Name: Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: Poznaj metodę hodowli neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych szczura do analizy morfologicznej i proteomicznej. Protokół obejmuje izolację komórek, barwienie immunocytochemiczne oraz przygotowanie próbek do spektrometrii mas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusz Rozwoju Wydziału i grant Letniego Programu Badawczego w Saint Mary's College of California. Autorzy chcieliby również podziękować dr Pameli Lein z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis i dr Anthony'emu Iavarone z UC Berkeley Mass spectrometry facility za ich rady podczas opracowywania tych protokołów. Autorzy chcieliby również podziękować Haley Nelson z Office of College Communications w Saint Mary's College of California za jej pomoc w produkcji i edycji wideo.

<ol><li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li>
<li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li>
<li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li>
<li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li>
<li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li>
<li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li>
<li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li>
<li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li>
<li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li>
<li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).</li>
<li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li>
<li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatera-Naranjo%2C+O+%22RNA+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">RNA (New York, N.Y.)</a>. 16 (8), 1516-1529 (2010).</li>
<li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+%CE%B2-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li>
<li>Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li>
<li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+version+11%3A+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways%2C+and+data+analysis+tool+enhancements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li>
<li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li>
<li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li>
<li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture%3A+Autonomic+and+Enteric+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%2C+EMBS%22%5BJournal%5D)">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+31st+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%3A+Engineering+the+Future+of+Biomedicine%2C+EMBC+2009%22%5BJournal%5D)">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li>
<li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+Primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).</li>
<li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clujul+Medical%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).</li>
<li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano protokoły hodowli neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych embrionalnych szczeniąt szczurów. Zaletą stosowania tego systemu modelowego jest to, że możliwe jest uzyskanie jednorodnej populacji neuronów zapewniających podobną odpowiedź na czynniki wzrostu, a ponieważ wymagania dotyczące czynników wzrostu dla tych neuronów zostały dobrze scharakteryzowane, możliwe jest hodowanie tych neuronów in vitro w określonych podłożach, w warunkach wolnych od surowicy10. Chociaż proto...

Neurony współczulne pochodzące z embrionalnych górnych zwojów szyjnych (SCG) były szeroko stosowane jako podstawowy system hodowli neuronów do badania wielu aspektów rozwoju neuronów, w tym zależności od czynnika wzrostu, interakcji neuron-cel, sygnalizacji neuroprzekaźników, wzrostu aksonów, rozwoju i plastyczności dendrytów, synaptogenezy i mechanizmów sygnalizacyjnych leżących u podstaw interakcji nerw-cel/neuron-glej1,2,3,4,5,6,7,8,9. Pomimo ich niewielkich rozmiarów (około 10000 neuronów/zwojów), istnieją trzy główne powody rozwoju i szerokiego wykorzystania tego systemu hodowli: i) będąc pierwszymi zwojami w łańcuchu współczulnym, są większe, a zatem łatwiejsze do wyizolowania, niż reszta zwojów współczulnych10; ii) w przeciwieństwie do neuronów centralnych, neurony w SCG są dość jednorodne, a wszystkie neurony pochodzą z grzebienia nerwowego, mają podobny rozmiar, zależność od czynnika wzrostu nerwów i są nor-adrenergiczne. To sprawia, że są one cennym modelem do badań morfologicznych i genomicznych10,11 i iii) neurony te mogą być utrzymywane w określonym pożywce wolnej od surowicy zawierającej czynnik wzrostu nerwów przez ponad miesiąc10,12. Okołoporodowe neurony SCG są szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów leżących u podstaw inicjacji i utrzymania dendrytów2. Dzieje się tak głównie dlatego, że chociaż neurony SCG mają rozległą dendrytyczną altanę in vivo, nie rozszerzają dendrytów in vitro przy braku surowicy, ale mogą być indukowane do wzrostu dendrytów w obecności pewnych czynników wzrostu, takich jak białka morfogenetyczne kości2,12,13.
Ten artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli embrionalnych szczurzych neuronów SCG. W ciągu ostatnich 50 lat pierwotne hodowle neuronów z SCG były wykorzystywane głównie do badań morfologicznych, z ograniczoną liczbą badań analizujących zmiany genomiczne lub proteomiczne na dużą skalę. Wynika to głównie z małego rozmiaru tkanki, co skutkuje izolacją niewielkich ilości DNA lub białka, co utrudnia przeprowadzanie analiz genomicznych i proteomicznych tych neuronów. Jednak w ostatnich latach zwiększona czułość wykrywania umożliwiła opracowanie metod badania genomu, miRNome i proteomu w neuronach SCG podczas rozwoju wzrostu dendrytycznego14,15,16,17. W artykule opisano również metodę analizy morfologicznej tych neuronów z wykorzystaniem immunocytochemii oraz protokół otrzymywania ekstraktów białek neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td>2D nanoACQUITY</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>R& D Systems</td><td>354-BP</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Aluminium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Corning</td><td>CLS-3010</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar lub Nunc Płaskodenne płytki do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200, 140675, 142475</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna- &beta;- D-arabinofuranozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem D (bez wapnia i magnezu)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Niska glukoza + glutamina, + pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126609</td><td>20 mg / ml zapas DMEM o niskiej stężeniu glukozy</td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste Dumont nr 4 i nr 5</td><td>Ted Pella Inc</td><td>5621, 5622</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze i nożyczki do preparacji</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1328, 1329, 5002</td><td></td></tr><tr><td>Szklane wargi ochronne - 12mm</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>Kozio-Anty Mysia IgG Alexa 488 sprzężona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych F-12 szynki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (bez wapnia i magnezu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-selen-transferyna (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Materiały montażowe do szkiełek nakrywkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931, P36934</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-MAP2 (SMI-52)</td><td>BioLegend</td><td>SMI 52</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów</td><td>Envigo Bioproducts (dawniej Harlan Bioproducts)</td><td>BT5017</td><td>Stock 125 &mu; g / ml w 0,2% Prionex w DMEM</td></tr><tr><td>Paraformaldehye</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Prionex</td><td>Millipore</td><td>529600</td><td>10% roztwór, 100 ml</td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters Corporation</td><td>186001861</td><td>5 X 1 mg</td></tr><tr><td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy - Klasa sekwencjonowania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>10 X 1 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega lub NEB</td><td>V511A, P8101S</td><td>100 &mu; g lub 5 X 20 mg</td></tr><tr><td>Wody Fiolki do całkowitego odzysku</td><td>Waters Corporation</td><td>186000385c</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Neurony współczulne z embrionalnych górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) zostały użyte jako system modelowy in vitro dla neuronów obwodowych do badania wzrostu aksonów, transportu aksonalnego, synaptogenezy, wzrostu dendrytycznego, plastyczności dendrytycznej i interakcji nerw-cel w systemach kokulturowych. Protokół ten opisuje izolację i dysocjację neuronów z górnych zwojów szyjnych zarodków szczurów E21, a następnie przygotowanie i utrzymanie czystych kultur neuronalnych w pożywce wolnej od surowicy. Ponieważ neurony nie przylegają do niepowlekanego plastiku, neurony będą hodowane na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych lub 6-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną. Po leczeniu środkiem antymitotycznym (Ara-C, cytozyna β-D-arabinofuranozyd), protokół ten generuje zdrowe kultury neuronalne z mniej niż 5% komórek nieneuronalnych, które można utrzymać przez ponad miesiąc in vitro. Chociaż embrionalne neurony SCG szczurów są wielobiegunowe z 5-8 dendrytami in vivo; W warunkach bez surowicy neurony te rozciągają tylko jeden akson w hodowli i pozostają jednobiegunowe przez cały czas trwania hodowli. Jednak neurony te mogą być indukowane do wydłużania dendrytów w obecności ekstraktu z błony podstawnej, białek morfogenetycznych kości (BMP) lub 10% płodowej surowicy cielęcej. Te jednorodne kultury neuronalne można wykorzystać do barwienia immunocytochemicznego i do badań biochemicznych. W artykule opisano również zoptymalizowany protokół barwienia immunocytochemicznego białka związanego z mikrotubulami-2 (MAP-2) w tych neuronach oraz przygotowania ekstraktów neuronalnych do spektrometrii mas.

Izolacja i utrzymywanie kultur neuronalnych neuronów embrionalnego SCG 
Dysocjowane komórki z embrionalnego SCG szczura wysiano na płytkę lub szkiełko podstawowe pokryte poli-D-lizyną i utrzymywano w bezserumowym medium hodowlanym zawierającym b-czynnik wzrostu nerwów. Dysocjowane komórki, stanowiące mieszaninę neuronów i komórek glejowych, po wysianiu mają kształt kolisty (Rycina 1A). W ciągu 24 godzin od wysiania neurony wytwarzają krótkie wypustki aksonalne, natomiast ...

Ten artykuł opisuje izolację i hodowlę embrionalnych neuronów współczulnych szczurów z górnych zwojów szyjnych. Zawiera również szczegółowe protokoły barwienia immunocytochemicznego i przygotowywania ekstraktów neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

W tym filmie zademonstrujemy hodowlę górnych zwojów szyjnych embrionalnych szczurów do analizy morfologicznej i proteomicznej. Przed przystąpieniem do preparacji należy przygotować pożywki kontrolne i preparacyjne. Pożywka kontrolna zawiera F-12 i DMEM o niskiej stężeniu glukozy uzupełnione mieszaniną insuliny, selenu i transferyny, glutaminy, czynnika wzrostu nerwów i BSA.Pożywka preparcyjna zawiera L-15 uzupełnioną o paciorkowce i BSA. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami przygotowania podłoża. Przygotowanie płytek do hodowli neuronów.Rozcieńczyć jeden miligram na mililitr poli-D-lizyny do 100 mikrogramów na mililitr sterylną wodą destylowaną. W celu analizy proteomicznej lub genomicznej, na jeden do dwóch dni przed preparacją, pokryj sześciodołkowe płytki około dwoma mililitrami sterylnych 100 gramów na mililitr poli-D-lizyny. Jest to konieczne, aby zapewnić przyleganie komórek do studni.Owiń talerze folią spożywczą i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dniu sekcji, przed rozpoczęciem sekcji, należy usunąć roztwór poli-D-lizyny ze studzienek i przepłukać studzienki pięć razy sterylną wodą destylowaną, a następnie raz DMEM o niskiej zawartości glukozy. Podczas trawienia enzymatycznego zwojów, około godziny przed posiewem komórek, odessać DMEM z płytek i zastąpić go 0,3 mililitra pożywki kontrolnej.Przechowuj płytki w temperaturze 35 stopni Celsjusza poniżej 5% CO2 w wilgotnej komorze. W kapturze ustaw następujące elementy do sekcji. Cztery sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 mililitrów z około 20 mililitrami pożywki preparacyjnej w każdej probówce.Cztery sterylne 35-milimetrowe naczynia z 1,5 mililitra pożywki preparucyjnej. Jedna sterylna stożkowa probówka o pojemności 50 mililitrów z 20 mililitrami pożywki do odwirowania. Jedna sterylna stożkowa probówka o pojemności 15 mililitrów do odwirowania zwojów nerwowych, jedna sterylna probówka o pojemności 10 mililitrów do zbierania zdysocjowanych komórek.Użyj sterylizatora do suchych kulek, aby sterylizować parę cienkich kleszczy przez co najmniej jedną minutę. Wszystkie procedury przeprowadzone w badaniach na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Saint Mary's College of California. Wytyczne dotyczące pielęgnacji i użytkowania zwierząt w Saint Mary's College of California zostały opracowane w oparciu o wytyczne dostarczone przez Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych w National Institutes for Health.Usunięcie zarodków E21 od ciężarnej szczurki. Należy pamiętać, że usunięcie rogu macicy można wykonać na zewnątrz kaptura, jeśli otoczenie jest dokładnie wysterylizowane. Poddaj eutanazji ciężarną szczur za pomocą wdychania CO2.Ścinaj sierść w okolicy brzucha i przetrzyj skórę w tym obszarze 70% alkoholem, aby ją wysterylizować. Używając świeżego zestawu sterylnych nożyczek i kleszczy, przetnij skórę, a następnie mięsień, aby odsłonić rogi macicy zawierające zarodki. Usuń róg macicy wraz z zarodkami, używając nowego zestawu nożyczek i kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić przy tym jelit.Przenieś róg macicy z zarodkami na sterylną szalkę Petriego o średnicy 150 milimetrów i przenieś je do kaptura. Za pomocą nowego zestawu kleszczy i nożyczek usuń zarodki z rogu macicy i oddziel zarodki od błon owodniowych i łożyska. Aby poddać eutanazji zarodki, przetnij rdzeń kręgowy zarodków wzdłuż linii środkowej pod prawym ramieniem.Zmniejszy to krwawienie z tętnicy szyjnej podczas usuwania SCG. Przenieś te zarodki do przygotowanych 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających pożywkę do preparacji. Upewnij się, że zarodki są zanurzone w pożywce.Każda probówka może pomieścić do trzech zarodków. Izolacja górnego zwoju szyjnego od zarodka. Przenieść jedno szczenię z pożywki preparacyjnej na sterylną 150-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną do połowy stałym podłożem tak, aby jej grzbietowa powierzchnia znajdowała się na podłożu.Używając trzech sterylnych igieł o rozmiarze 23, przypnij pub do naczynia za pomocą jednej igły pod każdym ramieniem i trzeciej igły przez usta, aby ostrożnie przeprostować szyję. Przetnij skórę w okolicy szyi za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków, aby odsłonić gruczoły ślinowe pod spodem. Usuń te gruczoły za pomocą cienkich kleszczy.Zlokalizuj mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i omohyoidalne odpowiednio w pobliżu obojczyka i tchawicy. Najpierw przetnij mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe. A następnie ostrożnie przeciąć cienki mięsień omohyoidalny za pomocą cienkich kleszczy.Po usunięciu tych mięśni rozwidlenie w tętnicy szyjnej na przednim końcu będzie widoczne po obu stronach tchawicy z SCG zlokalizowanym pod tym rozwidleniem w tętnicy szyjnej. Za pomocą zamkniętych kleszczy delikatnie unieś tętnicę szyjną, aby uwidocznić SCG. Używając jednego kleszcza po obu stronach SCG, wyciągnij tętnicę szyjną i przenieś ją do przygotowanych sterylnych 35-milimetrowych szalek.Tkanka ta najprawdopodobniej będzie zawierać SCG z tętnicą szyjną, nerw błędny z zwojami bez dawki, a także inne segmenty mięśni lub tłuszczu w okolicy. Powtórz proces preparowania po drugiej stronie. Usuń SCG ze wszystkich zarodków przed kontynuowaniem pozostałych etapów sekcji.Rozmieść izolowane tkanki między dwiema z 35-milimetrowych szalek, aby ułatwić przetwarzanie próbek tkanek. Przetwarzanie końcowe SCG. Aby oddzielić SCG od wypreparowanej tkanki, najpierw użyj cienkich kleszczy, aby usunąć wszelkie obce tkanki, takie jak mięśnie lub tłuszcz, uważając, aby uniknąć obszaru w pobliżu rozwidlenia tętnicy szyjnej.Po usunięciu tych tkanek widoczne są dwa zwoje. Gangion nodose jest mniejszy i okrągły, podczas gdy SCG ma kształt migdała. Delikatnie pociągnij za nerw błędny, aby oddzielić nerw błędny i zwoje nerwowe bez dawki od tętnicy szyjnej, a następnie oddziel SCG od tętnicy szyjnej.Użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kapsułkę otaczającą SCG. Przenieś SCG do nowej 35-milimetrowej płytki hodowlanej. Powtórz ten proces ze wszystkimi wypreparowanymi próbkami tkanek.Pokryj wysterylizowaną, szklaną pipetę z bawełnianym korkiem środkiem do preparacji, aby zapobiec przywieraniu tkanki do ścianek pipety. Za pomocą pipety zastąp pożywkę separacyjną sterylnymi dwoma mililitrami kolagenazy typu II, rozprowadź typ II w HBSS bez wapnia i magnezu i inkubuj przez 50 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby pomóc rozbić tkanki. Należy pamiętać, że czas inkubacji może wymagać optymalizacji dla różnych partii kolagenazy/dypazy i zwykle wynosi od 40 minut do godziny.Po inkubacji przenieść SCG i kolagenazę/dypazę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Użyj pożywki do preparacji, aby przepłukać płytki i przenieść roztwór do probówki. Dodaj tyle pożywki do preparacji, aby doprowadzić objętość do około 10 mililitrów.Wirować przy 200 x g, 1 000 do 1 200 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia próbki. Odessać supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu. Zawiesić osad z 10 mililitrami pożywki preparyjnej, powtórzyć wirowanie i wyrzucić supernatant.Zastąp jednym do dwóch mililitrów pożywki hodowlanej. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura o wąskim otworze i wygiętej końcówce, wstępnie pokryj ją pożywką hodowlaną, mechanicznie rozdziel grudki, delikatnie rozcierając je pięć do sześciu razy. Pozwól większym grudkom osiąść na około minutę i przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do nowej 10-mililitrowej probówki.Powtórz ten proces jeszcze trzy razy ze zwiększającą się siłą rozcierania za każdym razem, aby zapewnić prawie całkowitą dysocjację SCG. Przenieś supernatant po każdej rundzie rozcierania do 10-mililitrowej probówki z supernatantem z pierwszego roztarcia. Dodaj tyle pożywki hodowlanej, aby zwiększyć objętość do ośmiu do 10 mililitrów.Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i określ ilościowo gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Rozprowadzić zawiesinę komórkową do studzienek o gęstości komórek odpowiedniej do eksperymentów. Podczas procesu powlekania należy w sposób ciągły mieszać zawiesinę komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w studzienkach.W celu analizy morfologicznej umieść komórki około 8 000 komórek na studzience na płytce 24-dołkowej. A w przypadku protokołów genomicznych i proteomicznych należy umieścić komórki na poziomie do 30 000 komórek na studzienkę. Przenieś płytki do szklanego eksykatora ze sterylną wodą na dnie, aby utworzyć nawilżoną komorę.Wstrzyknąć wystarczającą ilość CO2, około 120 mililitrów, aby uzyskać środowisko 5% CO2 w eksykatorze, przed uszczelnieniem. Utrzymuj płytki w temperaturze 35,5 stopni Celsjusza. W protokole jest to określane jako dzień zerowy.Płytki te mogą być również przechowywane w zwykłym inkubatorze o stężeniu 5% CO2. Opisana powyżej metoda minimalizuje zmiany temperatury i pH, a także pomaga zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu. Utrzymanie hodowanych neuronów SCG i leczenie.Te zdjęcia pokazują zdysocjowane górne komórki zwojów szyjki macicy w dniu zero, pierwszym i piątym. Obraz dnia zerowego przedstawia komórki po posianiu. Komórki posiane w dniu zero zawierają mieszaninę komórek zarówno neuronalnych, jak i nieneuronalnych.Pierwszego dnia, 24 godziny po posiewie, ostrożnie usuń połowę pożywki hodowlanej i zastąp ją dwoma mikromolowymi Ara-C, cytozyną D-arabinofuranozydem, środkiem antymitotycznym. Pozostaw zabieg na komórkach na 48 godzin. Zwykle taka długość leczenia jest wystarczająca do wyeliminowania komórek nieneuronalnych w hodowli.Trzeciego dnia delikatnie odessać połowę pożywki i zastąpić ją pożywką kontrolną. Czwartego dnia komórki są gotowe do eksperymentalnego leczenia. Karm kultury co drugi dzień odpowiednią pożywką.Delikatnie zastępując połowę pożywki w studzience świeżym podłożem. Zdjęcie z piątego dnia pokazuje rozległy wzrost aksonów bez zaobserwowanego wzrostu dendrytycznego. Aby wywołać wzrost dendrytyczny, neurony można hodować na Matrigel lub traktować 10% surowicą lub 50 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości-7.Rycina druga przedstawia zmiany w morfologii neuronów SCG szczura E21 po leczeniu BMP-7. Reprezentatywne mikrofotografie z kontrastem fazowym w powiększeniu 10-krotnym pokazują koliste ciało komórki neuronalnej z aksonami w neuronach kontrolnych w panelu A oraz neurony z wieloma krótkimi wyrostkami dendrytowymi po potraktowaniu BMP-7, pokazane strzałkami w panelu B. Hodowane neurony SCG po odpowiednim leczeniu mogą być wykorzystane do analizy morfologicznej przy użyciu barwienia immunocytochemicznego do analizy genomowej i do badań biochemicznych, na przykład do analiz proteomicznych. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami barwienia immunologicznego i przygotowania próbek do analizy proteomicznej.Rycina trzecia przedstawia barwienie immunologiczne białkiem MAP-2 w hodowanych neuronach współczulnych szczurów embrionalnych. Panele od A do D pokazują hodowane neurony SCG traktowane pożywką kontrolną, a panele od E do H pokazują neurony traktowane BMP-7 w dawce 50 nanogramów na mililitr przez pięć dni. Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające immunocytochemiczne barwienie neuronów białkiem związanym z mikrotubulami-2 w C i G, barwienie jądrowe w D i H z mikrografiami kontrastu fazowego w B i F oraz wyłanianie się trzech kanałów w A i D. Barwienie immunocytochemiczne z białka związanego z mikrotubulami-2 jest obecne w ciele komórki i proksymalnych aksonach neuronów kontrolnych w panelu C. I barwienie białkiem MAP-2 w ciele komórki, i dendryty w neuronach traktowanych BMP-7 znajdują się w panelu G. Oto próbka górnych zwojów szyjnych potraktowanych pożywką kontrolną, która wykryła 1 100 białek.Ontologia genów z wykorzystaniem bazy danych Panther wykazała, że większość białek była cytoplazmatyczna. Jednak w próbce znajdowały się białka związane z błoną i białka na połączeniach komórkowych. Analiza ta ujawniła również, że w próbce wykryto białka, które są zaangażowane w szeroki wachlarz neuronalnych szlaków sygnałowych.Podsumowując, po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować i wyhodować embrionalne neurony zwoju szyjnego szczura w celu analizy morfologicznej i proteomicznej. Praca ta została sfinansowana przez fundusz rozwoju wydziału i letni program badawczy w Saint Mary's College of California.

culturing-rat-sympathetic-neurons-from-embryonic-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) nowo narodzonych szczurów.

Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Opisujemy protokół wykorzystania białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) lub Matrigelu do selektywnego indukowania wzrostu dendrytów w pierwotnych neuronach współczulnych rozdzielonych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczurów perinatalnych.

Indukowanie wzrostu dendrytów w hodowlanych neuronach współczulnych

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z kręgosłupa szczura. DRG wycięte z kręgosłupa są traktowane enzymami i mechanicznie dysocjowane w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki są hodowane w pożywce zawierającej inhibitory i czynniki wzrostu, które odpowiednio ograniczają proliferację komórek glejowych i promują wzrost neuronów.

Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Główne zwoje miednicy zawierają neurony przywspółczulne i współczulne, które unerwiają narządy miednicy. Tutaj opisujemy metodę preparacji i podajemy schematy identyfikacji tych zwojów i związanych z nimi nerwów. Metody te można zastosować do eksperymentalnej manipulacji tymi zwojami in vivo lub usunięcia pośmiertnego w celu dalszych badań.

Rozwarstwienie autonomicznych zwojów miednicy i związanych z nimi nerwów u samców i samic szczurów

Patofizjologiczne zmiany w autonomicznym układzie nerwowym serca, zwłaszcza w jego oddziale współczulnym, przyczyniają się do wystąpienia i utrzymywania się komorowych zaburzeń rytmu serca. W niniejszym protokole pokazujemy, jak scharakteryzować mysie zwoje gwiaździste, aby lepiej zrozumieć leżące u ich podstaw procesy molekularne i komórkowe.

Lokalizacja, rozwarstwienie i analiza mysiego ganglionu gwiaździstego

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Obecny protokół opisuje mysi model ablacji unerwienia adrenergicznego poprzez identyfikację i resekcję górnego zwoju szyjnego.

Technika chirurgiczna dla górnej ganglionektomii szyjki macicy w modelu mysim

Poznaj metodę hodowli neuronów współczulnych z górnych zwojów szyjnych szczura do analizy morfologicznej i proteomicznej. Protokół obejmuje izolację komórek, barwienie immunocytochemiczne oraz przygotowanie próbek do spektrometrii mas.

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Przeglądaj więcej filmów