Name: Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metody walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej (HAT) w badaniach nad epigenetyką i nowotworami. Protokoły obejmują testy HAT, immunoblotting oraz ChIP-qPCR dla dokładnej analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z James and Esther King Biomedical Research Program (6JK03 i 20K07) oraz Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 i 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation i UF Health Cancer Center. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować dr Zachary'emu Oskingowi i dr Andrei Lin za ich wsparcie podczas procesu publikacji.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.

Acetylotransferazy lizyny (KAT) acetylują kilka reszt lizyny na ogonach histonów i czynnikach transkrypcyjnych w celu regulacji transkrypcji genów 2,3. Prace przeprowadzone w ciągu ostatnich dwóch dekad wykazały, że KAT, takie jak CBP/p300, PCAF i GCN5, oddziałują z onkogennymi czynnikami transkrypcyjnymi i pomagają napędzać wzrost guza w kilku typach guzów litych 4,5,9,15,16,17,18.<sup class="...

Acetylotransferazy lizyny (KATs) katalizują acetylację reszt lizyny zarówno na białkach histonowych, jak i niehistonowych1,2,3,4. Ostatnie badania pokazują, że KAT i ich funkcja acetylotransferazy mogą sprzyjać wzrostowi guzów litych4,5,6,7,8,9. Na przykład białko wiążące CREB (CBP)/p300 to dwa paralogiczne KAT, które regulują liczne szlaki sygnałowe w raku2,3. CBP/p300 mają dobrze scharakteryzowaną funkcję acetylotransferazy histonowej (HAT) i katalizują acetylację histonu 3 lizyny 27 (H3K27ac)2,4,5,10,11, ważny marker dla aktywnych wzmacniaczy, regionów promotora i aktywnej transkrypcji genów12,13,14. CBP/p300 służą jako krytyczne koaktywatory dla pro-wzrostowych szlaków sygnałowych w guzach litych poprzez aktywację transkrypcji onkogenów poprzez acetylację histonów i innych czynników transkrypcyjnych4,9,15,16,17,18. Ze względu na ich rolę w progresji nowotworu, CBP/p300 i inne KAT są badane pod kątem opracowania nowych inhibitorów, które blokują ich funkcję onkogenną4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 i GNE-049 reprezentują dwie udane próby opracowania silnych i specyficznych inhibitorów dla CBP/p3004,9. Dodatkowe inhibitory są obecnie badane dla CBP/p300 i innych KAT.
Jakość wcześniej opisanych inhibitorów KAT (KATi) jest kwestionowana, a wiele inhibitorów wykazuje docelowe efekty i słabą charakterystykę21. W związku z tym rygorystyczna charakterystyka i walidacja nowych kandydatów na leki ma zasadnicze znaczenie dla opracowania wysokiej jakości sond chemicznych. Przedstawiono tutaj trzy protokoły, które tworzą linię do badań przesiewowych i rygorystycznej walidacji siły i swoistości nowego KATi, ze szczególnym naciskiem na hamowanie funkcji HAT (HATi) KAT. CBP/p300 i ich inhibitory są używane jako przykłady, ale te protokoły można dostosować do innych KAT, które mają funkcję HAT7.
Pierwszy protokół to test in vitro na acetylotransferazę histonów (HAT), który wykorzystuje oczyszczony rekombinowany p300 i histony w kontrolowanej reakcji w probówce. Test ten jest prosty do wykonania, opłacalny, może być stosowany do badań przesiewowych związków w warunkach niskiej przepustowości i nie wymaga materiałów radioaktywnych. W tym protokole rekombinowany p300 katalizuje acetylację lizyny na ogonach histonów podczas krótkiego okresu inkubacji, a poziomy acetylacji histonów są mierzone przy użyciu standardowych procedur immunoblottingu. Reakcja enzymatyczna może być przeprowadzana w obecności lub bez inhibitorów CBP/p300 w celu wykrycia związków zmniejszających acetylację histonów. Ponadto test HAT można wykorzystać do sprawdzenia, czy nowe związki są selektywne dla CBP/p300, oceniając ich aktywność w stosunku do innych oczyszczonych KAT, takich jak PCAF. Test HAT jest doskonałym punktem wyjścia do badania nowych inhibitorów ze względu na swoją prostotę, niski koszt i możliwość określenia siły/selektywności inhibitora. Rzeczywiście, protokół ten jest często używany w literaturze jako badanie przesiewowe in vitro5,10. Jednak inhibitory zidentyfikowane w teście HAT nie zawsze są skuteczne w hodowli komórkowej, ponieważ reakcja w probówce jest znacznie prostsza niż w przypadku żywego systemu komórkowego. Dlatego tak ważne jest dalsze scharakteryzowanie inhibitorów w eksperymentach z hodowlami komórkowymi22,23.
Drugim protokołem w przygotowaniu jest test hamowania hiperacetylacji chromatyny (ChHAI). Ten test oparty na komórkach wykorzystuje inhibitory deacetylazy histonowej (HDACi) jako narzędzie do hiperacetylacji histonów w chromatynie przed jednoczesną inkubacją z klasą HATi24. Podstawowa acetylacja histonów może być niska w hodowli komórkowej, co utrudnia sondowanie za pomocą immunoblottingu bez dodatku HDACi w celu zwiększenia acetylacji. Celem testu ChHAI jest zidentyfikowanie nowego HATi, który może osłabić wzrost acetylacji histonów spowodowany hamowaniem HDAC. Zalety tego testu obejmują jego niski koszt, względną łatwość wykonania oraz wykorzystanie komórek w hodowli, co zapewnia większe znaczenie fizjologiczne niż test HAT w probówce. Podobnie jak w przypadku testu HAT, protokół ten wykorzystuje standardowe immunoblotting do zbierania danych.
Testy HAT i ChHAI dostarczają danych na temat siły nowych związków hamujących globalną acetylację histonów, ale nie dostarczają wglądu w to, jak te związki wpływają na modyfikacje w określonych regionach genomu. Dlatego końcowy protokół, Chromatyna immunoprecypitacyjna-ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (ChIP-qPCR), jest eksperymentem z hodowlą komórkową, który bada interakcje DNA-białko w określonych regionach genomu. W protokole ChIP chromatyna jest usieciowana w celu zachowania interakcji DNA-białko. Chromatyna jest następnie ekstrahowana z komórek, a kompleks DNA-białko jest poddawany selektywnej immunoprecypitacji dla białka będącego przedmiotem zainteresowania (np. przy użyciu przeciwciała specyficznego dla H3K27ac). DNA jest następnie oczyszczane i analizowane za pomocą qPCR. Na przykład ChIP-qPCR można wykorzystać do określenia, czy nowy HATi obniża acetylację histonów w poszczególnych onkogenach, takich jak Cyclin D125. Chociaż ChIP-qPCR jest powszechną techniką stosowaną w terenie, jej optymalizacja może być trudna4,10,26. Protokół ten zawiera wskazówki dotyczące unikania potencjalnych pułapek, które mogą wystąpić podczas wykonywania procedury ChIP-qPCR, i obejmuje kontrole jakości, które należy przeprowadzić na danych.
Używane razem, te trzy protokoły pozwalają na rygorystyczną charakterystykę i walidację nowego HATi. Ponadto metody te mają wiele zalet, ponieważ są łatwe do wykonania, stosunkowo tanie i dostarczają danych na temat globalnej, jak i regionalnej acetylacji histonów.

<table><tbody><tr><td>Tubka 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Do wszystkich metod</td></tr><tr><td>Naczynie 10 cm</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>83.3902</td><td>Do hodowli komórkowej komórek MCF-7</td></tr><tr><td>10 końcówek ul</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>Dla wszystkich metod</td></tr><tr><td>1000 końcówek ul</td><td>Corning</td><td>4846</td><td>Dla wszystkich metod</td></tr><tr><td>10X Bufor</td><td></td><td></td> glicynowy <td>dla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>10X uruchomiony</td><td></td><td></td> bufor <td>dla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>10X TBST</td><td></td><td></td><td>dla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>do metody 2</td></tr><tr><td>15 cm naczynie</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>83.3903</td><td>Dla metody 3</td></tr><tr><td>15 ml probówka stożkowa</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200249</td><td>Dla metod 2 i 3</td></tr><tr><td>1X TBST z 5% mlekiem i 0,02% azydkiem</td><td></td><td></td> sodu <td>Dla metod 1 i 2. Może być stosowany do rozcieńczania przeciwciał pierwotnych, które będą używane więcej niż raz. Pozwala na krótkotrwałe przechowywanie rozcieńczeń przeciwciał pierwotnych. Nie stosować do rozcieńczania przeciwciał wtórnych. UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny.</td></tr><tr><td>1X TBST z 5% mlekiem</td><td></td><td></td><td>Do metod 1 i 2. Służy do blokowania błony PVDF i do dylatacji przeciwciał. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>200 ul końcówki</td><td>Corning</td><td>4844</td><td>Dla wszystkich metod</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>do przygotowania buforu próbki SDS</td></tr><tr><td>4-20% żel poliakryloamidowy</td><td>Thermo Fisher: Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td>Dla metod 1 i 2</td></tr><tr><td>5X Bufor testowy</td><td></td><td></td><td>dla metody 1. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>5X Pasywny bufor do lizy</td><td></td><td></td><td>dla metody 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>6X Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td></td><td></td> <td>Dla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>A-485</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-107455</td><td>CBP/p300 Inhbitor do stosowania w metodach 2 i 3. Rozpuszczony w DMSO.</td></tr><tr><td>Przeciwciało acetylo-CBP (K1535) / p300 (K1499)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4771</td><td>Do metody 1</td></tr><tr><td>Acetylo-CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td>do stosowania w metodzie 1</td></tr><tr><td>Przeciwciało acetylo-histonowe H3 (Lys 27) (H3K27ac)</td> <td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>CST 8173</td><td>antoibodies dla H3K27ac dla immunoblotów i ChIP</td></tr><tr><td>Przeciwciało acetylo-histonowe H3 (Lys18) (H3K18ac)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>Przeciwciała CST 9675</td><td>dla H3K18ac dla immunoblotów i</td></tr><tr><td>przeciwciała alfa-tubuliny</td><td>ChIP Millipore Sigma</td><td>T5168</td><td>dla metody 2. Rozcieńczyć 1:20 000</td></tr><tr><td>Kwas anakardowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>13144</td><td>Dla metody 1</td></tr><tr><td>anty-mysi IgG HRP sprzężonej z wtórnym przeciwciałem</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>7076</td><td>Dla metod 1 i 2. Rozcieńczyć 1:10 000</td></tr><tr><td>przeciwciała drugorzędowe anty-królicze IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td>dla metod 1 i 2. Rozcieńczyć 1:10 000 do 1:20 000</td></tr><tr><td>Film autoradiograficzny</td><td>MIDSCI</td><td>BX810</td><td>Dla metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Tancerka brzucha Platforma obrotowa</td><td>Stovall Life Science Incorporated</td><td>niedostępna</td><td>Dla metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Surowica cielęca bydlęca (BCS)</td><td>HyClone</td><td>SH30072.03</td><td>pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>do przygotowania buforu próbki SDS</td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Spectrum Chemical</td><td>125572-95-4</td><td>Do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>skrobak do komórek</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3010</td><td>Do metody 3</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do rozcieńczania ChIP <td>Do metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>elucyjny ChIP</td><td>dla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Kompletny DMEM dla komórek</td><td></td><td></td> MCF-7 <td>dla metod 2 i 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Covaris 130 & mikro; l microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Probówka sonicyjna do stosowania z Covaris S220 w metodzie 3</td></tr><tr><td>Covaris S220 Focused ultrasonic</td><td>Covaris</td><td>S220</td><td>Sonikator DNA do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>do rozcieńczania leków i leczenia kontrolnego nośnika</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td>do buforu próbki SDS przygotowanie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Przykładowy zbiornik transferowy i aparatura transferowa</td><td>Bio-rad</td><td>1704070</td><td>Dla metod 1 i 2</td></tr><tr><td>EZ-Magna ChIP A/G Zestaw do immunoprecypitacji chromatyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>17-10086</td><td>Do metody 3</td></tr><tr><td>FK228 ( Romidepsin)</td><td>Cayman Chemical</td><td>128517-07-7</td><td>Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>do wiązania komórek</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td>Do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>do przygotowania</td></tr><tr><td>buforu HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td>dla przygotowanie buforu</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>o wysokiej zawartości soli</td><td>do metody 3</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Immobilon Chemiluminescencyjny substrat HRP</td><td>Millipore Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td>do metod 1 i 2</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td>Do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do płukania LiCl <td>Do metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do płukania o niskiej zawartości soli</td><td>dla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Separator magnetyczny</td><td>Promega</td><td>Z5341</td><td>Do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>Do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Mini zbiornik żelowy</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td>Do metod 1 i 2</td></tr><tr><td>MS-275 (Entinostat)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>209783-80-2</td><td>Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2. Rozpuszczony w DMSO.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>do przygotowania buforu w metodach 1 i 2</td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>P120-101</td><td>Kontrolne przeciwciało królicze do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> pęczniejący jąder <td>do metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100X</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Do metod 2 i 3</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80635</td><td>do przygotowania</td></tr><tr><td>buforu mleko w proszku</td><td>Goździk</td><td></td><td>Nestle Dla Metody 1 i 2</td></tr><tr><td>Power Pac 200 do przenoszenia western blot</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Do metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Power Pac 3000 do żelu SDS z</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Do metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>26616</td><td>Do metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PI8340</td><td>do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>Białko A Magentic Beads</td><td>New England BioLabs</td><td>S1425S</td><td>Do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>New England BioLabs</td><td>P8107S</td><td>Do stosowania w metodzie 3</td></tr><tr><td>PTC-100 Programowalny regulator termiczny</td><td>MJ Research Inc.</td><td>PTC-100</td><td>Do metody 1</td></tr><tr><td>Membrana transferowa PVDF</td><td>Millipore Sigma IEVH00005</td><td></td><td>Do metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Rekombinowany H3.1</td><td>New England BioLabs</td><td>M2503S</td><td>do stosowania w metodzie 1</td></tr><tr><td>Rekombinowany p300</td><td>ENZO Life Sciences</td><td>BML-SE451-0100</td><td>do stosowania w metodzie 1</td></tr><tr><td>SAHA (Vorinostat)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do lizy SDS</td><td>dla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>26628-22-8</td><td>Dla metod 1 i 2. UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Zobacz kartę charakterystyki, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej obsługi.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725</td><td>do przygotowania buforu próbki SDS</td></tr><tr><td>Standardowy blok grzewczy</td><td>VWR Scientific Products</td><td>MPN: 949030</td><td>Dla metod 1 i 2</td></tr><tr><td>Blat stołu wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Dla wszystkich metod</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> TE <td>Dla metody 3. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Bufor transferu</td><td></td><td></td><td>dla metod 1 i 2. Zobacz tabelę 1, aby zapoznać się z przepisem.</td></tr><tr><td>Trichostatyna A</td><td>Cayman Chemical</td><td>58880-19-6</td><td>Inhibitor HDAC do stosowania w metodzie 2</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>do przygotowania buforu w metodach 1 i 2</td></tr><tr><td>Procesor</td> <td>filmów rentgenowskichKonica Minolta Medical & Grafika, Inc.</td><td>SRX-101A</td><td>dla metod 1 i 2</td></tr></tbody></table>

testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Acetylotransferazy lizyny (KAT) katalizują acetylację reszt lizyny na histonach i innych białkach, regulując dynamikę chromatyny i ekspresję genów. KAT, takie jak CBP/p300, są intensywnie badane jako cele terapeutyczne ze względu na ich kluczową rolę w nowotworzeniu różnych nowotworów. Opracowanie nowych małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na funkcję acetylotransferazy histonowej (HAT) w KAT jest wyzwaniem i wymaga solidnych testów, które mogą potwierdzić swoistość i siłę działania potencjalnych inhibitorów.
Ten artykuł przedstawia linię trzech metod, które zapewniają rygorystyczną walidację in vitro dla nowych inhibitorów HAT (HATi). Metody te obejmują test HAT w probówce, test hamowania hiperacetylacji chromatyny (ChHAI) i ilościowy PCR immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-qPCR). W teście HAT rekombinowane HAT są inkubowane z histonami w reakcji probówkowej, co pozwala na acetylację określonych reszt lizyny na ogonach histonów. Reakcja ta może być zablokowana przez HATi, a względne poziomy acetylacji histonów specyficznej dla miejsca można zmierzyć za pomocą immunoblottingu. Inhibitory zidentyfikowane w teście HAT muszą zostać potwierdzone w środowisku komórkowym.
Test ChHAI wykorzystuje immunoblotting do badania przesiewowego w poszukiwaniu nowego HATi, który tłumi silną hiperacetylację histonów indukowaną przez inhibitor deacetylazy histonowej (HDACi). Dodanie HDACi jest pomocne, ponieważ podstawowe poziomy acetylacji histonów mogą być trudne do wykrycia za pomocą immunoblottingu.
Testy HAT i ChHAI mierzą globalne zmiany w acetylacji histonów, ale nie dostarczają informacji na temat acetylacji w określonych regionach genomu. Dlatego ChIP-qPCR stosuje się do badania wpływu HATi na poziomy acetylacji histonów w elementach regulatorowych genów. Osiąga się to poprzez selektywną immunoprecypitację kompleksów histon-DNA i analizę oczyszczonego DNA za pomocą qPCR. Łącznie te trzy testy pozwalają na staranną walidację specyficzności, siły działania i mechanizmu działania nowego HATi.

Test in vitro aktywności acetylotransferazy histonowej (HAT) może być wykorzystany do poszukiwania związków hamujących aktywność HAT białka p30 wobec substratu histonowego. Rycina 1A przedstawia schemat doświadczalny testu HAT. W analizie tej zastosowano kwas anakardowy, znany inhibitor HATi3,38, w zakresie stężeń od 12,5-10 µM. Przy stężeniu 10 µM kwas anakardowy obniża katalizowaną przez p300 acetylację histonów w obrębie lizyn 9 i...

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Protokoły te są istotne, ponieważ zapewniają szczegółowe kroki walidacji siły działania i selektywności nowych inhibitorów HAT, które są ważnymi narzędziami badawczymi i potencjalnymi terapiami. Techniki przedstawione w tym filmie są łatwe do wykonania i dostarczają informacji o wpływie inhibitorów HAT na globalną i regionalną acetylację histonów. Pozwalają one zrozumieć epigenetyczną regulację ekspresji genów.Dbałość o szczegóły ma kluczowe znaczenie. Ważne jest, aby postępować zgodnie z protokołami krok po kroku. Rozpocznij od przygotowania reakcji enzymatycznej w objętości 10 mikrolitrów w 0,2 mililitrowej probówce do PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Następnie inkubować kompletną mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez godzinę w termocyklerze PCR. W międzyczasie dodaj dwa merkaptoetanole w stosunku od 1 do 10 do buforu próbki 6X SDS. Usunąć próbki z termocyklera PCR i dodać dwa mikrolitry przygotowanego buforu próbki SDS do każdej mieszaniny reakcyjnej.Podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut na bloku grzewczym, a następnie schłodzić je na lodzie. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza lub przep

assays-for-validating-histone-acetyltransferase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Ten protokół opisuje wymagane kroki do przeprowadzenia testów deacetylacji in vitro i in vivo w celu ustalenia roli białek jako specyficznych substratów deacetylacji dla sirtuin i dalszego badania roli odwracalnej acetylacji lizyny jako modyfikacji potranslacyjnej.

Testy deacetylacji w celu rozwikłania wzajemnych zależności między sirtuinami (SIRT2) a specyficznymi substratami białkowymi

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

Deacetylazy histonowe klasy 1 (HDAC), takie jak RpdA, zyskały na znaczeniu jako potencjalne cele w leczeniu infekcji grzybiczych. W tym miejscu przedstawiamy protokół specyficznego wzbogacania RpdA znakowanego TAP w połączeniu z testem aktywności HDAC, który umożliwia badanie skuteczności in vitro inhibitorów deacetylazy histonowej.

Jednoetapowe wzbogacanie deacetylazy histonowej znakowanej TAP grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans do oznaczania aktywności enzymatycznej

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Tutaj prezentujemy przedkliniczne badania przesiewowe przeciwnowotworowych kumaryn z wykorzystaniem hodowli 3D i danio pręgowanego.

Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Poznaj metody walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej (HAT) w badaniach nad epigenetyką i nowotworami. Protokoły obejmują testy HAT, immunoblotting oraz ChIP-qPCR dla dokładnej analizy.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Przeglądaj więcej filmów