Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Protokoły te są istotne, ponieważ zapewniają szczegółowe kroki walidacji siły działania i selektywności nowych inhibitorów HAT, które są ważnymi narzędziami badawczymi i potencjalnymi terapiami. Techniki przedstawione w tym filmie są łatwe do wykonania i dostarczają informacji o wpływie inhibitorów HAT na globalną i regionalną acetylację histonów. Pozwalają one zrozumieć epigenetyczną regulację ekspresji genów.

Dbałość o szczegóły ma kluczowe znaczenie. Ważne jest, aby postępować zgodnie z protokołami krok po kroku. Rozpocznij od przygotowania reakcji enzymatycznej w objętości 10 mikrolitrów w 0,2 mililitrowej probówce do PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Następnie inkubować kompletną mieszaninę reakcyjną w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez godzinę w termocyklerze PCR. W międzyczasie dodaj dwa merkaptoetanole w stosunku od 1 do 10 do buforu próbki 6X SDS. Usunąć próbki z termocyklera PCR i dodać dwa mikrolitry przygotowanego buforu próbki SDS do każdej mieszaniny reakcyjnej.

Podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut na bloku grzewczym, a następnie schłodzić je na lodzie. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza lub przeprowadzić elektroforezę żelową i immunoblotting. Umieść 100 000 komórek MCF-7 w jednym mililitrze pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki 12-dołkowej płytki i pozwól komórkom rosnąć do 80 do 90% zgrywki.

Gdy komórki osiągną pożądane zbieganie, odessać pożywkę do hodowli komórkowej z dołków cztery, piątego i szóstego i odpipetować jeden mililitr trzech mikromolowych MS275 w pożywce do każdej studzienki. Następnie odessać pożywkę do hodowli komórkowej z dołków pierwszej, drugiej i trzeciej i odpipetować jeden mililitr rozcieńczonego DMSO do każdej studzienki. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na cztery godziny, aby umożliwić akumulację acetylowanych histonów w komórkach wystawionych na działanie MS275.

Podczas inkubacji komórek przygotuj rozcieńczenia A-485 w DMSO zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Po zakończeniu inkubacji odessać pożywkę ze studzienek i dodać rozcieńczenia. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i hoduj je przez 20 godzin, a następnie odessaj pożywkę do hodowli komórkowych z dołków i umyj komórki jednym mililitrem PBS.

Odessać PBS i dodać 100 mikrolitrów pasywnego buforu do lizy. Przechowuj płytkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Odpipetować 100 mikrolitrów sonikowanej chromatyny z komórek potraktowanych DMSO do dwóch probówek o pojemności 1,5 mililitra, a następnie odpipetować 400 mikrolitrów buforu rozcieńczającego ChIP do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 500 mikrolitrów.

Usuń pięć mikrolitrów roztworu z jednej z probówek i przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza jako wejście DMSO. Przygotować dwie probówki z sonikowaną chromatyną z komórek potraktowanych A-485 w ten sam sposób. Za pomocą pipety dodać przeciwciała acetylowe IgG i H3K27 do próbek DMSO i A-485.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych białka A do każdej probówki, upewniając się, że kulki są dobrze zawieszone. Obracaj próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Granulki magnetyczne białka A należy otoczkować za pomocą separatora magnetycznego i usunąć supernatant bez naruszania kulek.

Umyj kulki 500 mikrolitrami na jeden mililitr buforu do płukania o niskiej zawartości soli i obracaj je przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wykonaj szybkie odwirowanie, opłucz kulki separatorem magnetycznym i usuń supernatant. Powtórz procedurę mycia z buforem do płukania o wysokiej zawartości soli, buforem do płukania chlorku litu i buforem TE.

Po umyciu buforem TE wyjmij próbki wejściowe z zamrażarki i umieść je na lodzie. Rozmrozić podwielokrotność proteinazy K, a następnie granulować kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć bufor TE z kulek. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego ChIP i jeden mikrolitr proteinazy K do każdej próbki, w tym próbek wejściowych, i inkubować je z wytrząsaniem w temperaturze 62 stopni Celsjusza przez dwie godziny za pomocą termocyklera.

Po inkubacji podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie schładzaj je do temperatury pokojowej. Skumuluj kulki magnetyczne za pomocą separatora magnetycznego i przenieś supernatant zawierający DNA do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Oczyść DNA za pomocą standardowego zestawu do czyszczenia PCR i uruchom qPCR.

Test acetylotransferazy histonowej in vitro zastosowano w celu zbadania wpływu kwasu anakardowego na aktywność p300 HAT w stosunku do substratu histonowego. Zbadano zakres stężeń i nie dodano acetylo-CoA do reakcji kontroli ujemnej. Wyniki immunoblot określono ilościowo za pomocą ImageJ, wykazując wyraźne zmniejszenie acetylu H3K18 i acetylu H3K9 przy 100 mikromolowym kwasie anakardowym w porównaniu z kontrolą DMSO.

W teście hamowania hiperacetylacji chromatyny traktowanie komórek MCF-7 HDACi MS275 silnie regulowało acetylację histonu 3 na kilku resztach lizyny. Podstawowe poziomy acetylu H3K18 i acetylu H3K27 były niskie, co wskazuje na korzyści płynące z dodania HDACi w teście ChHAI. Dodanie A-485 w komórkach wstępnie potraktowanych MS275 osłabia zwiększoną acetylację histonów w H3K18 i H3K27, ale nie H3K9.

Wyniki immunoblot zostały również określone ilościowo za pomocą ImageJ. ChIP qPCR wykorzystano do zbadania wpływu inhibitorów HAT na elementy regulatorowe genów, które kontrolują ekspresję onkogenów. W próbce DMSO DNA wytrącone przez przeciwciało kontrolne IgG wytworzyło wyższą wartość Ct niż przeciwciało acetylowe H3K27 w reakcji qPCR dla promotora cykliny D1, co wskazuje, że niespecyficzna kontrola IgG wytrąciła mniej kompleksów histonów DNA niż przeciwciało specyficzne dla acetylu H3K27 w promotorze.

W porównaniu z kontrolą DMSO, A-485 zmniejszył wzbogacenie acetylu H3K27 w promotorze cykliny D1. Co ważne, wiadomo, że A-485 znacznie zmniejsza acetyl H3K27 w hodowli komórkowej. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że etapy wstępnej inkubacji testów HAT i ChHAI in vitro są niezbędne i nie należy o nich zapominać.

Ważne jest również, aby pamiętać o zapisywaniu próbek wejściowych i unikaniu utraty kulek podczas ChIP. Po wykonaniu tych procedur, ChIP-seq jest dodatkową metodą, którą można wykonać w celu uzyskania globalnych informacji na temat acetylacji histonów w elementach regulatorowych dla całego genomu. Protokoły te są pomocne dla naukowców w starannej walidacji nowych inhibitorów HAT i unikaniu publikowania niskiej jakości sond chemicznych w literaturze.

Zwalidowane inhibitory HAT mogą być dalej rozwijane jako potencjalne środki terapeutyczne.