Name: Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj zautomatyzowany test barwienia jądrowego do oceny cytotoksyczności niezależnej od funkcji mitochondrialnej. Ta szybka i ekonomiczna metoda umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie leków z wykorzystaniem Hoechst 33342 i jodku propidyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NVK, stypendysta CPRIT w dziedzinie badań nad rakiem, dziękuje Instytutowi Zapobiegania i Badań nad Rakiem w Teksasie (CPRIT) za hojne wsparcie, RR150044 grantu CPRIT. Prace te były również wspierane przez Welch Foundation Research Grant C-1930 oraz przez National Institutes of Health R35 GM129294 przyznany NVK. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Test cytotoksyczności: Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwory badanych związków o pożądanych stężeniach w odpowiednich mediach (bezsercowych lub RPMI-1640 z dodatkiem 1, 2,5 lub 5% FBS).
	<ol>
		<li>W celu pomiaru cytotoksyczności pojedynczego związku (np. do wyznaczenia dawek skutecznych), przygotować związki w stężeniu 2x stężenia końcowego.</li>
		<li>W celu pomiaru cytotoksyczności kombinacji związków, przygotować związki w stężeniu 4x stężenia końcowego.</li>
		<li>Przygotować kontrole zawierające tylko rozpuszczalnik, mieszając taką samą ilość rozpuszczalnika z odpowiednim medium. Na przykład w przypadku testowania związków rozpuszczonych w DMSO i metanolu, należy przygotować kontrolę dla każdego z rozpuszczalników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać komórki z naczynia hodowlanego lub kolby do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.</li>
	<li>Przenieść 10 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi i zbarwić 10 µL 0,4% błękitu trypanu. Użyć hemocytometru do policzenia żywych i martwych komórek dla każdego źródła komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 20 g przez 5 min. Odessać lub zlać supernatant.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w mediach odpowiednich dla analizy (bezsercowych lub RPMI-1640 z dodatkiem 1, 2,5, 5% FBS) do gęstości komórek 3*105 komórek/mL. 
	UWAGA 1: Gęstość komórek 3*105 komórek/mL zapewnia gęstość wysiewu na poziomie 15 00 komórek/studzienkę. Gęstość wysiewu jest ważnym parametrem i w idealnym przypadku powinna być zdefiniowana przed rozpoczęciem eksperymentu. Przy ustalaniu gęstości wysiewu należy wziąć pod uwagę: 1) wielkość komórek – zazwyczaj większe komórki wysiewa się w mniejszej gęstości; 2) czas trwania traktowania – w eksperymentach trwających dłużej komórki zazwyczaj wysiewa się w mniejszej gęstości; 3) tempo podziałów komórkowych – komórki o wyższym tempie podziałów wysiewa się w mniejszej gęstości. Przykłady zoptymalizowanych gęstości wysiewu: komórki K562 (większe, czas 24 h) – 10 0 komórek/studzienkę; komórki MOLM-13 (średnia wielkość, traktowanie 24 h) – 15 0/studzienkę; komórki MOLM-13 (traktowanie 48 h) – 8 0/studzienkę; małe, zdrowe mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs, traktowanie 24 h) – 50 0/studzienkę; pierwotne komórki AML (traktowanie 24 h) – 15 0-20 0/studzienkę. 
	UWAGA 2: Obecność FBS w mediach może wpływać na aktywność związków. Zmniejszenie stężenia FBS może ułatwić interpretację wyników analizy, ale jednocześnie zmniejsza dokładność fizjologiczną.</li>
	<li>Wysiać 50 µL zawiesiny komórkowej z kroku 1.5 do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, używając pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Dodać związki w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W analizach pojedynczych związków dodać 50 µL 2x roztworu związku do każdej studzienki. Do studzienek kontrolnych z rozpuszczalnikiem dodać 50 µL mediów testowych zawierających rozpuszczalnik w stężeniu 2x.</li>
		<li>W analizach kombinowanych dodać po 25 µL każdego ze związków (roztwory 4x) do każdej studzienki. Do studzienek kontrolnych z pojedynczym związkiem dodać 25 µL 4x roztworu związku i 25 µL medium testowego. Do studzienek kontrolnych z rozpuszczalnikiem dodać 50 µL medium testowego lub medium testowego zawierającego rozpuszczalnik. 
		UWAGA 1: Końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,5%. 
		UWAGA 2: Ze względu na małą objętość zaleca się dodawanie mediów zawierających związki tak, aby końcówka pipety dotykała ścianki każdej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie postukać płytką, aby zapewnić wymieszanie zawartości studzienek.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze z 5% CO2 przez odpowiedni czas, np. 24 h.</li>
</ol>
2. Test cytotoksyczności: barwienie Hoechst 342 i jodkiem propidialnym
<ol>
	<li>Przygotuj 10-krotną (10x) roztwór barwiący. Roztwór ten musi być przygotowany na świeżo przed każdym eksperymentem i nie może być przechowywany. Końcowe stężenia barwników należy ustalić przed rozpoczęciem doświadczenia.
	<ol>
		<li>W przypadku linii komórkowych białaczki oraz pierwotnych komórek białaczki 1 mL 10x buforu barwiącego zawiera 10 µL 20 mM Hoechst 342 oraz 50 µL 1 mg/mL jodku propidyny w sterylnym PBS (stężenia końcowe: Hoechst 3342 20 µM, PI 5 µg/mL).</li>
		<li>W przypadku zdrowych PBMC 1 mL 10x buforu barwiącego zawiera 10 µL 20 mM Hoechst 342 oraz 10 µL 1 mg/mL jodku propidyny w sterylnym PBS (stężenia końcowe: Hoechst 342 20 µM, PI 1 µg/mL). 
		UWAGA: Końcowe stężenie jodku propidyny musi zostać ustalone przed eksperymentami. Należy przetestować komórki przy użyciu zakresu stężeń PI (1, 2,5, 5 µg/mL), a następnie porównać żywotność obliczoną na podstawie barwienia Hoechst/PI z żywotnością zmierzoną za pomocą błękitu trypanu. Powyższe stężenia PI wybrano na podstawie żywotności komórek docelowych w studniach kontrolnych z medium (powyżej ~90% dla linii komórkowych białaczki, powyżej ~70% dla zdrowych PBMC). 
		OSTROŻNIE: Hoechst 342 i jodek propidyny są potencjalnymi kancerogenami. Podczas pracy z nimi należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 µL 10x buforu barwiącego do każdej studni. 
	UWAGA: Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej, upewnij się, że końcówki pipety nie dotykają medium.</li>
	<li>Delikatnie opukaj płytkę, aby wymieszać zawartość i usunąć pęcherzyki powietrza. Barw przez 15 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wirowarkę płytkę przy 20 g przez 4 min, aby wszystkie komórki opadły na dno. Ostrożnie przetrzyj dno płytki wilgotną chusteczką Kimwipe, aby usunąć włókna i/lub zanieczyszczenia, które mogłyby zakłócić obrazowanie. 
	UWAGA 1: Wirowanie płytki zapewnia największą szansę na uchwycenie wszystkich komórek na obrazie. Często martwe komórki odrywają się i pływają w zawiesinie, co daje błędne wartości cytotoksyczności. Wirowanie niweluje ten efekt. 
	UWAGA 2: Obrazowanie płytki powinno nastąpić jak najszybciej po wirowaniu, idealnie w ciągu 15 min. Wirowanie może zmniejszyć selektywność barwienia PI i doprowadzić do powolnego gromadzenia się jodku propidyny w komórkach. Poprawa dokładności uzyskana dzięki wizualizacji martwych komórek przeważa nad niewielkim wzrostem barwienia PI. Zaleca się zakończenie obrazowania w ciągu 1 h od wirowania.</li>
</ol>
3. Test cytotoksyczności: pozyskiwanie danych
<ol>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie automatycznego mikroskopu/obrazującego płytek tak, aby wykrywało fluorescencję zarówno dla Hoechst 342 (maksimum pobudzenia 350 nm, maksimum emisji 461 nm), jak i PI (maksimum pobudzenia 493 nm, maksimum emisji 636 nm). Pozyskaj obrazy dla każdej studzienki w obu kanałach.</li>
	<li>Używając oprogramowania (takiego jak CellProfiler – bezpłatne studio analizy obrazów oparte na MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ lub oprogramowania komercyjnego, np. Gen5), należy policzyć komórki w każdym kanale w każdej studzience. 
	UWAGA: Ponieważ każda komórka powinna zostać zabarwiona Hoechst 3342, a komórki martwe powinny zostać zabarwione PI, stosunek liczby komórek martwych do wszystkich komórek reprezentuje frakcję komórek martwych. Na przykład, jeśli automatyczne przeliczenie w próbce niepoddanej działaniu czynnika wykazuje 467 komórek zabarwionych PI (komórki martwe) i 235 komórek zabarwionych Hoechst 3342 (wszystkie komórki), frakcja martwych komórek wynosi 0,2 lub 20%. Wartość tę porównuje się następnie z próbką traktowaną w identyczny sposób, w której zastosowano czynnik testowy.</li>
	<li>Szczegółowy opis akwizycji danych Hoechst/PI przy użyciu wielofunkcyjnego czytnika obrazowania komórek Cytation5 oraz oprogramowania Gen5 w wersji 3.0:
	<ol>
		<li>Skonfiguruj wielofunkcyjny czytnik i analizator obrazów płytek Cytation5 do obrazowania komórek w generycznych czarnych plastikowych płytkach 96-dołkowych o płaskim dnie.</li>
		<li>Ustaw protokół obrazowania w celu wykorzystania standardowych zestawów filtrów DAPI i Texas Red. Wykonaj zdjęcia w centrum studzienki, używając obiektywu o powiększeniu 4x. Nie stosuj żadnego przesunięcia (X/Y lub Z). Zastosuj następujące ustawienia obrazowania: DAPI – LED - 10, czas integracji - 9, wzmocnienie (gain) - 0; Texas Red – LED - 8, czas integracji - 950, wzmocnienie (gain) - 18. Przeprowadź autofokusowanie w oparciu o sygnał DAPI; nie powinno występować żadnego przesunięcia ogniskowania między kanałami.</li>
		<li>Przeprowadź analizę obrazu przy użyciu oprogramowania Gen5 w wersji 3.0. W ustawieniach oprogramowania zdefiniuj komórki jako obiekty o rozmiarach od 5 do 25 µm pod względem ich wielkości. Wyklucz obiekty krawędziowe oraz rozdziel stykające się obiekty, włączając specjalną opcję „Split touching objects”. Następnie przetwórz obraz w celu usunięcia tła (odejmowanie ciemnego tła) i zastosuj maskę jądrową (wartość progowa DAPI &gt;= 60 AU) i policz obiekty. Przeprowadź analizę subpopulacji na podstawie barwienia PI (wartość progowa dla Texas Red &gt;= 50 AU), a następnie policzyć obiekty. Procent przeżywalności komórek definiuje się jako (1 - <img alt="Równanie stosunku fluorescencji dla kwantyfikacji sygnału w analizie mikroskopowej, Texas Red/DAPI." src="/files/ftp_upload/61295/61295eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+assessment%3A+toward+content-rich+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li>
<li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Functional+Characteristic+of+Senescent+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells.</a> Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).</li>
<li>Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Castro-Vega, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescent+microenvironment+promotes+the+emergence+of+heterogeneous+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells.</a> Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).</li>
<li>Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid+tumors+by+a+single+multinucleated+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell.</a> Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).</li>
<li>Osisami, M., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Metastatic+Tumor+Dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy.</a> Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cancer+stem-like+cells+through+the+formation+of+polyploid+giant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells.</a> Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Mittal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multinucleated+polyploidy+drives+resistance+to+Docetaxel+chemotherapy+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).</li>
<li>McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine-induced+apoptosis+and+hydrogen+peroxide-induced+necrosis+in+two+human+breast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines.</a> British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).</li>
<li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+lactate+dehydrogenase+release+assay+for+screening+of+drug+candidates+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).</li>
<li>Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+necrosis+by+release+of+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).</li>
<li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Counting+and+Viability+Assessment+of+2D+and+3D+Cell+Cultures%3A+Expected+Reliability+of+the+Trypan+Blue+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay.</a> Biological Procedures Online. 19, 8(2017).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+spectral+signatures+of+the+nucleic+acid+dye+acridine+orange+can+distinguish+cell+death+by+apoptosis+and+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis.</a> Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).</li>
<li>Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+stages+in+single+apoptotic+and+necrotic+cells+monitored+by+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy.</a> Scientific Reports. 4, 4698(2014).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+increased+sensitivity+of+acute+myeloid+leukemia+to+mitotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs.</a> Cell Death & Disease. 10 (8), 617(2019).</li>
<li>Caro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+signatures+uncover+distinct+targets+in+molecular+subsets+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma.</a> Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Senft, D., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+mitochondrial+dynamics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulators of mitochondrial dynamics in cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).</li>
<li>Vazquez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC1%CE%B1+expression+defines+a+subset+of+human+melanoma+tumors+with+increased+mitochondrial+capacity+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress.</a> Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).</li>
<li>Caino, M. C., Altieri, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+exploit+adaptive+mitochondrial+dynamics+to+increase+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion.</a> Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).</li>
<li>Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+of+cancer+revisited%3A+%22mitochondrial+malignancy%22+and+ROS-induced+oncogenic+transformation+-+why+mitochondria+are+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).</li>
<li>Kreitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Plasticity+of+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Sriskanthadevan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+cells+have+low+spare+reserve+capacity+in+their+respiratory+chain+that+renders+them+susceptible+to+oxidative+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress.</a> Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).</li>
<li>Guerra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction%3A+A+Novel+Potential+Driver+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer.</a> Frontiers in Oncology. 7, 295(2017).</li>
<li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).</li>
<li>Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mitocans%2C+anti-cancer+drugs+acting+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria.</a> Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).</li>
<li>Ubah, O. C., Wallace, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy%3A+Targeting+mitochondria+and+other+sub-cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elimination+of+cancer+cells+by+deoxyglucose-ABT-263%2F737+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy.</a> PLoS One. 6 (9), 24102(2011).</li>
<li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anti-cancer+drugs%2C+mitocans%2C+to+enhance+the+immune+responses+against+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).</li>
<li>Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Synergistic+Potential+of+Mitochondria-Targeting+Drugs+for+Leukemia+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 435(2020).</li>
<li>Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults%3A+recommendations+from+an+international+expert+panel%2C+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465(2017).</li>
<li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis%3A+Implications+in+Tumor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li>
<li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+effects+of+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+on+the+differentiation+potential+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells.</a> Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).</li>
<li>Tunçer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+dimethyl+sulfoxide+driven+gross+molecular+changes+have+the+potential+to+interfere+with+various+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14828(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż protokół testu cytotoksyczności Hoechst/PI jest solidny i wymaga stosunkowo niewielkiego czasu praktycznego, istnieje kilka szczegółów eksperymentalnych, które są bardzo ważne dla zapewnienia dokładnych wyników. Po pierwsze, należy upewnić się, że stężenie DMSO pozostaje poniżej 0,5% (v/v). Powszechnie przyjmuje się, że narażenie nawet na niskie dawki DMSO może znacząco zmienić morfologię i przyczepienie komórek oraz znacznie opóźnić postęp cyklu komórkowego39,40<sup class="xref...

Pierwszym krokiem do zidentyfikowania skutecznych metod leczenia raka jest wybór solidnego, bezstronnego testu cytotoksyczności, który może być użyty do zbadania efektu leczenia. Częstym wyborem w eksperymentach o niskiej przepustowości jest wykluczenie barwnika błękitu trypanowego z żywych komórek. Ta metoda jest preferowana, ponieważ pozwala na stosunkowo bezstronną metodę ilościowego określania przeżycia komórek. Błękit trypanowy biernie dyfunduje do komórek, których błony są uszkodzone, ale jest skutecznie blokowany przed wejściem do zdrowych komórek1. Iloraz żywych komórek i wszystkich komórek reprezentuje procent żywotności, który wskazuje na skuteczność leczenia. Najważniejszą wadą testu błękitu trypanowego jest to, że słabo nadaje się on do metodologii o wysokiej przepustowości. Ma stosunkowo niski stosunek sygnału do szumu, a długotrwałe barwienie może powodować artefakty z powodu barwienia żywych komórek. W związku z tym wykluczenie błękitu trypanowego jest zazwyczaj, choć nie zawsze2, zdegradowane do ręcznego liczenia. To sprawia, że jest zbyt wolny i wprowadza duże prawdopodobieństwo stronniczości wynikającej z subiektywnej oceny badacza (chyba że stosuje się zaślepienie lub niezależne liczenia, które dodatkowo zmniejszają przepustowość laboratorium). Ogólnie rzecz biorąc, przepustowość tego testu jest niewystarczająca do nowoczesnego odkrywania leków.
Testy żywotności, które zazwyczaj mają znacznie większą przepustowość, pozwalają badaczom obejść to ograniczenie, ale wiążą się ze znaczącymi zastrzeżeniami (patrz Tabela 1). Metody te generalnie dzielą się na dwie grupy. Jedna grupa składa się z testów kolorymetrycznych, które opierają się na funkcji komórkowych enzymów redoks. Bezbarwne lub niefluorescencyjne podłoża są przekształcane w żywe produkty, które można określić ilościowo za pomocą spektrofotometru. Klasycznymi przykładami są sole tetrazolowe (MTT, WST-1, XTT itp.) i rezazuryna. Ta kategoria obejmuje również testy luminescencyjne, które wykorzystują lucyferynę do oceny poziomu ATP. Testy tego typu mają podstawowe ograniczenie polegające na tym, że mierzą metabolizm komórkowy, który nie jest żywotnością komórek jako taką. Dość często zdarza się, że komórki stają się spokojne w niesprzyjających warunkach, ale nadal zachowują zdolność do podziału3,4,5. Na przykład nowotworowe komórki macierzyste są często metabolicznie spokojne6,7,8,9 i prawdopodobnie będą trudne do zbadania przy użyciu tych technik. Skuteczność zabiegów, które uszkadzają funkcję mitochondriów, takich jak większość mitokanów, jest również prawdopodobnie znacznie przeszacowana.
Alternatywna metodologia wykorzystuje właściwości chemiczne różnych substancji, które pozwalają im przenikać lub nie przenikać przez błony biologiczne. Jednym z przykładów są plamy jądrowe, takie jak SYTOX lub jodek propidyny (PI). Ta kategoria obejmuje również testy, które są podobne pod względem koncepcji, ale różnią się funkcją, takie jak test dehydrogenazy mleczanowej (LDH), który mierzy uwalnianie LDH do środowiska zewnątrzkomórkowego jako wskaźnik martwicy komórkowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1, Tabela 1). Testy te są bardziej zdolne do rozróżniania komórek metabolicznie nieaktywnych i martwych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oznaczenie/barwnik</td>
			<td>Rodzaj wykrytej śmierci komórki</td>
			<td>Niezbędny sprzęt</td>
			<td>Kluczowe cechy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin)</td>
			<td>Apoptoza/Martwica</td>
			<td>Spektrofotometr</td>
			<td>Niedrogi, szybki, oznaczający punkt końcowy, zależny od aktywności enzymów (wyłącznie mitochondrialnych w przypadku MTT) i nie rozróżniający między trybami śmierci komórki1,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wydanie LDH</td>
			<td>martwica</td>
			<td>Spektrofotometr</td>
			<td>Szybki, niezależny od aktywności enzymów mitochondrialnych; drogi w testach wysokoprzepustowych; wykrywa komórki martwicze z uziarnioną błoną plazmatyczną11,12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Błękit trypanowy (TB)</td>
			<td>Apoptoza/Martwica</td>
			<td>mikroskop</td>
			<td>Nieprzepuszczalność komórkowa; nie rozróżnia sposobów śmierci komórki; pracochłonna i nieodpowiednia do wysokoprzepustowych badań przesiewowych; trudniejsza w użyciu z komórkami przylegającymi; podatna na subiektywną ocenę użytkownika, ale jest uważana za standardową metodę pomiaru żywotności komórek13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Pomarańczowy akrydynowy (AO)</td>
			<td>Apoptoza/Martwica/</td>
			<td rowspan="2">Mikroskop fluorescencyjny</td>
			<td rowspan="2">Barwnik kwasu nukleinowego o unikalnych właściwościach spektralnych, potrafi odróżnić apoptozę od nekrozy/nekroptozy14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nekroptoza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, DAPI</td>
			<td>apoptoza</td>
			<td>Mikroskop fluorescencyjny lub cytometr przepływowy</td>
			<td>Przepuszczalny dla komórek; nieodpowiedni sam w sobie do monitorowania śmierci komórki; przydatny do współbarwienia; może być stosowany do oceny kondensacji chromatyny i fragmentacji jąder we wczesnej apoptozie; może być łączony z jodkiem propidyny w celu odróżnienia apoptozy od nekrozy15,16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jodek propydu (PI)</td>
			<td>Późna apoptoza/martwica</td>
			<td>Mikroskop fluorescencyjny lub cytometr przepływowy</td>
			<td>Interkalator nieprzepuszczalny komórkowy; wykrywa zarówno późną apoptozę, jak i nekrozę śmierci komórki17. Toksyczny i przepuszczalny po długim czasie inkubacji18</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Lista testów cytotoksyczności. Testy cytotoksyczności, z których niektóre zostały wykorzystane w tym badaniu, wymienione wraz z krótkim opisem ich kluczowych cech.
Ostatnie badania wykazały, że metabolizm mitochondriów jest zmieniony w niektórych nowotworach19,20,21,22,23,24,25. Na przykład wykazano, że ostre białaczki szpikowe (AML) zwiększają masę mitochondrialną, zawartość mtDNA i oddychanie mitochondrialne, aby zaspokoić swoje zapotrzebowanie na energię19,26,27. Z drugiej strony, niektóre guzy lite charakteryzują się dysfunkcją mitochondriów, a raczej "przeprogramowaniem metabolicznym", takim jak regulacja w dół białek mitochondrialnych zaangażowanych w OXPHOS lub zmniejszona zawartość mtDNA, co jest związane z inwazyjnością guza, potencjałem przerzutowym i opornością na leki indukujące apoptozę28,29. Co więcej, w ostatnim czasie wzrosło zainteresowanie stosowaniem zróżnicowanych mechanicznie związków, które wpływają na funkcję mitochondriów (ogólnie nazywanych mitokanami30), jako potencjalnych terapii poszczególnych nowotworów. Leki te są ukierunkowane na syntezę ATP, mitochondrialne DNA, OXPHOS i produkcję ROS, a także białka proapoptotyczne i antyapoptotyczne związane z mitochondriami30,31. Kilka badań wykazało, że takie podejście jest bardzo obiecujące19,32,33,34. Jednak te odchylenia metaboliczne w biologii komórek nowotworowych lub terapie ukierunkowane na mitochondria mogą znacząco wpłynąć na konwencjonalne testy żywotności, które opierają się na funkcjonalności mitochondriów.
Tutaj opisany jest zoptymalizowany protokół różnicowego testu barwienia jądrowego. Protokół pozwala na szybkie i dokładne określenie cytotoksyczności mitokanów lub ich połączeń z innymi związkami. Hoechst 33342 to barwnik jądrowy przenikający komórkę, który łatwo przenika przez błony komórkowe w celu barwienia DNA, umożliwiając uzyskanie całkowitej liczby komórek. Poprzez współbarwienie z PI, który dostaje się tylko do jąder martwych komórek, można dokładnie określić proporcję żywych (tylko Hoechst) i martwych (barwionych obydwoma) komórek. Protokół ten udoskonala opublikowany test35, dodając etap optymalizacji stężenia barwnika (poprzez porównanie wyników z ortogonalną metodą błękitu trypanowego) i odwirowanie płytki przed obrazowaniem. Ponieważ wiele linii komórkowych jest częściowo przylegających lub zawieszonych, wirowanie zwiększa odsetek komórek, które są obrazowane, i znacznie poprawia dokładność. Test ma kilka zalet, w tym to, że barwienie nie wymaga usuwania pożywki ani mycia. Mieszanina barwników jest również niedroga, łatwa w przygotowaniu i kompatybilna z wielokanałowymi/zrobotyzowanymi systemami pipetowania.
Po zabarwieniu komórek, są one obrazowane za pomocą automatycznego mikroskopu. Ma to tę dodatkową zaletę, że tworzy trwały zapis obrazów, który można później ponownie przeanalizować, a efekty działania poszczególnych związków można ponownie ocenić poprzez wizualną inspekcję zarejestrowanych obrazów. Po uzyskaniu obrazów komórki można zliczać ręcznie lub za pomocą jednego z kilku pakietów oprogramowania, w tym zarówno bezpłatnego (np. ImageJ, CellProfiler itp.), jak i komercyjnego (np. Metamorph, Gen5 itp.). Automatyczne zliczanie komórek jest generalnie preferowane, ponieważ prawidłowo opracowane zautomatyzowane potoki zliczania komórek są dokładniejsze i mniej stronnicze niż zliczanie ręczne. Skuteczniej również ignorują resztki komórek lub nierozpuszczalne kompleksy. Opracowanie tych rurociągów jest na ogół proste i jest uproszczone dzięki wydajności stosowanych bejc. Dane wyjściowe są ilościowe, ponieważ rzeczywista liczba martwych komórek jest automatycznie obliczana w odniesieniu do całkowitej liczby komórek, a różne progi mogą być stosowane w celu zwiększenia lub zmniejszenia rygorystyczności wykrywania35. Dla wygody dołączono zoptymalizowane parametry do zliczania komórek za pomocą kompatybilnego z oprogramowaniem Gen5 v. 3.00 czytnika Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glukoze/2-DG</td><td>Chem-Impex</td><td>50-519-067</td><td></td></tr><tr><td>3-bromopirogronian</td><td>Alfa Aesar</td><td>1113-59-3</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Czarne lub przezroczyste płaskodenne płytki 96-dołkowe </td></tr><tr><td>Odczynnik do żywotności komórek HS Alamar niebieski (100 ml)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50101</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Czytnik wielotrybowy do obrazowania komórek</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>20 mM; stężenie końcowe 1:1,000 </td></tr><tr><td>Hyklonowa płodowa surowica bydlęca</td><td>GE Healthcare</td><td>#25-514</td><td></td></tr><tr><td>m-chlorofenylohydrazon/CCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2944100</td><td>1 tabletka + 200 ml sterylnej wody = 1x roztwór PBS </td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Zestaw testowy LDH</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-103-5952</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-596-072</td><td>Suchy proszek; zapas 1 mg/ml w PBS; stężenie końcowe 5 &mikro; g/ml (komórki białaczkowe), 1 i mikro; g / ml (normalne PBMC) </td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Ark Pharm</td><td>AK115691</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium Z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromek tetrazolowy błękitu tiazolilu</td><td>ACROS Organics</td><td>AC158990010</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td><silne>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K562</td> Linia komórkowa <td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>CML </td></tr><tr>Linia komórkowa <td>MOLM-13</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML </td></tr><tr><td>MOLT-4</td><td>ATCC</td><td>CRL-1582</td><td>ALL linia komórkowa </td></tr><tr><td>OCI-AML2</td><td>ATCC</td><td></td><td>Linia komórkowa AML </td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Wkład mitochondriów w transformację onkogenną jest przedmiotem szerokiego zainteresowania i aktywnych badań. Ponieważ dziedzina metabolizmu nowotworów staje się coraz bardziej złożona, cel celowania w mitochondria za pomocą różnych związków powodujących uszkodzenia mitochondriów (tak zwanych mitokany) staje się dość popularny. Niestety, wiele istniejących testów cytotoksyczności, takich jak te oparte na solach tetrazolowych lub rezazurynie, wymaga do ich działania funkcjonalnych enzymów mitochondrialnych. Uszkodzenia wyrządzane przez związki, które celują w mitochondria, często zagrażają dokładności tych testów. Tutaj opisujemy zmodyfikowany protokół oparty na barwieniu różnicowym dwoma barwnikami fluorescencyjnymi, z których jeden jest przepuszczalny dla komórki (Hoechst 33342), a drugi nie jest (jodek propidyny). Różnica w barwieniu pozwala na rozróżnienie żywych i martwych komórek. Test można poddać zautomatyzowanej mikroskopii i analizie obrazu, co zwiększa przepustowość i zmniejsza błąd systematyczny. Pozwala to również na stosowanie testu w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu płytek 96-dołkowych, co czyni go realną opcją dla wysiłków związanych z odkrywaniem leków, szczególnie gdy dane leki mają pewien poziom mitotoksyczności. Co ważne, wyniki uzyskane za pomocą testu barwienia Hoechst/PI wykazują zwiększoną spójność, zarówno w przypadku wyników wykluczenia błękitu trypanowego, jak i między kontrpróbami biologicznymi, gdy test jest porównywany z innymi metodami.

Wspomniany protokół został opracowany z wykorzystaniem komórek OCI-AML2, które posłużyły jako reprezentatywna linia komórkowa ostrej białaczki szpikowej. AML charakteryzuje się nieprawidłową proliferacją niedróżnicowanych i niefunkcjonalnych komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym26. Pomimo niedawnych postępów w terapii celowanej AML, standard opieki pozostaje niezmienny od kilku dekad i składa się z terapii indukcyjnej (zazwyczaj obejmującej trzy dni podawania antracyklin, np. daunorubicyny, idar...

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Metoda ta pozwoli naukowcom ocenić żywotność komórek niezależnie od funkcji mitochondriów. I jest podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków. Technika ta jest szybka, dokładna, niedroga i pozwala na określenie cytotoksyczności związków, w tym upośledzających funkcję mitochondriów w większości typów komórek.Ten protokół jest łatwy do wykonania. Ważne jest, aby zwracać uwagę na przygotowanie leku, warunki leczenia i gęstość komórek, aby zapewnić dokładność i trafność eksperymentu. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ etapy akwizycji i analizy obrazu mogą być trudne do podsumowania, szczególnie dla badaczy mających niewielkie doświadczenie z oprogramowaniem Gen5.Zacznij od przygotowania roztworów interesujących Cię związków o pożądanym stężeniu. Zawsze upewnij się, że mieszasz związki poprzez dokładne wirowanie. Aby zmierzyć cytotoksyczność pojedynczego związku, należy przygotować związki o 2-krotnym stężeniu końcowym.W przypadku pomiaru cytotoksyczności kombinacji związków, należy przygotować je w 4-krotnym stężeniu końcowym. Przygotować kontrole tylko rozpuszczalnika, mieszając tę samą ilość rozpuszczalnika z odpowiednim podłożem. Zebrać komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i podwielokrotnić 10 mikrolitrów zawiesiny komórek.W przypadku barwienia błękitem trypanowym dodaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do podwielokrotności i użyj hemocytometru lub licznika komórek, aby policzyć komórki żywotne i nieżywotne. Osadzaj komórki w 15-mililitrowej probówce pod ciśnieniem 200 razy G przez pięć minut, a następnie odsysaj lub odsysaj supernatant. Zawieszamy osad komórkowy w odpowiednim podłożu o gęstości komórek trzy razy od 10 do piątej komórki na mililitr.Użyj pipety wielokanałowej, aby wysiać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. W przypadku testów jednoskładnikowych dodaj 50 mikrolitrów roztworu związku 2X do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontrolnych rozpuszczalników dodać 15 mikrolitrów pożywki testowej zawierającej rozpuszczalnik o stężeniu 2X.W przypadku testów kombinowanych dodaj 25 mikrolitrów każdego ze związków 4X do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontrolnych z pojedynczym związkiem dodaj po 25 mikrolitrów roztworu związku 4X i pożywki testowej. Upewnij się, że końcowe stężenie DMSO nie przekracza 0,5%Aby zapewnić odtwarzalność, dodaj leki tak, aby końcówki pipet dotykały boku studzienek.Ostrożnie, aby dodać leki w różnych miejscach. To dźgnięcie powinno być wykonane bardzo szybko, najlepiej nie dłużej niż 30 minut na płytkę. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać zawartość studzienek i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Gdy będziesz gotowy do barwienia komórek Hoechst 33342 i jodkiem propidyny, przygotuj świeży 10-krotny roztwór barwiący i dodaj 10 mikrolitrów do każdej studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Odwirować płytkę w temperaturze 200 razy G przez cztery minuty, aby wszystkie komórki znalazły się na dnie płytki.Następnie ostrożnie przetrzyj spód płytki wilgotną chusteczką laboratoryjną, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą zakłócać obrazowanie. Zobrazuj płytkę w ciągu 15 minut po odwirowaniu. Otwórz oprogramowanie Gen5 i utwórz nowy standardowy protokół, kliknij Procedura i wybierz typ płyt, które mają być używane.Zwykle 96-dołkowe czarne plastikowe talerze. Następnie ustaw metodę odczytu na obraz, kliknij OK i wybierz zestawy DAPI i Texas Red Filter z obiektywem o powiększeniu 4X. Przesunięcie nie jest potrzebne, ponieważ środki studni zostaną zobrazowane.W przypadku filtra DAPI ustaw diodę LED na 10, czas integracji na 99, a wzmocnienie na zero. W przypadku Texas Red ustaw diodę LED na osiem, czas integracji na 950 i wzmocnienie na 18. Kliknij Opcje, aby upewnić się, że autofokus jest wykonywany na kanale DAPI i nie ma przesunięcia w ustawianiu ostrości między kanałami.Zapisz protokół, klikając przycisk OK. Teraz obrazy można nagrywać za pomocą przycisku Czytaj nowy. Po nagraniu obrazów kliknij Redukcja danych i wybierz Wstępne przetwarzanie obrazu.Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu z odejmowaniem ciemnego tła przy użyciu automatycznego spłaszczania rozmiaru na podstawie sygnału DAPI. W przypadku opcji Texas Red należy użyć tych samych opcji, co w przypadku kanału 1. Po zakończeniu kliknij przycisk OK.Następnie przejdź do panelu analizy komórkowej i nałóż maskę jądrową na podstawie przekształconego sygnału DAPI o wartości progowej 6 000 jednostek, minimalnym rozmiarze obiektu pięciu mikrometrów i maksymalnym rozmiarze obiektu 25 mikrometrów. Przeanalizuj cały obraz, wyklucz obiekty krawędzi głównej na obramowaniu obrazu i podziel dotykające się obiekty. W zaawansowanych opcjach wykrywania ustaw średnicę toczącej się kuli na 30 mikrometrów i oceń tło na podstawie 5% najniższych pikseli.Zachowaj tylko liczbę komórek w obliczonych metrykach. Następnie wykonaj analizę subpopulacji na podstawie średniego przekształconego sygnału Texas Red o wartości progowej 5 000 jednostek, aby policzyć martwe komórki. Na koniec uzyskaj dostęp do wynikowych liczb komórek.Reprezentatywne obrazy komórek barwionych Hoechst, jodkiem propidyny są pokazane tutaj. Całkowita liczba komórek jest rozsądnie wysoka i większa niż liczba martwych komórek. Kiedy panel testów cytotoksyczności porównano z wykluczeniem błękitu trypanowego, stwierdzono, że testy MTT i niebieskiego Alamara niedokładnie mierzyły żywotność komórek.Te testy oparte na enzymach mitochondrialnych wykazały znacznie niższą żywotność w porównaniu z wykluczeniem błękitu trypanowego. Podwójne barwienie za pomocą Hoechst 33342 i PI miało najlepszą kombinację wytrzymałości, czułości i spójności z barwieniem błękitem trypanowym oraz najmniejszym odchyleniem mediany od metody wykluczenia błękitu trypanowego po leczeniu CCP lub 2-DG. Esej Hoechst PI był również skuteczny w określaniu żywotności komórek po leczeniu mitochondriami ukierunkowanymi na cząsteczki rotenonu i trzy bromopirogroniany.Został on następnie zweryfikowany za pomocą panelu linii komórkowych białaczkowych. Komórki te różniły się wrażliwością rotenonu, od komórek bardzo wrażliwych do opornych. Niewłaściwe wykonanie testu może zagrozić jego dokładności.W tym miejscu przedstawiono kilka naruszonych wyników. Nadmierne barwienie PI, zaniedbanie etapu wirowania lub nadmierna ekspozycja w kanale Hoechsta spowoduje nieoptymalne wyniki. Podczas pomiaru czasu tego protokołu pamiętaj, aby zoptymalizować stężenie barwnika i czas barwienia dla każdej linii komórkowej.Konieczne jest również centrowanie płytki próbnej w celu zapewnienia jakości obrazowania. Po zidentyfikowaniu związków o wpływie cytotoksyczności na komórki nowotworowe, naukowcy mogą przystąpić do badań mechanistycznych w celu zidentyfikowania ich odpowiednich celów. Badania przesiewowe bibliotek małych cząsteczek za pomocą tej techniki, równolegle z konwencjonalnymi testami MTT, umożliwią szybką identyfikację cząsteczek ukierunkowanych na funkcję mitochondriów.

an-automated-differential-nuclear-staining-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje metodę barwienia jądrowego w celu wykrycia cytotoksycznego wpływu mitokanu na wrażliwe na leki komórki nowotworowe i zdrowe warianty. Podwójne barwienie barwnikami wiążącymi DNA, takimi jak jodek propidyny i barwnik Hoechsta, zapewnia wyraźne rozróżnienie między martwymi i żywymi komórkami, pomagając w ten sposób ocenić cytotoksyczność leku.

Różnicowy test barwienia jądrowego: Test mający na celu określenie cytotoksyczności mitokanu za pomocą jodku propidyny i podwójnego barwienia Hoechst

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Opisano metodę syntezy wrażliwych na powietrze tytanowych i wanadowych środków przeciwnowotworowych, wraz z oceną ich aktywności cytotoksycznej w stosunku do ludzkiej linii komórek rakowych za pomocą testu MTT.

Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Mitogeneza limfocytów T towarzyszy transformacji blastogennej, po której objętość komórki zwiększa się przed podziałem komórki. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T przy użyciu automatycznego licznika komórek z możliwością pomiaru średnic komórek.

Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Naszym celem było opracowanie praktycznego protokołu do oceny dysfunkcji mitochondriów związanych ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Ten innowacyjny protokół jest zoptymalizowany do użytku klinicznego, obejmującego tylko standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne.

Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Test mikrojądrowy (MN) jest sprawdzonym testem do ilościowego określania uszkodzeń DNA. Jednak ocena testu przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak mikroskopia ręczna lub analiza obrazu oparta na cechach, jest pracochłonna i wymagająca. W artykule opisano metodologię opracowania modelu sztucznej inteligencji do oceny testu MN przy użyciu danych z obrazowej cytometrii przepływowej.

Automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji

Bioenergetyka limfocytów T CD8 może być badana za pomocą testu stresu Mito. Metodologia ta może być wykorzystana do badania ostrego i przewlekłego programowania metabolicznego. Protokół ten opisuje podejścia do badania relacji między biologią receptora komórek T a analizą bioenergetyczną.

Pomiar funkcji mitochondrialnej naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Poznaj zautomatyzowany test barwienia jądrowego do oceny cytotoksyczności niezależnej od funkcji mitochondrialnej. Ta szybka i ekonomiczna metoda umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie leków z wykorzystaniem Hoechst 33342 i jodku propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Przeglądaj więcej filmów