Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Obecny protokół analizuje niedrogą i prostą metodę łączonego neuroanatomicznego i elektrofizjologicznego śledzenia obwodów nerwowych in vivo. Technika ta pozwala na mapowanie zakończeń adiunktowych z określonej populacji neuronów do miejsca docelowego. Podobnie, mapa anatomiczna tych końców może być zweryfikowana przez stymulację optogenetyczną podczas zapisu zewnątrzkomórkowego w miejscu docelowym.

Protokół ten może być stosowany do badania wielu obwodów neuronalnych związanych z funkcjami sensorycznymi, motorycznymi i poznawczymi. Wykonanie tej procedury wymaga pewnej wiedzy na temat chirurgii stereotaktycznej gryzoni i obchodzenia się z delikatnymi elektrodami nerwowymi. Podłączenie systemu nagrywania, aby zapobiec zakłóceniom w nagraniach.

Demonstracja wizualna przedstawia podstawowe kroki w tworzeniu przystępnego cenowo systemu LED do optogenetyki in vivo. Pokazuje również, jak połączyć wzmacniacz ze sterownikiem LED w celu zsynchronizowanego nagrywania i stymulacji w znieczulonej myszy. Umieść poduszkę grzewczą na ramie stereotaktycznej tak, aby leżał na niej korpus myszy, co pomoże utrzymać temperaturę ciała przez cały zabieg, a następnie delikatnie przymocuj głowę do aparatu stereotaktycznego.

Przygotuj obszar operacyjny, czyszcząc go najpierw roztworem jodu, a następnie alkoholem w celu usunięcia jodu. Następnie zastosuj miejscowo lidokainę, aby zablokować czucie na skórze głowy. Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej rozciągające się od okolicy czołowej do potylicznej.

W przypadku brzusznego obszaru nakrywki lub wstrzyknięcia VTA, umieść ultracienką strzykawkę z końcem na ujemnych 3,08 milimetra przednich tylnych i 0,5 milimetra przyśrodkowych współrzędnych bocznych względem bregmy. Użyj narzędzia wiertniczego, aby wywiercić jednomilimetrowy otwór w czaszce w zaznaczonej współrzędnej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zamocować uchwyt strzykawki na mikromanipulatorze i napełnić strzykawkę podwójnie destylowaną wodą, aby oczyścić i przetestować przepływ płynu.

Następnie nalej wodę, aby sprawdzić przepływ strzykawki. Rozmrozić porcje wirusa związanego z adenowirusem lub koktajlem AAV na lodzie. Napełnij zamontowaną strzykawkę 1 000 nanolitrów roztworu AAV i dozuj 10 nanolitrów roztworu, aby potwierdzić przepływ cieczy.

Użyj mikromanipulatora, aby opuścić igłę do miejsca wstrzyknięcia i wstrzyknąć od 600 do 800 nanolitrów AAV do VTA, dostarczając roztwór z prędkością 60 nanolitrów na minutę. Trzy tygodnie po wstrzyknięciu AAV przymocuj głowę zwierzęcia do ramy stereotaktycznej, jak opisano wcześniej, i wykonaj kraniotomię w celu odsłonięcia opony twardej. Użyj narzędzia wiertniczego, aby usunąć część kości ciemieniowej.

Pod mikroskopem preparacyjnym użyj wygiętej końcówki igły o rozmiarze 27, aby wyciąć odsłoniętą oponę twardą, uważając, aby nie rozerwać delikatnej powłoki skórnej i tkanek korowych w tym obszarze. Nałóż krople sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego na obszar kraniotomii, aby zapobiec wysuszeniu. Wywierć otwór w kości potylicznej, aby przytrzymać uziemiającą i podłącz przewód uziemiający ze stali nierdzewnej.

Przed opuszczeniem kaniuli podłącz światłowodowy do źródła LED sprzężonego ze światłowodem. Opuść światłowód o średnicy 400 mikrometrów do VTA na współrzędnych AP ujemnych 3,08 milimetra i ML 0,5 milimetra. Za pomocą mikromanipulatora umieść miejsca kontaktu elektrody w piramidalnej warstwie ogniwa CA1.

Aby zsynchronizować impuls świetlny z zapisem neuronowym, podłącz sterownik LED i cyfrowy import kontrolera nagrywania do impulsera logicznego tranzystor-tranzystor z rozgałęźnikiem BNC. Wyreguluj pokrętło, aby określić efektywną intensywność, która może wygenerować odpowiedź bez wytwarzania artefaktów fotoelektrycznych i połącz uziemienie na czaszce z uziemieniem adaptera. Podłącz stopień główny przedwzmacniacza do kontrolera nagrywania za pomocą interfejsu szeregowego urządzeń peryferyjnych i sprawdź kolorowe diody LED na portach kontrolera nagrywania.

Zielone i żółte diody LED wskazują prawidłowe napięcie na podłączonej płytce wzmacniacza, a czerwona dioda LED wskazuje działające oprogramowanie sterujące głównym stopniem. Po uruchomieniu oprogramowania wybierz format pliku danych i zmień nazwę pliku. Przełącz się na port podłączonego stopnia głowicy i kliknij wyłącz wszystko na porcie, jeśli elektroda ma mniej kanałów niż stopień głowicy.

Wybierz odpowiednią liczbę kanałów, które mają być wyświetlane na ekranie. Aby przechwycić znacznik czasu TTL dla zsynchronizowanego zapisu neuronowego i znacznika czasu wyzwalania impulsem świetlnym, kliknij import cyfrowy i włącz cyfrowy w zero jeden. Musi to być zgodne z połączeniem BNC we wzmacniaczu importu cyfrowego.

Dostosuj skalę czasową i skalę napięcia dla odpowiedniego wyświetlania przebiegu i wybierz częstotliwość próbkowania, pamiętając, że wyższa częstotliwość próbkowania i liczba kanałów zwiększy rozmiar pliku. Następnie ustaw szerokość pasma wzmacniacza dla nagrywania pojedynczej jednostki. Zastosowano tutaj częstotliwość odcięcia od 300 do 5 000 Hz.

Aby uzyskać dźwięk skokowy, kliknij analogowe wyjście audio i włącz port analogowy. Następnie dostosuj wzmocnienie i tłumik, aby uzyskać optymalny dźwięk. Aby zsynchronizować nagrywanie wzmacniacza i ciąg impulsów świetlnych, kliknij zakładkę wyświetlacza i włącz znacznik pokazu.

Przełącz się na odpowiedni kanał, który odpowiada połączeniu BNC i ponownie sprawdź porty, aby upewnić się, że kanały nagrywania i kanał wejścia cyfrowego są włączone do przechwytywania skoków neuronowych i znaczników czasu impulsów świetlnych. Kliknij na lunetę spajków, aby wyświetlić przebiegi, które składają się na ciąg ciągów spajków. Użyj myszki, aby ustawić próg dla krzywych do wyświetlenia.

Następnie sprawdź RMS, aby określić poziom szumów w nagraniu. Ekspresję wirusa związanego z adenowirusem zweryfikowano za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego EYFP w brzusznej części nakrywki myszy 21 dni po wstrzyknięciu. Obrazowanie fluorescencyjne wykorzystano również do wykrycia presynaptycznych projekcji glutaminianu VTA w warstwach hipokampa DG, CA3 i CA1.

Po wykryciu aktywności napięcia zewnątrzkomórkowego, aktywność wyjściowa była rejestrowana przez około 10 minut przed wyzwoleniem impulsu świetlnego o pożądanej częstotliwości. Umożliwiło to porównanie szybkości wystrzeliwania lub wybuchu przypuszczalnych neuronów CA1 przed i po fotostymulacji glutaminianu VTA. Aby potwierdzić ten wynik, statystyczne porównanie szybkości wypalania sieci CA1 przed i po fotostymulacji wykazało znaczny wzrost w okresie po stymulacji.

Późniejsza analiza ciągu rastrowego w celu wykrycia rozbłysków również wykazała zwiększoną szybkość impulsów dla przypuszczalnych neuronów piramidowych CA1 po fotostymulacji. Odpowiedź na fotosymulację zidentyfikowano na podstawie fluorescencji ekspresji reporterowej AAV w miejscach bodźców. Ponadto opis powinien być skorelowany z miejscem nagrania dla reagujących jednostek przypuszczalnych.

Metodę tę można również wykonać u obudzonych myszy podejmujących zadania behawioralne. W takim przypadku należy zastosować przewlekle wszczepialne sondy i kaniulę światłowodową. Technika ta pozwoli na solidne śledzenie obwodów neuronowych poprzez połączenie presynaptycznej dystrybucji końcówek w miejscu docelowym i modulacji końców presynaptycznych w celu wykrycia odpowiedzi miejsca docelowego in vivo.