleotydy (pseudourydyna (Ψ) i 5-metylocytozyna (m5C)), aby zilustrować zastosowanie metody sekwencjonowania de novo pojedynczego oligonukleotydu RNA, a także mieszaniny oligonukleotydów RNA, z których każdy ma inną sekwencję i / lub zmodyfikowane nukleotydy. Opisane tutaj procedury i protokoły sekwencjonowania tych modelowych RNA będą miały zastosowanie do innych krótkich próbek RNA (<35 nt) przy użyciu standardowego systemu LC-MS o wysokiej rozdzielczości, a także mogą być stosowane do weryfikacji sekwencji zmodyfikowanych terapeutycznych oligonukleotydów RNA. W przyszłości, wraz z opracowaniem bardziej niezawodnych algorytmów i lepszych instrumentów, Metoda ta może pozwolić na sekwencjonowanie bardziej złożonych próbek biologicznych.

Wprowadzenie znacznika biotynowego na koniec 3´ RNA w celu wytworzenia łatwo identyfikowalnych drabin masa-tR. Przepływ pracy w podejściu 2D-HELS MS Seq przedstawiono na Ryc. 1a. Hydrofobowa etykieta biotynowa wprowadzona na koniec 3´ RNA (patrz sekcja 2) zwiększa masy i tR komponentów drabiny znakowanej na końcu 3´ w porównaniu z ich nieznakowanymi odpowiednikami. W związku z tym krzywa drabiny 3´ w dwuwymiarowym wykresie masa-tR jest przesu...

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (<35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

Protokół ten obejmuje wszystkie niezbędne kroki potrzebne podczas korzystania z nowej metody opracowanej do bezpośredniego sekwencjonowania RNA, niezależnie od tego, czy próbka RNA jest jednoniciowa, mieszana czy zmodyfikowana. Metoda nie jest obciążona błędem enzymatycznym ani komplementarnością zasad. Zapewnia bezpośredni przepływ pracy i ogólne rozwiązanie, które umożliwia sekwencjonowanie różnych modyfikacji RNA jednocześnie, a nie jednej konkretnej modyfikacji na raz.Technologia ta może zostać przekształcona w narzędzie diagnostyczne do określania sygnaturowych segmentów RNA w celu powiązania ich z chorobą człowieka oraz dokładne narzędzie do badania modyfikacji RNA na poziomie epitranskryptomicznym. Metoda nie opiera się na żadnej wcześniejszej metodzie sekwencjonowania. Zamiast tego jest to zupełnie nowe podejście, a naszym celem jest uczynienie z niego metody sekwencjonowania dowolnego zmodyfikowanego RNA.Niektóre części tego protokołu zawierają krytyczne aspekty, które można dokładniej przekazać za pomocą demonstracji wizualnej, takie jak oznaczanie końca 3' akwizycji danych RNA LC-MS i analiza danych przez oprogramowanie MassHunter. Zademonstruję tę procedurę, ustawię LC-MS i zmierzę nasze próbki RNA. Aby przeprowadzić jednoetapową reakcję znakowania, połącz 2 mikrolitry 150 mikromolowych AppCp-biotyny, 3 mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego ligazy, 1,5 mikrolitra 100-mikromolowej próbki RNA, 3 mikrolitry bezwodnego DMSO, 10 jednostek ligazy RNA T4 i 19,5 mikrolitrów wody uzdatnionej DEPC, aby uzyskać łączną objętość 30 mikrolitrów.Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza, a następnie przeprowadzić oczyszczanie kolumny zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Po podzieleniu RNA na trzy podwielokrotności i dodaniu równej objętości kwasu mrówkowego, inkubuj reakcje w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po zakończeniu każdej reakcji natychmiast zamrozić próbkę na suchym lodzie, aby schłodzić degradację kwasu.Użyć odśrodkowego koncentratora próżni, aby suszyć próbkę przez około 30 minut. Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 20 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC i połączyć je. Przechowuj próbki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu pomiaru LC-MS.Przenieść próbkę RNA do fiolki z próbką LC-MS po przygotowaniu faz ruchomych. Każde wstrzyknięcie powinno zawierać od 100 do 400 pikomoli RNA i 20 mikrolitrów. Po uzyskaniu danych użyj przepływu pracy wyodrębniania cech molekularnych, aby wyodrębnić informacje o związkach, w tym masę, czas przechowywania, objętość i wynik jakości.Użyj formatu danych centroidu w ustawieniach małych cząsteczek. Ustaw wysokość piku na co najmniej 100, ale mniej niż 1 000, a wynik jakości na co najmniej 50. Na koniec wyeksportuj dane jako plik Excel.Oddzielenie drabiny 3' od drabiny 5' i innych niepożądanych fragmentów jest pokazane tutaj na wykresie czasu retencji masy 2D. Możliwe jest również sekwencjonowanie mieszanych próbek zawierających dwie nici RNA o różnej długości ze znacznikiem 5'biotyny na każdym RNA. Aby odróżnić urydynę od pseudourydyny, RNA potraktowano CMC, który przekształca pseudourydynę w addukt CMC-pseudourydyna.Addukt ma inną masę w urydynie i może być zróżnicowany w 2D-HELS MS Seq. Do obliczenia procentowej konwersji wykorzystano profil HPLC surowego produktu reakcji przekształcającej pseudourydynę w jej addukt CMC, który wynosił 42%Mieszaninę pięciu różnych nici RNA zsekwencjonowano metodą 2D-HELS MS Seq z znakowaniem 3'end i znormalizowano w celu lepszej wizualizacji wielu sekwencji RNA. Bez normalizacji kody literowe sekwencji pięciu RNA byłyby stłoczone razem.Próbując wykonać tę procedurę, należy dokładnie skonfigurować reakcję znakowania, aby uzyskać wysoką wydajność znakowanych próbek RNA. Należy również uważnie monitorować czas degradacji, aby stworzyć niezawodne drabinki masowe i zebrać maksymalną ilość wysuszonych próbek za pomocą 20 mikrolitrów wody. Pytanie, które można zadać po wykonaniu tego protokołu, dotyczy tego, jak zwiększyć szerokość, długość i przepustowość metody sekwencjonowania.Lepszy algorytm i bardziej zaawansowany instrument o wyższej rozdzielczości i czułości mogą pomóc. Po opracowaniu tego protokołu możliwe stało się bezpośrednie sekwencjonowanie szerszego zakresu próbek RNA zawierających zarówno kanoniczne, jak i zmodyfikowane nukleotydy bez żadnych błędów związanych z sekwencjonowaniem RNA na podstawie CDA.

2d-hels-ms-seq-general-lc-ms-based-method-for-direct-de-novo

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Potranskrypcyjne modyfikacje RNA reprezentują niedostatecznie zbadaną warstwę regulacji translacji, która ostatnio została powiązana z plastycznością ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu opisano przygotowanie próbki i podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas w celu jednoczesnej charakterystyki licznych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Ten protokół przedstawia porównawczy proces tworzenia transkryptomu i adnotacji de novo dla początkujących bioinformatyków. Przepływ pracy jest dostępny bezpłatnie całkowicie za pośrednictwem CyVerse i połączony przez magazyn danych. Używany jest wiersz poleceń i graficzne interfejsy użytkownika, ale cały potrzebny kod jest dostępny do skopiowania i wklejenia.

Wykorzystanie zasobów CyVerse do transkryptomiki porównawczej de novo organizmów nieobjętych modelem

Poznaj metodę 2D-HELS MS Seq do bezpośredniego sekwencjonowania RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów bez pośrednictwa cDNA. Technika LC-MS umożliwia jednoczesną analizę epitranskryptyczną z pojedynczą precyzją nukleotydową.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów (Wideo) | JoVE Journal

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Przeglądaj więcej filmów