Name: Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj technikę mikroinjekcji do badania dynamiki aktyny w zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu. Metoda umożliwia wizualizację pręcików aktynowych w jądrach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za pracę Liuliu Zheng i Zenghui Xue, którzy pomogli zapoczątkować tę technikę w laboratorium Sokac, a także Hasana Seede, który pomógł w analizie. Prace w ramach tego badania są finansowane z grantu NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).</li>
<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Znaczenie tej metody polega na tym, że wykorzystuje ona dobrze znany protokół mikroiniekcji w zarodkach Drosophila 21,22,23,24,25,26,27, aby umożliwić nowe badania dotyczące ASR i towarzyszącego mu zespołu pręcików aktynowych. Główną zaletą wstrzykiwaniaczerwieni G-aktyny...

Ten protokół opisuje, jak wstrzyknąćczerwień G-aktyny, aby zobrazować montaż wewnątrzjądrowych pręcików aktyny w zarodkach narażonych na stres cieplny, które przechodzą indukowalną reakcję na stres aktynowy (ASR)1. Opracowaliśmy ten protokół, aby wspomóc badania nad ASR, który w zarodkach prowadzi do zaburzenia morfogenezy i zmniejszonej żywotności, a w typach komórek dorosłych ludzi jest związany z patologiami, w tym niewydolnością nerek2, miopatiami mięśni3, oraz chorobą Alzheimera i Huntingtona4,5,6,7,8. Ten ASR jest wywoływany przez liczne stresy komórkowe, w tym szok cieplny9,10,11, stres oksydacyjny4,6, zmniejszona synteza ATP12, oraz nieprawidłowa huntingtyna lub oligomeryzacja β-amyloidu4,5,6,7,9,13,14,15,16. Cechą charakterystyczną ASR jest gromadzenie się nieprawidłowych pręcików aktyny w cytoplazmie lub jądrze dotkniętych komórek, które jest napędzane przez wywołaną stresem hiperaktywację białka oddziałującego z aktyną, Cofilin1,5,6,10. Niestety, nadal istnieją kluczowe luki w wiedzy na temat ASR. Na przykład funkcja pałeczek aktynowych nie jest znana. Nie rozumiemy, dlaczego pręciki tworzą się w cytoplazmie niektórych typów komórek, ale w jądrze innych. Nie jest też jasne, czy ASR działa ochronnie, czy nieprzystosowawczo na komórki lub zarodki poddawane stresowi. Wreszcie, nadal nie znamy szczegółowych mechanizmów leżących u podstaw hiperaktywacji kofiliny lub składania pręcików aktyny. W ten sposób protokół ten zapewnia szybki i wszechstronny test do badania ASR poprzez wizualizację tworzenia i dynamiki pręcików aktynowych w wysoce elastycznym systemie eksperymentalnym żywego zarodka muszki owocowej.
Protokół mikrowstrzykiwaniaczerwieni G-aktyny do żywych zarodków Drosophila został początkowo opracowany w celu zbadania dynamiki normalnych cytoplazmatycznych struktur aktynowych17 podczas wydarzeń związanych z budową tkanki. W tych badaniach stwierdziliśmy, że wstrzyknięcieczerwieni G-aktyny nie wpłynęło negatywnie na wczesne procesy rozwojowe zarodka, w tym cytokinezę lub gastrulację17,18. Następnie zmodyfikowaliśmy protokół, dostosowując obchodzenie się z zarodkiem i wstrzyknięcieczerwieni G-aktyny, aby umożliwić obrazowanie pałeczek aktynowych w zarodkach poddanych stresowi cieplnemu poddawanych ASR1. Inne metody oprócz wstrzyknięciaczerwieni G-aktyny mogą być stosowane do wizualizacji aktyny w zarodkach. Metody te opierają się na ekspresji białek fluorescencyjnych (FP) oznaczonych aktyną lub domenami białek wiążących aktynę, takich jak Utropin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP i Moesin-GFP (recenzja w19). Jednak korzystanie z tych sond FP wymaga ostrożności, ponieważ mogą one stabilizować lub zakłócać niektóre struktury aktyny, nie oznaczaj jednakowo wszystkich struktur aktyny20, a w przypadku aktyny-GFP są silnie nadeksprymowane – problematyczne dla analizy montażu prętów, który jest nie tylko zależny od naprężenia, ale także od stężenia aktyny1. Tak więcczerwień G-aktyna jest preferowaną sondą do badań pręcików na zarodkach much, a duży rozmiar zarodka pozwala na jej łatwe wstrzyknięcie.
Przebieg pracy tego protokołu jest podobny do innych dobrze znanych technik mikroiniekcji, które były używane do wstrzykiwania białek, kwasów nukleinowych, leków i wskaźników fluorescencyjnych do zarodków Drosophila21,22,23,24,25,26,27. Jednak po mikroiniekcjiG-actin Red zarodki są poddawane łagodnemu stresowi cieplnemu w celu wywołania ASR i wewnątrzjądrowego zespołu pręcików aktyny. W przypadku laboratoriów z dostępem do much i urządzenia do iniekcji, metoda ta powinna być łatwa do wdrożenia i dostosowana do określonych kierunków badań w odniesieniu do ASR, w tym jego indukcji przez różne stresy lub modulację w różnych tłach genetycznych.

<table><tbody><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Składnik buforu G</td></tr><tr><td>Sok jabłkowy, Mott's, 64 fl oz</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>Składnik talerzy z sokiem jabłkowym</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Składnik talerzy z sokiem jabłkowym</td></tr><tr><td>Wybielacz, PureBright Bakteriobójczy, 6,0% podchloryn sodu</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>Do dekorionacji zarodków</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Składnik buforu G</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Do pobierania zarodków z odziarniową naczyniówką</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, LSM 880 34-kanałowy z Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Do obrazowania wewnątrzjądrowych prętów aktynowych</td></tr><tr><td>Środek osuszający</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>Do suszenia zarodków</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny, Stemi 508 Stereoskop z zoomem 8:1</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>Do układania zarodków na klinie agarowym</td></tr><tr><td>Igła preparacyjna, 5 cali</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Do układania zarodków na klinie agarowym</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Składnik bufora G</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna, Scotch Permanent, 0,5 cala x 250 cala</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Do produkcji kleju do zarodków</td></tr><tr><td>Klatka do pobierania zarodków</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Do trzymania dorosłych much i pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Pęseta z cienką końcówką, Pęseta Dumont, Styl 5</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72701D</td><td>Do układania zarodków na klinie agaru</td></tr><tr><td>Kapilary szklane, szkło borokrzemianowe, cienkie 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Do mikroigieł</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Do nawodnienia zarodków</td></tr><tr><td>Inkubator z podgrzewanym stopniem</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Wycieraczki laboratoryjne, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Wycieraczki laboratoryjne</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny, Invertoskop 40C Kontrast odwróconej fazy mikroskop, odnowiony</td><td>Zeiss</td><td>Wycofany z produkcji</td><td>Mikroskop iniekcyjny</td></tr><tr><td>Metylo-4-hydroksybenzoesan</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Składnik talerzy z sokiem jabłkowym</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Mikrowtryskiwacz</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowania, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Do ładowania mikroigieł</td></tr><tr><td>Mikromanipulator i stolik iniekcyjny z pokrętłami x,y,z do regulacji igły</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Niestandardowe</td><td>Do wykonywania mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet, model P-97, płonący/brązowy</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Do wyciągania rurek kapilarnych do wytwarzania mikroigieł</td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu 24x50-1,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Do montażu zarodków</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, Lilac Colorfrost, Wstępnie oczyszczone, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Do mocowania zarodków do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>n-heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Składnik kleju do zarodków</td></tr><tr><td>Obiektyw, 10x</td><td>Zeiss</td><td>wycofany</td><td>10x obiektyw do mikroskopu</td></tr> <tr><td>iniekcyjnegoObiektyw, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss 4217679971711</td><td></td><td>40-krotny obiektyw wodny do obiektywu konfokalnego</td></tr><tr><td>, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 do zanurzania w oleju, wodzie, oleju silikonowym lub glicerynie (D=0,17mm) (WD=0,57mm przy D=0,17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25-krotny obiektyw zanurzeniowy do obiektywu konfokalnego</td></tr><tr><td>, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Oil DIC f/ELYRA</td> Obiektyw olejowy <td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x do konfokalnego</td></tr><tr><td>Pędzel, Robert Simmons Expression E85 spiczasty okrągły rozmiar 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Do transferu zarodków</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe, ręczniki papierowe Kleenex C-fold, białe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>Do sitka do komórek klombowych</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura, 5 3/4 cala</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Do pokrywania zarodków olejem</td></tr><tr><td>szalka Petriego, szkło, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Do wilgotnej komory inkubacyjnej</td></tr><tr><td>Szalka Petriego, tworzywo sztuczne, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Do talerzy z sokiem jabłkowym</td></tr><tr><td>Pipeta, Eppendorf Reference 0,5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Do ładowania końcówki do pipet mikroigłowych</td></tr><tr><td>, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>Do dodawania kleju z zarodków do szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>Do cięcia klina agarowego, taśmy, końcówek pipet</td></tr><tr><td>Aktyna globularna sprzężona z rodaminą, ludzka płytka krwi (bez mięśni; 4x10 &mu; g)</td> <td>Cytoszkielet, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-aktyna^Czerwona</td></tr><tr><td>fiolka scyntylacyjna, 20 ml Szklany borokrzemian z wkładką polietylenową i nakrętkami mocznikowymi</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>Do wytwarzania kleju do zarodków</td></tr><tr><td>Zakręcany słoik, 16 uncji</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>Do suszenia zarodków</td></tr><tr><td>Mikrometr etapowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>602104PG</td><td>Do kalibracji objętości wstrzyknięcia G-aktyny</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Składnik talerzy z sokiem jabłkowym</td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Składnik drożdży buforowych G</td></tr><tr><td>, drożdży Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Składnik pasty drożdżowej</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach drosophila poddanych stresowi cieplnemu

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Celem tego protokołu jest wizualizacja wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych, które gromadzą się w żywych zarodkach Drosophila melanogaster po stresie cieplnym. Pręciki aktynowe są cechą charakterystyczną konserwatywnej, indukowalnej odpowiedzi na stres aktynowy (ASR), która towarzyszy ludzkim patologiom, w tym chorobom neurodegeneracyjnym. Wcześniej wykazaliśmy, że ASR przyczynia się do niepowodzeń morfogenezy i zmniejszonej żywotności rozwijających się zarodków. Protokół ten pozwala na kontynuowanie badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw składania pręcików aktynowych i ASR w systemie modelowym, który jest wysoce podatny na obrazowanie, genetykę i biochemię. Zarodki są pobierane i umieszczane na szkiełku nakrywkowym w celu przygotowania ich do wstrzyknięcia. Aktyna globularna sprzężona z rodaminą (G-aktynaczerwona) jest rozcieńczana i ładowana do mikroigły. Pojedyncze wstrzyknięcie wykonuje się w środek każdego zarodka. Po wstrzyknięciu zarodki są inkubowane w podwyższonej temperaturze, a następnie wewnątrzjądrowe pręciki aktynowe są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem (FRAP) można przeprowadzić na pręcikach aktynowych; i inne struktury bogate w aktynę w cytoplazmie mogą być również obrazowane. Okazuje się, że G-aktynaczerwona polimeryzuje jak endogenna G-aktyna i sama w sobie nie zakłóca normalnego rozwoju zarodka. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że należy zachować ostrożność podczas wstrzykiwania, aby uniknąć poważnego uszkodzenia zarodka. Jednak przy odrobinie wprawy wstrzykiwanieczerwieni G-aktyny do zarodków Drosophila jest szybkim i niezawodnym sposobem wizualizacji pałeczek aktynowych i może być łatwo stosowane u much o dowolnym genotypie lub przy wprowadzaniu innych stresów komórkowych, w tym niedotlenienia i stresu oksydacyjnego.

Schematyczny przebieg procesu manipulacji zarodkami przedstawiono na Rycina 1, a harmonogram typowego eksperymentu przedstawiono w Tabela 1Przyjmuje się, że dobrym wynikiem eksperymentalnym jest sytuacja, w której dla każdych 10 wstrzykniętych embrionów co najmniej połowa obserwowanych embrionów znajduje się we właściwym stadium rozwoju, nie jest uszkodzona i wykazuje silną reakcję szoku cieplnego (ASR) przy temperaturze 32 °CTę odpowiedź na stres stresowy (ASR) potwierdzi p...

Celem tego protokołu jest wstrzyknięcie globularnej aktyny sprzężonej z rodaminą do zarodków Drosophila i zobrazowanie wewnątrzjądrowego montażu pręcików aktyny po stresie cieplnym.

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Nasz protokół jest znaczący, ponieważ wykorzystuje dobrze znaną technikę mikroiniekcji w zarodkach Drosophila, aby umożliwić nowe badania nad reakcją na stres aktynowy i towarzyszącym jej składaniem pałeczek aktynowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy badać reakcję na stres aktynowy w różnych kontekstach, takich jak zmutowany ekran lub w różnych warunkach stresu. Osoba, która nigdy wcześniej nie wykonywała tej techniki, może mieć problemy z obchodzeniem się z zarodkami i wykonaniem mikroiniekcji.Zalecamy ćwiczenie tych kroków, dopóki użytkownik nie poczuje się komfortowo. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy obchodzenia się z zarodkiem, pozycjonowania i montowania zarówno w przypadku mikroiniekcji, jak i obrazowania mogą nie być jasne na podstawie samych pisemnych instrukcji. Przygotuj kubki do pobierania zarodków i talerze agarowe z sokiem jabłkowym zgodnie ze wskazówkami rękopisu.Aby promować najbardziej obfite składanie jaj, ustaw kubki do zbierania z muchami na dwa dni przed eksperymentem. Dodaj co najmniej 100 samic i 50 samców much do każdej filiżanki, a następnie przykryj ją talerzem z sokiem jabłkowym. Przygotuj roztwór roboczy czerwonej G-aktyny i przechowuj go na lodzie, aż zostanie załadowany do mikroigły.Pozwól muchom składać zarodki przez 30 minut na talerzach z sokiem jabłkowym z pastą drożdżową w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Podczas gdy muchy leżą, wytnij żyletką prostokątny kawałek agaru z sokiem jabłkowym o wymiarach cztery na jeden centymetr i umieść go na szkiełku o wymiarach 25 na 75 milimetrów. Zbierz płytkę z kolekcji i zdechorionuj zarodki, wylewając świeży roztwór wybielacza na płytkę i obracając ją przez jedną minutę.Zwilż włosie pędzla wodą destylowaną, a następnie użyj go do przeniesienia zdechorionowanych i umytych zarodków z kosza zbiorczego na przygotowany klin agaru z soku jabłkowego na szkiełku podstawowym. Użyj pęsety z cienką końcówką lub igły do preparowania, aby ułożyć 10 zarodków w linii prostej wzdłuż długiej osi prostokątnego klina agarowego. Ułóż zarodki głowa w ogon tak, aby ich grzbietowa strona była skierowana w stronę badacza.Odetnij pół centymetra od końca końcówki pipety P200 żyletką i zanurz ją w kleju do zarodków. Obficie pokryj pięciomilimetrowy obszar wzdłuż długiej krawędzi prostokątnego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 50 milimetrów i pozostaw do wyschnięcia, klejem do góry. Po wyschnięciu kleju do zarodków delikatnie umieść klej do szkiełek nakrywkowych stroną do dołu na rzędzie wyrównanych zarodków na agarze pozostawiając od dwóch do trzech milimetrów przestrzeni między krawędzią szkiełka nakrywkowego a rzędem zarodków.Odwróć szkiełko nakrywkowe tak, aby zarodki były skierowane do góry. Powinny być utknięte w linii wzdłuż jednej długiej krawędzi szkiełka nakrywkowego, tak aby ich brzuszna część była skierowana do najbliższej krawędzi. Umieść szkiełko nakrywkowe na 150 gramach świeżego niebieskiego środka osuszającego w 16-uncjowym zakręcanym słoiku i mocno przykręć pokrywkę.Osuszaj zarodki przez 8 do 10 minut, a następnie wyjmij szkiełko nakrywkowe ze słoika ze środkiem osuszającym i przyklej każdą krótszą stronę szkiełka nakrywkowego do szkiełka mikroskopowego stroną z zarodkiem do góry. Dodaj dwie do trzech kropli pustego oleju węglowego 27 za pomocą pipety Pasteura, aby przykryć wyrównane zarodki i chronić je przed dalszym odwodnieniem. Podczas wysychania zarodków należy ponownie załadować wcześniej przygotowany czerwony supernatant G-aktyny do mikroigły za pomocą końcówki do mikroładowania.Przymocuj mikroigłę do uchwytu igły i dokręć. Umieść szkiełko z zamontowanymi zarodkami na stoliku mikroskopu i użyj kontrolek mikroigłowych, aby ustawić igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co zarodki. Wbić mikroigłę do zarodka tak, aby uderzyła w zarodek w środku jego brzusznej okolicy na równiku zarodka.Gdy końcówka mikroigły jest widoczna wewnątrz środka zarodka, należy uruchomić wstrzyknięcie. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy powoli usunąć mikroigłę. Przesunąć stolik i wykonać wstrzyknięcie na pozostałych zarodkach.Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieścić szkiełko z zarodkami w wilgotnej komorze inkubacyjnej i zamknąć pokrywę. Wyjąć szkiełko z wstrzykniętymi zarodkami z wilgotnej komory inkubacyjnej. Pracując szybko, delikatnie podważ kawałki taśmy dwustronnej, które zostały użyte do przyklejenia szkiełka nakrywkowego do szkiełka.Sklej ze sobą dwa kawałki taśmy dwustronnej o długości 2,5 centymetra i przetnij taśmę wzdłuż na pół, aby utworzyć dwa paski. Przyklej 2/3 długości każdego paska taśmy na pierwszym szkiełku nakrywkowym, zaślepiając każdą stronę zarodków. Pozostaw 1/3 pasków taśmy zwisających z krawędzi pierwszego szkiełka nakrywkowego, w którym utknęły zarodki.Delikatnie umieść drugie prostokątne szkiełko nakrywkowe na paskach taśmy, aby umieścić zarodki między szkiełkami nakrywkowymi, wyrównując krawędzie o długości 25 milimetrów, ale utrzymując krawędzie o długości 50 milimetrów przesunięte od siebie o jeden centymetr. Upewnij się, że podgrzewany stage ma odpowiednią temperaturę. A jeśli używasz mikroskopu odwróconego, dodaj płyn zanurzeniowy na wybraną soczewkę obiektywu.Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku, upewniając się, że nowa powierzchnia obrazowania jest tą, która dotyka płynu zanurzeniowego. Skoncentruj się na zarodku, który jest w celularyzacji, a następnie przełącz się na tryb akwizycji laserowej w mikroskopie konfokalnym i dostosuj moc i wzmocnienie lasera, rozmiar ramki, kafelki i ustawienia projekcji zgodnie z potrzebami. Wykonaj zdjęcia powierzchni przez płaszczyzny ogniskowe jąder zarodka, aby znaleźć wewnątrzjądrowe pręciki aktynowe.Pręciki powinny pojawiać się w wielu orientacjach jako jasne smugi lub kropki wewnątrz stosunkowo ciemnych jąder. Reakcja na stres aktynowy i zarodki poddane stresowi cieplnemu są widoczne w gromadzeniu się wewnątrzjądrowych pręcików aktyny. Pręciki aktynowe pojawiają się w różnych orientacjach wewnątrz jąder i mogą być obrazowane przez kilka płaszczyzn ogniskowych.Dla porównania, zarodki kontrolne inkubowane w temperaturze 18 stopni Celsjusza nie wykazują pałeczek aktynowych. Procent jąder zawierających pręciki można określić ilościowo i przeprowadzić eksperymenty FRAP na pręcikach. Przykład wykresu odzyskiwania fluorescencji dla bielonego i niebielonego obszaru pręcika aktynowego pokazano tutaj.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że tworzenie pręcików aktynowych zależy od temperatury. Na etapach następujących po mikroiniekcji kluczowe znaczenie ma utrzymanie zarodków w pożądanej temperaturze inkubacji. Po mikroiniekcji badacz może wykonać FRAP w celu potwierdzenia braku obrotu F-aktyny w pręcikach aktyny lub ilościowego określenia zmian w obrocie F-aktyny zachodzących w innych strukturach bogatych w aktynę.

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj technikę mikroinjekcji do badania dynamiki aktyny w zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu. Metoda umożliwia wizualizację pręcików aktynowych w jądrach komórkowych.

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

Przeglądaj więcej filmów