System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe
July 16th, 2020
Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.
Protokół ten pomoże naukowcom dokładniej określić natywny stan oligomeryczny białek błonowych poprzez wykorzystanie natywnego systemu nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową. Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona dokładne dane strukturalne białek błonowych w natywnym środowisku przypominającym błonę komórkową i może być wykorzystana do przyszłego określania struktury w wysokiej rozdzielczości. Procedurę zademonstruje Kyle Kroeck, doktor habilitowany z mojego laboratorium.
Aby przygotować natywne nanocząstki błony komórkowej, ponownie zawieś jeden gram interesującego nas granulatu błony w 10 mililitrach buforu NCMN A. Użyj szklanego homogenizatora Dounce, aby homogenizować zawieszoną próbkę błony komórkowej w temperaturze 20 stopni Celsjusza i przenieś zawieszoną próbkę do 50-mililitrowej probówki polipropylenowej. Dodać do próbki membranowy roztwór podstawowy aktywnego polimeru i dodatkowy bufor A NCMN do końcowego stężenia 2,5% aktywnego polimeru membranowego i wstrząsać roztworem przez dwie godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji ultraodwirować próbkę.
Podczas wirowania należy zrównoważyć pięciomililitrową kolumnę niklową NTA z 25 mililitrami buforu NCMN A.At końcem wirowania, przenieść supernatant na kolumnę i użyć pompy strzykawkowej ustawionej na natężenie przepływu 0,5 mililitra na minutę, aby załadować supernatant do kolumny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Umyj linie maszyny do szybkiej chromatografii cieczowej białek wystarczającą ilością buforu B NCMN, aby całkowicie przepłukać system i podłączyć kolumnę do maszyny chromatograficznej. Przemyć kolumnę 30 mililitrami buforu B NCMN przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę i zebrać przepływ.
Przemyć kolumnę 30 mililitrami buforu C NCMN przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę i zebrać przepływ. Eluować białko za pomocą 20 mililitrów buforu NCMN D przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę i użyć kolektora frakcji do zebrania jednomililitrowych frakcji próbki, a następnie przechowywać próbki białek w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą SDS-PAGE w celu sprawdzenia próbek, które odpowiadają pikom obserwowanym na wykresie elucji szybkiej chromatografii cieczowej białek. Aby przygotować siatki do barwienia ujemnego, owiń szkiełko szkiełkową bibułą filtracyjną stroną węglową skierowaną do góry i umieść na szkiełku siatki, które mają być używane do przygotowania próbki.
Umieść szkiełko podstawowe z siatkami mikroskopu elektronowego w komorze wyładowania jarzeniowego między dwiema elektrodami i załóż szklaną pokrywę, upewniając się, że pokrywa jest wyśrodkowana i dobrze uszczelniona. Uruchom maszynę do rozładowywania jarzeniowego i upewnij się, że fioletowe światło generowane przez plazmę jest widoczne. Po zakończeniu pracy maszyny poczekaj, aż komora osiągnie ciśnienie atmosferyczne, zanim zdejmiesz szklaną pokrywę i umieścisz suwak na stole.
Dostosuj stężenie oczyszczonych próbek białka do około 0,1 miligrama na mililitr i załaduj 3,5 mikrolitra próbki białka na siatkę węglową o grubości 10 nanometrów. Po jednej minucie użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć ciecz z powierzchni siatki mikroskopii elektronowej i umyj powierzchnię siatki trzy razy jedną trzymikrolitrową kroplą wody na pranie. Po ostatnim płukaniu wodą umyj powierzchnię kratki jeszcze dwa razy trzema mikrolitrowymi kropelkami świeżo przefiltrowanego octanu 2% uranu na pranie.
Po ostatnim myciu octanem uranu zabarwić siatkę trzymikrolitrową kroplą świeżo przefiltrowanego 2% octanu uranu przez jedną minutę. Pod koniec inkubacji użyj nowego kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć kropelkę i wysusz siatkę na powietrzu przez co najmniej jedną minutę przed umieszczeniem siatki w pudełku z siatką do późniejszego wykorzystania. Tutaj można zaobserwować obrazy barwienia ujemnego uzyskane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, jak pokazano.
Ujemny obraz barwienia próbki białka kanałowego B oporności na akraflawinę typu dzikiego, oczyszczonej detergentem, ujawnia jednorodny roztwór monorozproszonych cząstek, przy czym białko wykazuje dobrze zdefiniowaną strukturę czwartorzędową trimeryczną. Te struktury trimeryczne odpowiadają obserwowanemu chromatogramowi wykluczania wielkości po oczyszczeniu. Dla porównania, na negatywnym obrazie barwienia dla mutanta P223G oczyszczonego również detergentem, niejednorodny roztwór polirozproszonych nanocząstek o skłonności do agregacji, ale nie można zaobserwować natywnych trimerów.
Wyniki te są również wspierane przez chromatografię wykluczania wielkości. Podobne wyniki zaobserwowano dla białek typu dzikiego i zmutowanych po oczyszczeniu za pomocą NCMNP11 z aktywnym polimerem błonowym. Zastosowanie polimeru NCMNP52 ułatwia wytwarzanie natywnych nanocząstek błony komórkowej w znacznie większych rozmiarach, co pozwala na obrazowanie wielu trimerów białka B kanału oporności na akraflawinę w pojedynczej natywnej cząsteczce błony komórkowej.
Jednak w zmutowanej próbce nie obserwuje się żadnych cząstek trimerowych, nawet patrząc na duże natywne łaty dwuwarstwowe błony komórkowej. Analiza SDS-PAGE oczyszczonych próbek białka potwierdza obecność oporności na akraflawinę B we wszystkich próbkach o czystości większej niż 95% przy przewidywanej masie cząsteczkowej białka. Podczas modyfikowania tego protokołu dla innych białek ważne jest, aby eksperymentalnie określić odpowiednią ilość frakcji błonowej oraz długość, czas i temperaturę procesu rozpuszczania.
Jeśli obrazy próbki ujawniają jednorodny roztwór monorozproszonych cząstek o dobrze zdefiniowanych jednostkach strukturalnych, próbka może być wykorzystana do określenia struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii krioelektronowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół pomoże naukowcom dokładniej określić rodzimy stan oligomeryczny białek błonowych poprzez wykorzystanie rodzimego układu nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową. Ta technika zapewnia dokładne dane strukturalne białek błonowych w rodzimym środowisku przypominającym błonę komórkową.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Biologia strukturalna
Tło
- Rozumienie stanu oligomerycznego białek błonowych jest kluczowe dla wyjaśnienia ich funkcji.
- Tradycyjne metody mogą nie dokładnie odzwierciedlać rodzimego środowiska tych białek.
- Mikroskopia elektronowa oferuje wysokorozdzielcze możliwości obrazowania.
- Rodzime nanocząstki błony komórkowej zapewniają bardziej realistyczny kontekst do badania białek błonowych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu określania stanu oligomerycznego białek błonowych.
- Wykorzystanie rodzimych nanocząstek błony komórkowej do analizy strukturalnej.
- Poprawa dokładności danych strukturalnych uzyskanych od białek błonowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie rodzimych nanocząstek błony komórkowej z peletów błonowych.
- Homogenizacja próbek błony komórkowej za pomocą szkła Dounce.
- Ultrawirówka do izolacji nanocząstek.
- Mikroskopia elektronowa do wizualizacji struktur białek błonowych.
Główne wyniki
- Udana przygotowanie rodzimych nanocząstek błony komórkowej.
- Dokładne określenie stanów oligomerycznych białek błonowych.
- Wysokorozdzielcze obrazy uzyskane za pomocą mikroskopii elektronowej.
- Możliwość przyszłego określania wysokorozdzielczych struktur.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia rzetelną metodę badania białek błonowych.
- Wykorzystanie rodzimego środowiska poprawia dokładność danych strukturalnych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szczegółową analizę strukturalną różnych białek błonowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate determination of membrane protein oligomeric states is critical for target validation in drug discovery, as misinterpretation can lead to failed mechanistic hypotheses. The native cell membrane nanoparticle system preserves native lipid bilayer context, reducing artefactual dissociation or denaturation seen in detergent-based methods. This enables more reliable structural data for de-risking early-stage targets and informing lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving native oligomeric states of membrane protein targets like AcrB.
- Operational Value: Provides structural clarity in a native-like environment, reducing false negatives in target validation assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming functional quaternary structures prior to downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates stable, monodisperse nanoparticles suitable for reproducible biophysical assays.
- Operational Value: Enables standardization of membrane protein preparations across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large bilayer patches for imaging multiple protein complexes per particle.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural insights with preclinical validation by maintaining native membrane context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from native oligomeric states rather than detergent-induced artifacts.
- Biomarker Alignment: Supports target engagement studies where oligomeric state correlates with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural inputs that inform hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing native quaternary arrangements of membrane protein complexes.
- Screening: Delivers assay-ready, homogeneous protein nanoparticles for consistent compound screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of oligomeric state via electron microscopy and size exclusion chromatography.
- Translational Research: Ensures structural findings are translatable to native physiology, improving predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for membrane protein structural analysis across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by preserving native protein-lipid interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces variability in structural data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein isolation and nanoparticle formation.
- Depends on access to ultracentrifugation, FPLC, and electron microscopy instrumentation.
- Necessitates standardization of buffer conditions and polymer concentrations across teams.
- Involves optimization of solubilization time, temperature, and membrane fraction for each target.
- Limited by the need for empirical determination of solubilization parameters per membrane source.
