Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu
12 maja 2020
Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.
Metoda ta pozwoli naukowcom ocenić żywotność komórek niezależnie od funkcji mitochondriów. I jest podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków. Technika ta jest szybka, dokładna, niedroga i pozwala na określenie cytotoksyczności związków, w tym upośledzających funkcję mitochondriów w większości typów komórek.
Ten protokół jest łatwy do wykonania. Ważne jest, aby zwracać uwagę na przygotowanie leku, warunki leczenia i gęstość komórek, aby zapewnić dokładność i trafność eksperymentu. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ etapy akwizycji i analizy obrazu mogą być trudne do podsumowania, szczególnie dla badaczy mających niewielkie doświadczenie z oprogramowaniem Gen5.
Zacznij od przygotowania roztworów interesujących Cię związków o pożądanym stężeniu. Zawsze upewnij się, że mieszasz związki poprzez dokładne wirowanie. Aby zmierzyć cytotoksyczność pojedynczego związku, należy przygotować związki o 2-krotnym stężeniu końcowym.
W przypadku pomiaru cytotoksyczności kombinacji związków, należy przygotować je w 4-krotnym stężeniu końcowym. Przygotować kontrole tylko rozpuszczalnika, mieszając tę samą ilość rozpuszczalnika z odpowiednim podłożem. Zebrać komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i podwielokrotnić 10 mikrolitrów zawiesiny komórek.
W przypadku barwienia błękitem trypanowym dodaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do podwielokrotności i użyj hemocytometru lub licznika komórek, aby policzyć komórki żywotne i nieżywotne. Osadzaj komórki w 15-mililitrowej probówce pod ciśnieniem 200 razy G przez pięć minut, a następnie odsysaj lub odsysaj supernatant. Zawieszamy osad komórkowy w odpowiednim podłożu o gęstości komórek trzy razy od 10 do piątej komórki na mililitr.
Użyj pipety wielokanałowej, aby wysiać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. W przypadku testów jednoskładnikowych dodaj 50 mikrolitrów roztworu związku 2X do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontrolnych rozpuszczalników dodać 15 mikrolitrów pożywki testowej zawierającej rozpuszczalnik o stężeniu 2X.
W przypadku testów kombinowanych dodaj 25 mikrolitrów każdego ze związków 4X do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontrolnych z pojedynczym związkiem dodaj po 25 mikrolitrów roztworu związku 4X i pożywki testowej. Upewnij się, że końcowe stężenie DMSO nie przekracza 0,5%Aby zapewnić odtwarzalność, dodaj leki tak, aby końcówki pipet dotykały boku studzienek.
Ostrożnie, aby dodać leki w różnych miejscach. To dźgnięcie powinno być wykonane bardzo szybko, najlepiej nie dłużej niż 30 minut na płytkę. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać zawartość studzienek i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Gdy będziesz gotowy do barwienia komórek Hoechst 33342 i jodkiem propidyny, przygotuj świeży 10-krotny roztwór barwiący i dodaj 10 mikrolitrów do każdej studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Odwirować płytkę w temperaturze 200 razy G przez cztery minuty, aby wszystkie komórki znalazły się na dnie płytki.
Następnie ostrożnie przetrzyj spód płytki wilgotną chusteczką laboratoryjną, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą zakłócać obrazowanie. Zobrazuj płytkę w ciągu 15 minut po odwirowaniu. Otwórz oprogramowanie Gen5 i utwórz nowy standardowy protokół, kliknij Procedura i wybierz typ płyt, które mają być używane.
Zwykle 96-dołkowe czarne plastikowe talerze. Następnie ustaw metodę odczytu na obraz, kliknij OK i wybierz zestawy DAPI i Texas Red Filter z obiektywem o powiększeniu 4X. Przesunięcie nie jest potrzebne, ponieważ środki studni zostaną zobrazowane.
W przypadku filtra DAPI ustaw diodę LED na 10, czas integracji na 99, a wzmocnienie na zero. W przypadku Texas Red ustaw diodę LED na osiem, czas integracji na 950 i wzmocnienie na 18. Kliknij Opcje, aby upewnić się, że autofokus jest wykonywany na kanale DAPI i nie ma przesunięcia w ustawianiu ostrości między kanałami.
Zapisz protokół, klikając przycisk OK. Teraz obrazy można nagrywać za pomocą przycisku Czytaj nowy. Po nagraniu obrazów kliknij Redukcja danych i wybierz Wstępne przetwarzanie obrazu.
Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu z odejmowaniem ciemnego tła przy użyciu automatycznego spłaszczania rozmiaru na podstawie sygnału DAPI. W przypadku opcji Texas Red należy użyć tych samych opcji, co w przypadku kanału 1. Po zakończeniu kliknij przycisk OK.
Następnie przejdź do panelu analizy komórkowej i nałóż maskę jądrową na podstawie przekształconego sygnału DAPI o wartości progowej 6 000 jednostek, minimalnym rozmiarze obiektu pięciu mikrometrów i maksymalnym rozmiarze obiektu 25 mikrometrów. Przeanalizuj cały obraz, wyklucz obiekty krawędzi głównej na obramowaniu obrazu i podziel dotykające się obiekty. W zaawansowanych opcjach wykrywania ustaw średnicę toczącej się kuli na 30 mikrometrów i oceń tło na podstawie 5% najniższych pikseli.
Zachowaj tylko liczbę komórek w obliczonych metrykach. Następnie wykonaj analizę subpopulacji na podstawie średniego przekształconego sygnału Texas Red o wartości progowej 5 000 jednostek, aby policzyć martwe komórki. Na koniec uzyskaj dostęp do wynikowych liczb komórek.
Reprezentatywne obrazy komórek barwionych Hoechst, jodkiem propidyny są pokazane tutaj. Całkowita liczba komórek jest rozsądnie wysoka i większa niż liczba martwych komórek. Kiedy panel testów cytotoksyczności porównano z wykluczeniem błękitu trypanowego, stwierdzono, że testy MTT i niebieskiego Alamara niedokładnie mierzyły żywotność komórek.
Te testy oparte na enzymach mitochondrialnych wykazały znacznie niższą żywotność w porównaniu z wykluczeniem błękitu trypanowego. Podwójne barwienie za pomocą Hoechst 33342 i PI miało najlepszą kombinację wytrzymałości, czułości i spójności z barwieniem błękitem trypanowym oraz najmniejszym odchyleniem mediany od metody wykluczenia błękitu trypanowego po leczeniu CCP lub 2-DG. Esej Hoechst PI był również skuteczny w określaniu żywotności komórek po leczeniu mitochondriami ukierunkowanymi na cząsteczki rotenonu i trzy bromopirogroniany.
Został on następnie zweryfikowany za pomocą panelu linii komórkowych białaczkowych. Komórki te różniły się wrażliwością rotenonu, od komórek bardzo wrażliwych do opornych. Niewłaściwe wykonanie testu może zagrozić jego dokładności.
W tym miejscu przedstawiono kilka naruszonych wyników. Nadmierne barwienie PI, zaniedbanie etapu wirowania lub nadmierna ekspozycja w kanale Hoechsta spowoduje nieoptymalne wyniki. Podczas pomiaru czasu tego protokołu pamiętaj, aby zoptymalizować stężenie barwnika i czas barwienia dla każdej linii komórkowej.
Konieczne jest również centrowanie płytki próbnej w celu zapewnienia jakości obrazowania. Po zidentyfikowaniu związków o wpływie cytotoksyczności na komórki nowotworowe, naukowcy mogą przystąpić do badań mechanistycznych w celu zidentyfikowania ich odpowiednich celów. Badania przesiewowe bibliotek małych cząsteczek za pomocą tej techniki, równolegle z konwencjonalnymi testami MTT, umożliwią szybką identyfikację cząsteczek ukierunkowanych na funkcję mitochondriów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szybki i niezawodny test do oceny żywotności komórek, szczególnie przydatny w sytuacjach, gdy funkcje mitochondriów są upośledzone. Metoda ta wykorzystuje zautomatyzowane liczenie komórek barwionych Hoechst 33342 oraz jodkiem propidium, co czyni ją odpowiednią do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ocena żywotności komórkowej
- Przesiewowe badanie leków
- Opracowywanie testów analitycznych
Wstęp
- Żywotność komórek jest kluczowa dla zrozumienia działania leków.
- Uszkodzenia mitochondriów mogą zakłócać tradycyjne analizy.
- W celu wydajnego przesiewu niezbędne są metody wysokoprzepustowe.
- Techniki zautomatyzowane zwiększają dokładność i niezawodność.
Cel badania
- Przedstawienie metody oceny żywotności komórkowej niezależnej od funkcji mitochondriów.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego screeningu leków.
- Zapewnienie dokładności eksperymentalnej poprzez odpowiednie przygotowanie leków i warunki badania.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie Hoechst 33342 oraz jodku propidyny do barwienia.
- Zautomatyzowane liczenie komórek w celu zwiększenia wydajności.
- Zwrócenie uwagi na przygotowanie leku oraz warunki traktowania.
- Pozyskiwanie obrazów i analiza z wykorzystaniem oprogramowania Gen5.
Główne wyniki
- Analiza jest szybka, dokładna i niedroga.
- Pozwala na oznaczenie cytotoksyczności związków.
- Możliwa do zastosowania w przypadku różnych typów komórek.
- Demonstracja wizualna ułatwia powtórzenie metody.
Wnioski
- Ta metoda stanowi niezawodną alternatywę do oceny żywotności komórkowej.
- Jest ona szczególnie korzystna w przypadku związków wpływających na funkcję mitochondriów.
- Stosując ten protokół, badacze mogą uzyskać wyniki o wysokiej przepustowości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena cytotoksyczności związków bez zakłócającego wpływu interferencji mitochondrialnej jest kluczowa dla dokładnej walidacji celu w procesie poszukiwania leków onkologicznych. Ten test umożliwia wiarygodne odczyty żywotności niezależne od funkcji mitochondrialnej, co ogranicza liczbę wyników fałszywie ujemnych w przesiewaniu mitocanów. Wspomaga on wczesną analizę ryzyka, dostarczając spójnych i ilościowych danych kompatybilnych z wysokoprzepustowymi schematami pracy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez odróżnienie rzeczywistej cytotoksyczności od artefaktów pomiarowych spowodowanych uszkodzeniem mitochondriów.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez spójne rozróżnianie komórek żywych i martwych z wykorzystaniem barwienia Hoechst/PI.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze wiodących związków dzięki wysokiej zgodności z testem wykluczania błękitu trypanu i niskiej zmienności między powtórzeniami.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Zgodność z formatami płytek 96-dołkowych oraz mikroskopią zautomatyzowaną umożliwia skalowalny screening związków.
- Wyniki ilościowe: Generowanie znormalizowanych wskaźników liczby komórek poprzez analizę jąder i subpopulacji w oprogramowaniu Gen5.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji dla różnych typów komórek i klas związków, w tym inhibitorów mitochondrialnych, takich jak Rotenone i 3-bromopyruvate.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Zwalidowano w liniach komórkowych białaczki o różnej wrażliwości na inhibitory mitochondrialne, co wspiera dalsze badania mechanistyczne.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia przejście od identyfikacji hitów do dekonwolucji celu poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o żywotności.
- Mitygacja ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w podejmowaniu decyzji przedklinicznych poprzez unikanie odczytów zależnych od mitochondriów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od wstępnego przesiewu po optymalizację związku wiodącego, w szczególności w przypadku związków celujących w funkcje mitochondriów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez izolowanie wpływu związków na żywotność niezależnie od stanu mitochondriów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, zautomatyzowane odczyty odpowiednie dla pierwszorzędowych i drugorzędowych przesiewów w formacie 96-dołkowym.
- Analityka: Wyniki obejmują całkowitą i liczbę martwych komórek wyznaczoną na podstawie progów sygnałów DAPI i Texas Red, co umożliwia modelowanie zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Wspiera walidację celów zgodnych z biomarkerami w modelach nowotworów hematologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy ustandaryzowaną, niskokosztową platformę badania żywotności, którą można zastosować w różnych projektach onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez wyeliminowanie interferencji mitochondrialnej w pomiarach cytotoksyczności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji protokołów barwienia, wirowania i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich i zwiększenie dokładności decyzji go/no-go.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w przypadku mitokanów oraz innych czynników cytotoksycznych z potencjałem do wywoływania dysfunkcji mitochondrialnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość mikroskopii fluorescencyjnej oraz oprogramowania Gen5 do akwizycji i analizy obrazów.
- Zależność od dostępu do automatycznych czytników płytek umożliwiających wzbudzanie DAPI i Texas Red.
- Konieczna jest optymalizacja stężenia barwnika oraz czasu barwienia dla każdej linii komórkowej, aby uniknąć nadmiernego barwienia lub saturacji sygnału.
- Wymagane jest ścisłe przestrzeganie etapów wirowania i przemywania w celu zachowania jakości obrazowania i ograniczenia zakłóceń spowodowanych obecnością zanieczyszczeń.
- Metoda ograniczona do komórek adherentnych lub zawiesinowych, kompatybilnych z zasadami maskowania jądra i wykluczania barwnika z cytoplazmy.
