Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej
27 kwietnia 2021
Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.
Ten protokół w ziołolecznictwie ciągły pomiar obwodów genetycznych u E. coli oraz obliczanie zmienności sygnału i stosunku sygnału do szumu w poszczególnych komórkach bakteryjnych w celu oceny wydajności obwodu. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją łatwo dostosować do różnych szczepów i laboratoriów, wymaga minimalnego szkolenia i nie wymaga specjalnego sprzętu oraz jest stosunkowo niedroga. Hałas odgrywa istotną rolę w określaniu funkcjonalności systemów biologicznych.
Obecnie istnieje zainteresowanie budowaniem obwodów genowych na dużą skalę. Systemy te mogą być hamowane przez hałas Pamiętaj, aby dobrze wysuszyć próbki, aby utrzymać poduszki chłodzące w temperaturze czterech stopni Celsjusza tak długo, jak to możliwe, oraz aby cierpliwie i delikatnie ciąć i dzielić części. Aby przygotować bakterie do analizy, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z transfekowanej kultury E. coli.
Na przykład obwód z raportem GFP. W szklanej probówce zawierającej pięć mililitrów bulionu LB uzupełnij go odpowiednimi antybiotykami. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obrotów na minutę w inkubatorze z wytrząsaniem przez dwie godziny, aż bulion stanie się mętny.
Pod koniec inkubacji odwirować jeden mililitr roztworu rozcieńczającego w dwumililitrowej mini wirówce i przenieść 30 mikrolitrów bakterii i całą objętość roztworu rozcieńczającego do nowej dwumililitrowej probówki. Następnie inkubować kulturę przez godzinę z wytrząsaniem przed wysiewem od 40 do 60 mikrolitrów tej zawiesiny na płytki hodowlane M9. Aby przygotować bakterie do analizy, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z transfekowanej kultury E. Coli.
Na przykład obwód z reporterem GFP w szklanej probówce zawierającej pięć mililitrów bulionu LB uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obrotów na minutę w inkubatorze z wytrząsaniem przez dwie godziny, aż bulion stanie się mętny. Pod koniec inkubacji odwirować jeden mililitr roztworu rozcieńczającego w dwumililitrowej mini mikroprobówce wirówkowej i przenieść 30 mikrolitrów bakterii i całą objętość roztworu rozcieńczającego do nowej dwumililitrowej probówki.
Następnie inkubuj kulturę przez godzinę z potrząsaniem. Aby przygotować płytki mikroskopowe, wymieszaj 112,5 miligrama niskotopliwego agaru z 40 miligramami agaru i jednym mililitrem 2% kasaminokwasu w 25-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Następnie dodaj 8,92 mililitra minimalnej pożywki na wewnętrzne wargi 25-mililitrowej kolby Erlenmeyera i podgrzej otrzymany roztwór w kuchence mikrofalowej w krótkich, dwu- lub trzysekundowych seriach.
Następnie ustaw łaźnię wodną na 55 stopni Celsjusza. Gdy roztwór jest klarowny, umieść 25-mililitrową kolbę Erlenmeyera w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza i pozwól roztworowi agaru ostygnąć, aż jego temperatura spadnie do około 45 do 50 stopni Celsjusza. Podczas schładzania agaru wyczyść stół laboratoryjny 70% etanolem i wygładź kawałek taśmy laboratoryjnej na czyszczonym stole.
Umieść jedną szklaną szkiełko nakrywkowe na taśmie i umieść drugie szkiełko nakrywkowe w pobliżu. Dodaj schłodzony roztwór agaru do odpowiednich antybiotyków i roztworu. Wlej 1,5 mililitra świeżo przygotowanego roztworu do żelu na szkiełko nakrywkowe umieszczone na taśmie i umieść drugie szkiełko nakrywkowe na żelu, uważając, aby nie powstały bąbelki.
Włóż Erlenmeyera z powrotem do gorącej łaźni wodnej i przykryj szkiełka nakrywkowe na 20 minut. Odwróć szkiełka nakrywkowe na godzinę inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji usuń szkiełka okrywkowe z suchego żelu i odetnij małą podkładkę z agarozy.
Podczas inkubacji dodać sześć mikrolitrowych kropelek przygotowanej zawiesiny bakteryjnej do 35-milimetrowego naczynia i pozostawić krople do wyschnięcia na co najmniej 15 do 30 minut. Następnie ostrożnie umieszczaj podkładkę na jednej kropli bakterii i pozwól próbkom zastygnąć przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby umieścić łoże agarowe bez rozmazywania próbki, ostrożnie umieść chłodną podkładkę na kropli, delikatnie stukając.
Aby zobrazować próbki, należy wyjąć kolbę z wody i pozostawić roztwór żelu do ostygnięcia do temperatury ciała. Wlej trzy milimetry żelu na obwód płytki próbki. Gdy agaroza stwardnieje, uszczelnij płytkę taśmą i użyj igły o rozmiarze 25, aby wykonać kilka otworów w taśmie.
Następnie umieść płytkę do góry nogami w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby agaroza w pełni zastygła, zapobiegając jednocześnie mitozie komórek. W ciągu 24 godzin użyj fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego, aby zlokalizować próbkę przy najmniejszym powiększeniu i włączyć system automatycznego ustawiania ostrości mikroskopu. Nalej olej na odpowiedni cel i użyj kontrolera platformy, aby przesunąć płytę, aby ostrożnie rozprowadzić olej.
Następnie ponownie włącz automatyczne ustawianie ostrości i postępuj zgodnie z domyślną sugestią dla przekrojów kroku Z, aby zobrazować próbkę. E.coli powinna wyglądać jak czarne, podłużne kształty na białym tle. A zakres dynamiczny luminancji powinien pokazywać skok w jego środku.
Zdarzenia mitozy można najpierw wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 30 minutach. Chociaż pojedyncze komórki mogą być trudne do wykrycia przy małym powiększeniu. Hodowle komórek bakteryjnych przygotowane w niewłaściwym stosunku rozcieńczenia mogą wykazywać niezmienną liczbę komórek, a próbki przygotowane bez uszczelnienia płytki mogą wykazywać nadmierny skurcz, co powoduje utratę ostrości.
Komórki mogą również wgniatać żel w poszukiwaniu składników odżywczych, co powoduje układanie komórek bakteryjnych jedna na drugiej i naruszanie monowarstwy komórki, skutecznie zapobiegając wykrywaniu komórek i niezawodnemu pomiarowi sygnału fluorescencyjnego. Jak sugerują te dane, etap komórkowy w cyklu podziału nie wpływa na poziom hałasu, ponieważ różne zakresy powierzchni wykazują ten sam trend. Co więcej, nie obserwuje się istotnych zmian w stosunku sygnału do szumu między GFP a superfold GFP, co ilustrują te reprezentatywne dane.
Wykonując tę procedurę, należy zwrócić uwagę na określenie prawidłowego stosunku rozcieńczenia dla szczepu bakteryjnego użytego w eksperymencie. Porównanie stosunku sygnału do szumu każdego regulowanego obwodu z tą linią bazową pozwala na wybór obwodu o najlepszej wydajności i może ujawnić interesujące zjawiska
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania syntetycznych obwodów genowych. Protokół ten pozwala na ciągły pomiar obwodów genetycznych w E. coli oraz ocenę wydajności obwodu poprzez obliczenie zmienności sygnału i stosunku sygnału do szumu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Inżynieria genetyczna
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Szum znacząco wpływa na funkcjonowanie systemów biologicznych.
- Rośnie zainteresowanie konstruowaniem wielkoskalowych obwodów genowych.
- Obecne techniki często wymagają specjalistycznego sprzętu i przeszkolenia.
- Metoda ta jest możliwa do dostosowania do różnych szczepów i laboratoriów.
Cel badania
- Opracowanie metody obrazowania na żywo komórek E. coli.
- Analiza stochastycznego zachowania syntetycznych obwodów genowych.
- Ocena wydajności obwodu poprzez analizę sygnału.
Zastosowane metody
- Inokulacja pojedynczej kolonii z kultury transfekowanej E. coli.
- Ciągły pomiar obwodów genetycznych.
- Obliczanie zmienności sygnału i stosunku sygnału do szumu.
- Adaptacja metody dla różnych szczepów i laboratoriów.
Główne wyniki
- Technika ta jest kosztowo efektywna i wymaga minimalnego przeszkolenia.
- Pozwala ona na uzyskanie informacji na temat działania obwodów genetycznych.
- Szum odgrywa krytyczną rolę w funkcjonalności obwodu.
- Próbkami należy obchodzić się ostrożnie, aby zachować ich integralność.
Wnioski
- Metoda ta pogłębia zrozumienie syntetycznych obwodów genowych.
- Stanowi ona cenny instrument dla badaczy z zakresu mikrobiologii i inżynierii genetycznej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować wielkoskalową konstrukcję obwodów genowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ciągła kwantyfikacja szumu biologicznego w Escherichia coli z wykorzystaniem mikroskopii time-lapse umożliwia precyzyjną ocenę wydajności syntetycznych obwodów genowych na poziomie pojedynczej komórki. Możliwość ta jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka w projektach genetycznych na wczesnym etapie oraz optymalizacji konstruktów przed przejściem do wysokoprzepustowych przesiewów lub badań translacyjnych. Metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną w procesach biologii syntetycznej, dostarczając powtarzalnych, ilościowych pomiarów szumu oraz stosunku sygnału do szumu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie odporności obwodów genetycznych i zmienności szlaków w żywych systemach bakteryjnych.
- Wspiera walidację funkcjonalną konstruktów syntetycznych poprzez kwantyfikację szumu stochastycznego i wierności sygnału.
- Ułatwia uzyskanie pewności predykcyjnej przy wyborze i selekcji kandydackich obwodów do dalszego rozwoju.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy bakteryjne do dalszego przesiewania poprzez ustalenie bazowych wskaźników szumu i sygnału.
- Standaryzuje wyniki ilościowe, takie jak współczynnik zmienności (CV), w celu porównania różnych projektów obwodów.
- Umożliwia odtwarzalną ocenę wydajności obwodów, wspierając skalowalny rozwój analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność wskaźników wydajności syntetycznego obwodu z uznanymi punktami odniesienia analizatora przepływowego w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez ujawnienie zachowania obwodu w warunkach niedoboru składników odżywczych i stresu środowiskowego.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez ilościowe określenie niezawodności obwodu w warunkach istotnych fizjologicznie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etap wczesnego odkrywania z opracowywaniem testów, łącząc projektowanie obwodów oparte na hipotezach z ilościową walidacją wydajności. Stanowi ona platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnej optymalizacji i benchmarkingu konstruktów syntetycznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie szumu genetycznego i stosunku sygnału do szumu w celu wyjaśnienia funkcji obwodów i zmienności biologicznej.
- Przesiewanie: Ustanawianie powtarzalnych, ilościowych parametrów dla selekcji obwodów i przygotowania do dalszych analiz.
- Analityka: Dostarczanie współczynnika zmienności i wyników zmienności sygnału dla rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Dostosowanie danych z mikroskopii jednokomórkowej do standardów cytometrii przepływowej w celu uzyskania istotności przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Adaptowalny protokół wspiera różnorodne szczepy i laboratoria, umożliwiając szerokie zastosowanie w portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w przepływach pracy biologii syntetycznej.
- Wartość operacyjna: Oferuje zstandaryzowany, powtarzalny i kosztowo efektywny pomiar wydajności obwodów genetycznych.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w projektach obwodów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój konstruktów syntetycznych w ramach programów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu mikrobiologii oraz biegłości w obsłudze mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do standardowego sprzętu obrazowania oraz narzędzi analizy komputerowej do kwantyfikacji szumu.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek i obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość adaptacji do różnych szczepów E. coli i konstruktów genetycznych przy minimalnych modyfikacjach protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wyczerpanie składników odżywczych, dryft ostrości optycznej oraz zmienność środowiskową wpływającą na długoterminowe obrazowanie.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Escherichia coli Preparation and Plasmid Construction
2:45
Microscope Plate Preparation
5:08
Microscopic Imaging
6:20
Results: Representative Continuous Time-Lapse Microscopy Escherichia coli Biological Noise Analysis
7:43
Conclusion
