Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

W tym filmie zademonstrujemy hodowlę górnych zwojów szyjnych embrionalnych szczurów do analizy morfologicznej i proteomicznej. Przed przystąpieniem do preparacji należy przygotować pożywki kontrolne i preparacyjne. Pożywka kontrolna zawiera F-12 i DMEM o niskiej stężeniu glukozy uzupełnione mieszaniną insuliny, selenu i transferyny, glutaminy, czynnika wzrostu nerwów i BSA.

Pożywka preparcyjna zawiera L-15 uzupełnioną o paciorkowce i BSA. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami przygotowania podłoża. Przygotowanie płytek do hodowli neuronów.

Rozcieńczyć jeden miligram na mililitr poli-D-lizyny do 100 mikrogramów na mililitr sterylną wodą destylowaną. W celu analizy proteomicznej lub genomicznej, na jeden do dwóch dni przed preparacją, pokryj sześciodołkowe płytki około dwoma mililitrami sterylnych 100 gramów na mililitr poli-D-lizyny. Jest to konieczne, aby zapewnić przyleganie komórek do studni.

Owiń talerze folią spożywczą i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dniu sekcji, przed rozpoczęciem sekcji, należy usunąć roztwór poli-D-lizyny ze studzienek i przepłukać studzienki pięć razy sterylną wodą destylowaną, a następnie raz DMEM o niskiej zawartości glukozy. Podczas trawienia enzymatycznego zwojów, około godziny przed posiewem komórek, odessać DMEM z płytek i zastąpić go 0,3 mililitra pożywki kontrolnej.

Przechowuj płytki w temperaturze 35 stopni Celsjusza poniżej 5% CO2 w wilgotnej komorze. W kapturze ustaw następujące elementy do sekcji. Cztery sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 mililitrów z około 20 mililitrami pożywki preparacyjnej w każdej probówce.

Cztery sterylne 35-milimetrowe naczynia z 1,5 mililitra pożywki preparucyjnej. Jedna sterylna stożkowa probówka o pojemności 50 mililitrów z 20 mililitrami pożywki do odwirowania. Jedna sterylna stożkowa probówka o pojemności 15 mililitrów do odwirowania zwojów nerwowych, jedna sterylna probówka o pojemności 10 mililitrów do zbierania zdysocjowanych komórek.

Użyj sterylizatora do suchych kulek, aby sterylizować parę cienkich kleszczy przez co najmniej jedną minutę. Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Saint Mary's College of California. Wytyczne dotyczące pielęgnacji i użytkowania zwierząt w Saint Mary's College of California zostały opracowane w oparciu o wytyczne dostarczone przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych w National Institutes for Health.

Usunięcie zarodków E21 od ciężarnej szczurki. Należy pamiętać, że usunięcie rogu macicy można wykonać na zewnątrz kaptura, jeśli otoczenie jest dokładnie wysterylizowane. Poddaj eutanazji ciężarną szczur za pomocą wdychania CO2.

Ścinaj sierść w okolicy brzucha i przetrzyj skórę w tym obszarze 70% alkoholem, aby ją wysterylizować. Używając świeżego zestawu sterylnych nożyczek i kleszczy, przetnij skórę, a następnie mięsień, aby odsłonić rogi macicy zawierające zarodki. Usuń róg macicy wraz z zarodkami, używając nowego zestawu nożyczek i kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić przy tym jelit.

Przenieś róg macicy z zarodkami na sterylną szalkę Petriego o średnicy 150 milimetrów i przenieś je do kaptura. Za pomocą nowego zestawu kleszczy i nożyczek usuń zarodki z rogu macicy i oddziel zarodki od błon owodniowych i łożyska. Aby poddać eutanazji zarodki, przetnij rdzeń kręgowy zarodków wzdłuż linii środkowej pod prawym ramieniem.

Zmniejszy to krwawienie z tętnicy szyjnej podczas usuwania SCG. Przenieś te zarodki do przygotowanych 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających pożywkę do preparacji. Upewnij się, że zarodki są zanurzone w pożywce.

Każda probówka może pomieścić do trzech zarodków. Izolacja górnego zwoju szyjnego od zarodka. Przenieść jedno szczenię z pożywki preparacyjnej na sterylną 150-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną do połowy stałym podłożem tak, aby jej grzbietowa powierzchnia znajdowała się na podłożu.

Używając trzech sterylnych igieł o rozmiarze 23, przypnij pub do naczynia za pomocą jednej igły pod każdym ramieniem i trzeciej igły przez usta, aby ostrożnie przeprostować szyję. Przetnij skórę w okolicy szyi za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków, aby odsłonić gruczoły ślinowe pod spodem. Usuń te gruczoły za pomocą cienkich kleszczy.

Zlokalizuj mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i omohyoidalne odpowiednio w pobliżu obojczyka i tchawicy. Najpierw przetnij mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe. A następnie ostrożnie przeciąć cienki mięsień omohyoidalny za pomocą cienkich kleszczy.

Po usunięciu tych mięśni rozwidlenie w tętnicy szyjnej na przednim końcu będzie widoczne po obu stronach tchawicy z SCG zlokalizowanym pod tym rozwidleniem w tętnicy szyjnej. Za pomocą zamkniętych kleszczy delikatnie unieś tętnicę szyjną, aby uwidocznić SCG. Używając jednego kleszcza po obu stronach SCG, wyciągnij tętnicę szyjną i przenieś ją do przygotowanych sterylnych 35-milimetrowych szalek.

Tkanka ta najprawdopodobniej będzie zawierać SCG z tętnicą szyjną, nerw błędny z zwojami bez dawki, a także inne segmenty mięśni lub tłuszczu w okolicy. Powtórz proces preparowania po drugiej stronie. Usuń SCG ze wszystkich zarodków przed kontynuowaniem pozostałych etapów sekcji.

Rozmieść izolowane tkanki między dwiema z 35-milimetrowych szalek, aby ułatwić przetwarzanie próbek tkanek. Przetwarzanie końcowe SCG. Aby oddzielić SCG od wypreparowanej tkanki, najpierw użyj cienkich kleszczy, aby usunąć wszelkie obce tkanki, takie jak mięśnie lub tłuszcz, uważając, aby uniknąć obszaru w pobliżu rozwidlenia tętnicy szyjnej.

Po usunięciu tych tkanek widoczne są dwa zwoje. Gangion nodose jest mniejszy i okrągły, podczas gdy SCG ma kształt migdała. Delikatnie pociągnij za nerw błędny, aby oddzielić nerw błędny i zwoje nerwowe bez dawki od tętnicy szyjnej, a następnie oddziel SCG od tętnicy szyjnej.

Użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kapsułkę otaczającą SCG. Przenieś SCG do nowej 35-milimetrowej płytki hodowlanej. Powtórz ten proces ze wszystkimi wypreparowanymi próbkami tkanek.

Pokryj wysterylizowaną, szklaną pipetę z bawełnianym korkiem środkiem do preparacji, aby zapobiec przywieraniu tkanki do ścianek pipety. Za pomocą pipety zastąp pożywkę separacyjną sterylnymi dwoma mililitrami kolagenazy typu II, rozprowadź typ II w HBSS bez wapnia i magnezu i inkubuj przez 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby pomóc rozbić tkanki. Należy pamiętać, że czas inkubacji może wymagać optymalizacji dla różnych partii kolagenazy/dypazy i zwykle wynosi od 40 minut do godziny.

Po inkubacji przenieść SCG i kolagenazę/dypazę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Użyj pożywki do preparacji, aby przepłukać płytki i przenieść roztwór do probówki. Dodaj tyle pożywki do preparacji, aby doprowadzić objętość do około 10 mililitrów.

Wirować przy 200 x g, 1 000 do 1 200 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia próbki. Odessać supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu. Zawiesić osad z 10 mililitrami pożywki preparyjnej, powtórzyć wirowanie i wyrzucić supernatant.

Zastąp jednym do dwóch mililitrów pożywki hodowlanej. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura o wąskim otworze i wygiętej końcówce, wstępnie pokryj ją pożywką hodowlaną, mechanicznie rozdziel grudki, delikatnie rozcierając je pięć do sześciu razy. Pozwól większym grudkom osiąść na około minutę i przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do nowej 10-mililitrowej probówki.

Powtórz ten proces jeszcze trzy razy ze zwiększającą się siłą rozcierania za każdym razem, aby zapewnić prawie całkowitą dysocjację SCG. Przenieś supernatant po każdej rundzie rozcierania do 10-mililitrowej probówki z supernatantem z pierwszego roztarcia. Dodaj tyle pożywki hodowlanej, aby zwiększyć objętość do ośmiu do 10 mililitrów.

Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i określ ilościowo gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Rozprowadzić zawiesinę komórkową do studzienek o gęstości komórek odpowiedniej do eksperymentów. Podczas procesu powlekania należy w sposób ciągły mieszać zawiesinę komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w studzienkach.

W celu analizy morfologicznej umieść komórki około 8 000 komórek na studzience na płytce 24-dołkowej. A w przypadku protokołów genomicznych i proteomicznych należy umieścić komórki na poziomie do 30 000 komórek na studzienkę. Przenieś płytki do szklanego eksykatora ze sterylną wodą na dnie, aby utworzyć nawilżoną komorę.

Wstrzyknąć wystarczającą ilość CO2, około 120 mililitrów, aby uzyskać środowisko 5% CO2 w eksykatorze, przed uszczelnieniem. Utrzymuj płytki w temperaturze 35,5 stopni Celsjusza. W protokole jest to określane jako dzień zerowy.

Płytki te mogą być również przechowywane w zwykłym inkubatorze o stężeniu 5% CO2. Opisana powyżej metoda minimalizuje zmiany temperatury i pH, a także pomaga zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu. Utrzymanie hodowanych neuronów SCG i leczenie.

Te zdjęcia pokazują zdysocjowane górne komórki zwojów szyjki macicy w dniu zero, pierwszym i piątym. Obraz dnia zerowego przedstawia komórki po posianiu. Komórki posiane w dniu zero zawierają mieszaninę komórek zarówno neuronalnych, jak i nieneuronalnych.

Pierwszego dnia, 24 godziny po posiewie, ostrożnie usuń połowę pożywki hodowlanej i zastąp ją dwoma mikromolowymi Ara-C, cytozyną D-arabinofuranozydem, środkiem antymitotycznym. Pozostaw zabieg na komórkach na 48 godzin. Zwykle taka długość leczenia jest wystarczająca do wyeliminowania komórek nieneuronalnych w hodowli.

Trzeciego dnia delikatnie odessać połowę pożywki i zastąpić ją pożywką kontrolną. Czwartego dnia komórki są gotowe do eksperymentalnego leczenia. Karm kultury co drugi dzień odpowiednią pożywką.

Delikatnie zastępując połowę pożywki w studzience świeżym podłożem. Zdjęcie z piątego dnia pokazuje rozległy wzrost aksonów bez zaobserwowanego wzrostu dendrytycznego. Aby wywołać wzrost dendrytyczny, neurony można hodować na Matrigel lub traktować 10% surowicą lub 50 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości-7.

Rycina druga przedstawia zmiany w morfologii neuronów SCG szczura E21 po leczeniu BMP-7. Reprezentatywne mikrofotografie z kontrastem fazowym w powiększeniu 10-krotnym pokazują koliste ciało komórki neuronalnej z aksonami w neuronach kontrolnych w panelu A oraz neurony z wieloma krótkimi wyrostkami dendrytowymi po potraktowaniu BMP-7, pokazane strzałkami w panelu B. Hodowane neurony SCG po odpowiednim leczeniu mogą być wykorzystane do analizy morfologicznej przy użyciu barwienia immunocytochemicznego do analizy genomowej i do badań biochemicznych, na przykład do analiz proteomicznych. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami barwienia immunologicznego i przygotowania próbek do analizy proteomicznej.

Rycina trzecia przedstawia barwienie immunologiczne białkiem MAP-2 w hodowanych neuronach współczulnych szczurów embrionalnych. Panele od A do D pokazują hodowane neurony SCG traktowane pożywką kontrolną, a panele od E do H pokazują neurony traktowane BMP-7 w dawce 50 nanogramów na mililitr przez pięć dni. Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające immunocytochemiczne barwienie neuronów białkiem związanym z mikrotubulami-2 w C i G, barwienie jądrowe w D i H z mikrografiami kontrastu fazowego w B i F oraz wyłanianie się trzech kanałów w A i D. Barwienie immunocytochemiczne z białka związanego z mikrotubulami-2 jest obecne w ciele komórki i proksymalnych aksonach neuronów kontrolnych w panelu C. I barwienie białkiem MAP-2 w ciele komórki, i dendryty w neuronach traktowanych BMP-7 znajdują się w panelu G. Oto próbka górnych zwojów szyjnych potraktowanych pożywką kontrolną, która wykryła 1 100 białek.

Ontologia genów z wykorzystaniem bazy danych Panther wykazała, że większość białek była cytoplazmatyczna. Jednak w próbce znajdowały się białka związane z błoną i białka na połączeniach komórkowych. Analiza ta ujawniła również, że w próbce wykryto białka, które są zaangażowane w szeroki wachlarz neuronalnych szlaków sygnałowych.

Podsumowując, po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować i wyhodować embrionalne neurony zwoju szyjnego szczura w celu analizy morfologicznej i proteomicznej. Praca ta została sfinansowana przez fundusz rozwoju wydziału i letni program badawczy w Saint Mary's College of California.