2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów
10 lipca 2020
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (<35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.
Protokół ten obejmuje wszystkie niezbędne kroki potrzebne podczas korzystania z nowej metody opracowanej do bezpośredniego sekwencjonowania RNA, niezależnie od tego, czy próbka RNA jest jednoniciowa, mieszana czy zmodyfikowana. Metoda nie jest obciążona błędem enzymatycznym ani komplementarnością zasad. Zapewnia bezpośredni przepływ pracy i ogólne rozwiązanie, które umożliwia sekwencjonowanie różnych modyfikacji RNA jednocześnie, a nie jednej konkretnej modyfikacji na raz.
Technologia ta może zostać przekształcona w narzędzie diagnostyczne do określania sygnaturowych segmentów RNA w celu powiązania ich z chorobą człowieka oraz dokładne narzędzie do badania modyfikacji RNA na poziomie epitranskryptomicznym. Metoda nie opiera się na żadnej wcześniejszej metodzie sekwencjonowania. Zamiast tego jest to zupełnie nowe podejście, a naszym celem jest uczynienie z niego metody sekwencjonowania dowolnego zmodyfikowanego RNA.
Niektóre części tego protokołu zawierają krytyczne aspekty, które można dokładniej przekazać za pomocą demonstracji wizualnej, takie jak oznaczanie końca 3' akwizycji danych RNA LC-MS i analiza danych przez oprogramowanie MassHunter. Zademonstruję tę procedurę, ustawię LC-MS i zmierzę nasze próbki RNA. Aby przeprowadzić jednoetapową reakcję znakowania, połącz 2 mikrolitry 150 mikromolowych AppCp-biotyny, 3 mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego ligazy, 1,5 mikrolitra 100-mikromolowej próbki RNA, 3 mikrolitry bezwodnego DMSO, 10 jednostek ligazy RNA T4 i 19,5 mikrolitrów wody uzdatnionej DEPC, aby uzyskać łączną objętość 30 mikrolitrów.
Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza, a następnie przeprowadzić oczyszczanie kolumny zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Po podzieleniu RNA na trzy podwielokrotności i dodaniu równej objętości kwasu mrówkowego, inkubuj reakcje w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po zakończeniu każdej reakcji natychmiast zamrozić próbkę na suchym lodzie, aby schłodzić degradację kwasu.
Użyć odśrodkowego koncentratora próżni, aby suszyć próbkę przez około 30 minut. Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 20 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC i połączyć je. Przechowuj próbki w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu pomiaru LC-MS.
Przenieść próbkę RNA do fiolki z próbką LC-MS po przygotowaniu faz ruchomych. Każde wstrzyknięcie powinno zawierać od 100 do 400 pikomoli RNA i 20 mikrolitrów. Po uzyskaniu danych użyj przepływu pracy wyodrębniania cech molekularnych, aby wyodrębnić informacje o związkach, w tym masę, czas przechowywania, objętość i wynik jakości.
Użyj formatu danych centroidu w ustawieniach małych cząsteczek. Ustaw wysokość piku na co najmniej 100, ale mniej niż 1 000, a wynik jakości na co najmniej 50. Na koniec wyeksportuj dane jako plik Excel.
Oddzielenie drabiny 3' od drabiny 5' i innych niepożądanych fragmentów jest pokazane tutaj na wykresie czasu retencji masy 2D. Możliwe jest również sekwencjonowanie mieszanych próbek zawierających dwie nici RNA o różnej długości ze znacznikiem 5'biotyny na każdym RNA. Aby odróżnić urydynę od pseudourydyny, RNA potraktowano CMC, który przekształca pseudourydynę w addukt CMC-pseudourydyna.
Addukt ma inną masę w urydynie i może być zróżnicowany w 2D-HELS MS Seq. Do obliczenia procentowej konwersji wykorzystano profil HPLC surowego produktu reakcji przekształcającej pseudourydynę w jej addukt CMC, który wynosił 42%Mieszaninę pięciu różnych nici RNA zsekwencjonowano metodą 2D-HELS MS Seq z znakowaniem 3'end i znormalizowano w celu lepszej wizualizacji wielu sekwencji RNA. Bez normalizacji kody literowe sekwencji pięciu RNA byłyby stłoczone razem.
Próbując wykonać tę procedurę, należy dokładnie skonfigurować reakcję znakowania, aby uzyskać wysoką wydajność znakowanych próbek RNA. Należy również uważnie monitorować czas degradacji, aby stworzyć niezawodne drabinki masowe i zebrać maksymalną ilość wysuszonych próbek za pomocą 20 mikrolitrów wody. Pytanie, które można zadać po wykonaniu tego protokołu, dotyczy tego, jak zwiększyć szerokość, długość i przepustowość metody sekwencjonowania.
Lepszy algorytm i bardziej zaawansowany instrument o wyższej rozdzielczości i czułości mogą pomóc. Po opracowaniu tego protokołu możliwe stało się bezpośrednie sekwencjonowanie szerszego zakresu próbek RNA zawierających zarówno kanoniczne, jak i zmodyfikowane nukleotydy bez żadnych błędów związanych z sekwencjonowaniem RNA na podstawie CDA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską metodę sekwencjonowania krótkich cząsteczek RNA opartą na technice LC-MS, która eliminuje konieczność stosowania cDNA jako produktu pośredniego. Protokół ten umożliwia jednoczesne sekwencjonowanie różnych modyfikacji RNA z precyzją do pojedynczej zasady.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Sekwencjonowanie RNA
- Epitranskryptomika
- Biotechnologia
Wstęp
- Obecne metody sekwencjonowania RNA często opierają się na produktach pośrednich w postaci cDNA.
- Błędy enzymatyczne mogą wpływać na dokładność sekwencjonowania.
- Jednoczesne sekwencjonowanie modyfikacji RNA jest trudne.
- Zrozumienie modyfikacji RNA jest kluczowe dla badania ludzkich chorób.
Cel badania
- W celu przedstawienia metody sekwencjonowania bezpośredniego dla RNA.
- W celu umożliwienia badania wielu modyfikacji RNA w ramach jednej analizy.
- W celu zapewnienia niezawodnego narzędzia do badań epitranskrypcyjnych.
Zastosowane metody
- Technika sekwencjonowania oparta na LC-MS.
- Bezpośrednie sekwencjonowanie jednoniciowego, mieszanego lub zmodyfikowanego RNA.
- Eliminacja etapu syntezy cDNA.
- Procedura zaprojektowana w celu zapewnienia wysokiej precyzji i dokładności.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne sekwencjonowanie krótkich cząsteczek RNA (<35 nt) bez konieczności syntezy cDNA.
- Osiągnięto jednoczesną detekcję różnych modyfikacji RNA.
- Technika ta wykazała odporność na błędy enzymatyczne.
- Zidentyfikowano potencjalne zastosowania w diagnostyce chorób ludzkich.
Wnioski
- Ta nowa metoda sekwencjonowania może stać się standardem w analizie modyfikacji RNA.
- Oferuje ona kompleksowe podejście do badania modyfikacji RNA.
- Protokół ten ma istotne znaczenie dla przyszłych badań w dziedzinie biologii RNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda sekwencjonowania RNA oparta na LC-MS umożliwia bezpośrednie sekwencjonowanie de novo mieszanin modyfikowanego RNA bez konieczności syntezy cDNA, co rozwiązuje kluczowy problem w walidacji celów epitranskrypomicznych. Dostarczając ilościowe dane sekwencjonowania z rozdzielczością modyfikacji, wspiera ona wczesne wykrywanie biomarkerów opartych na RNA oraz mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku terapeutycznych oligonukleotydów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów, dostarczając potwierdzonych sekwencyjnie, specyficznych dla modyfikacji wyników, które można bezpośrednio zastosować w procesach przesiewowych i opracowywaniu testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie modyfikacji RNA, takich jak pseudourydyna i 5-metylocytozyna, w ich natywnym kontekście.
- Wartość operacyjna: Stanowi uniwersalne rozwiązanie dla jednoczesnego wykrywania nukleotydów kanonicznych i zmodyfikowanych, ograniczając konieczność przeprowadzania sekwencyjnych analiz specyficznych dla poszczególnych modyfikacji.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w identyfikacji celów dzięki bezpośredniej korelacji czasu retencji masy zmodyfikowanych nukleobaz, co ułatwia dokładne mapowanie modyfikacji w konkretnych miejscach.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane dotyczące masy i czasu retencji, które umożliwiają niezawodne rozróżnienie sekwencji RNA w mieszaninach zawierających do 12 różnych oligonukleotydów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalne dane gotowe do normalizacji, kompatybilne ze standardowymi systemami LC-MS o wysokiej rozdzielczości, co wspiera standaryzację analiz w panelach krótkich RNA.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszego screeningu poprzez otrzymywanie standardów RNA o zweryfikowanej sekwencji i zdefiniowanych wzorach modyfikacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera weryfikację sekwencji zmodyfikowanych terapeutycznych oligonukleotydów RNA, łącząc modyfikacje z fazy odkryć z oceną kandydatów w badaniach przedklinicznych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia wykrywanie przesunięć masy wywołanych modyfikacjami (np. adduktu CMC-pseudourydyny), aby odróżnić rzeczywisty sygnał od artefaktów degradacji w złożonych próbkach.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Zapewnia potwierdzenie sekwencji bez obciążenia enzymatycznego, co zmniejsza liczbę wyników fałszywie ujemnych w przesiewaniu modyfikacji i zwiększa niezawodność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania jako wstępne narzędzie sekwencjonowania do analizy RNA sterowanej hipotezami, wspierając identyfikację wiodących kandydatów poprzez potwierdzenie sekwencji oraz stanu modyfikacji syntetycznych lub endogennych celów RNA przed badaniami przesiewowymi funkcji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez dostarczanie bezpośrednich dowodów na współwystępowanie sekwencji RNA i modyfikacji w mieszaninach natywnych lub syntetycznych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testu poprzez generowanie drabin czasów retencji masy, które służą jako ilościowe referencje dla modyfikacji RNA indukowanych związkami lub profilowania degradacji.
- Analityka: Generuje dane o cechach molekularnych oparte na centroidach (masa, czas retencji, objętość, wynik jakości) eksportowalne do programu Excel, co umożliwia porównywanie różnych warunków i statystyczną ocenę stabilności modyfikacji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczanie zweryfikowanych sekwencyjnie standardów modyfikowanego RNA, odpowiednich do dopasowania biomarkerów i walidacji funkcjonalnej w systemach istotnych dla chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku możliwość oparta na LC-MS do szybkiego sekwencjonowania krótkich wariantów RNA (<35 nt), co zmniejsza zależność od outsourcingu sekwencjonowania i przyspiesza wewnętrzne cykle przesiewania modyfikacji.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez eliminację błędów związanych z cDNA oraz umożliwienie bezpośredniej obserwacji sygnatur masowych specyficznych dla danej modyfikacji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji etapu znakowania, gwałtownego schładzania kwasem oraz normalizacji, co minimalizuje zmienność między poszczególnymi analizami w złożonych mieszaninach RNA.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wewnętrznego sekwencjonowania zmodyfikowanego RNA, co redukuje zależność od zewnętrznych dostawców i przyspiesza cykle iteracyjne w optymalizacji wiodących kandydatów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie jednoznacznych danych dotyczących sekwencji i modyfikacji, co zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach z powodu niewykrytej heterogeniczności RNA lub błędnej adnotacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu pracy z RNA, obsługi LC-MS oraz ekstrakcji cech molekularnych w programie MassHunter w celu dokładnej interpretacji danych.
- Metoda zależy od dostępu do systemów LC-MS o wysokiej rozdzielczości, umożliwiających akwizycję danych w trybie centroid z określonymi progami wysokości piku (100–1000) i oceny jakości (≥50).
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja wydajności znakowania, czasu degradacji oraz protokołów normalizacji, aby zapewnić spójne generowanie drabinek mas u różnych użytkowników i na różnych platformach.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji metody przy rozszerzaniu jej zastosowania poza krótkie RNA (<35 nt) lub na złożone próbki biologiczne, w oczekiwaniu na przyszłe ulepszenia algorytmów i aparatury.
- Występują ograniczenia praktyczne, w tym obecne limity przepustowości oraz zależność od ręcznej optymalizacji reakcji znakowania (np. AppCp-biotyna, ligaza T4, DMSO) w celu maksymalizacji wydajności i rozdzielczości drabinek.
