Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Protokoły różnicowania komórek macierzystych w funkcjonalne komórki nerkowe pozostają nieuchwytne. Metoda ta pozwala na uzyskanie dojrzałych podocytów o swoistości i wydajności, dostarczając nowych narzędzi do badania mechanizmów choroby nerek. Metoda ta wykorzystuje pożywkę do hodowli komórkowych i białka macierzy zewnątrzkomórkowej o chemicznie określonym składzie do produkcji ludzkich podocytów pochodzących z komórek iPS o wysokiej czystości bez stosowania selekcji subpopulacyjnej lub manipulacji genetycznej.

Istnieją ograniczone możliwości terapeutyczne dla pacjentów z chorobami nerek. Metoda ta ma implikacje dla modelowania i zrozumienia mechanizmów chorobowych, co może ułatwić opracowanie nowych biomarkerów i środków terapeutycznych. Aby utworzyć ludzką hodowlę iPSC bez podajnika, należy odessać resztkowy roztwór macierzy membrany podstawnej 1 z wstępnie powlekanych płytek i przemyć studzienki trzykrotnie jednym do dwóch mililitrów na studzienkę podgrzanego podłoża podstawowego.

Odessać zużytą pożywkę do hodowli komórkowych z ludzkiej hodowli iPSC i trzykrotnie przepłukać komórki podgrzaną pożywką. Dodaj jeden mililitr roztworu do odrywania ciepłych komórek do każdej studzienki na jednominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po potwierdzeniu zaokrąglonych krawędzi kolonii komórkowych pod mikroskopem hodowli tkankowej, szybko odessać roztwór odłączający komórki i delikatnie przepłukać komórki pożywką do hodowli komórkowych.

Dodaj trzy mililitry ludzkiej pożywki hodowlanej iPSC do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych i użyj podnośnika komórkowego, aby zeskrobać kolonie. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, aby usunąć luźno przylegające komórki i dokładnie umyć płytkę, aby zapewnić pobranie wszystkich komórek. Przenieś 500 mikrolitrów komórek do każdej studzienki nowej sześciodołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej 1 zawierającej dwa mililitry indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych na studzienkę i przesuwaj płytkę w sposób ósemkowy, aby równomiernie rozprowadzić kolonie komórek w studzienkach.

Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, codziennie odświeżając pożywkę, aż komórki osiągną około 70% zbieżności. W razie potrzeby należy aseptycznie zeskrobać obszary różnicowania przed zasysaniem supernatantu ze studzienek. Po trzykrotnym umyciu studzienek należy rozdzielić komórki, jak pokazano, i wyciągnąć powstałe zawiesiny komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Po wymieszaniu przez pipetowanie doprowadzić końcową objętość w probówce do 15 mililitrów ciepłym podłożem i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce w celu ponownego odwirowania i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki indukcyjnej mezodermy w celu zliczenia. Po zliczeniu ponownie zawieś komórki do jednego razy 10 do piątego stężenia komórek na mililitr pożywki indukującej mezodermę i odessaj roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej z płytek pokrytych matrycą błony podstawnej 2.

Przepłukać płytki dwa razy ciepłym podłożem i wymieszać indukowaną przez człowieka zawiesinę pluripotencjalnych komórek macierzystych z delikatnym pipetowaniem. Dodaj jeden mililitr komórek do każdej studzienki 12-dołkowych płytek pokrytych matrycą błony podstawnej 2 i delikatnie potrząśnij płytkami, aby rozprowadzić komórki bardziej równomiernie. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.

W dniach 2-15 różnicowania zastąp pożywkę do indukcji mezodermy jednym mililitrem pożywki do indukcji mezodermy na dołek. Jeśli obserwuje się znaczny wzrost komórek i szybkie wyczerpywanie się składników odżywczych, na co wskazuje żółknięcie pożywki, objętość pożywki do różnicowania mezodermy pośredniej można zwiększyć do 1,3 mililitra na studzienkę. W 16 dniu hodowli przepłukać pośrednie komórki mezodermy ciepłą pożywką i inkubować komórki z 500 mikrolitrami 0,05% trypsyny EDTA na studzienkę przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kiedy komórki zaczną się dysocjować, zeskrob je podnośnikiem komórek i delikatnie wymieszaj komórki przez pipetowanie. Zatrzymaj reakcję za pomocą około dwóch mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę na studzienkę i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Doprowadzić objętość do 50 mililitrów za pomocą pożywki i zebrać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w pożywce indukcyjnej podocytów w ilości od 10 do piątej komórki na mililitr stężenia pożywki i dodać komórki do płytek pokrytych macierzą błony podstawnej 2. Następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby pomóc w bardziej równomiernym rozprowadzeniu komórek i umieść je w inkubatorze na okres do pięciu dni. Korzystając z przedstawionej strategii hodowli, komórki macierzyste można najpierw różnicować w komórki mezodermy, które wykazują ekspresję Brachyury, a następnie różnicować się w pośrednie komórki mezodermy PAX2-dodatnie, a ostatecznie dojrzałe podocyty kłębuszkowe nerki.

Podocyty pochodzące z komórek macierzystych są dodatnie w stosunku do WT1, a także dla markera identyfikacyjnego linii nefryny. Co ciekawe, subkomórkowa lokalizacja nefryny występuje głównie w obrębie procesów stopy podocytów i cytoplazmy komórki, co jest zgodne z fenotypem dojrzałych podocytów. Komórki wysiane w gęstościach, które znacznie przekraczają zalecaną gęstość od jednego razy 10 do piątego komórki na dołek 12-dołkowej płytki, powodują duże skupiska komórek, które nie mają oczekiwanego morfologicznego fenotypu dojrzałych podocytów w standardowym czasie protokołu.

Wysiew w gęstościach zalecanych w tym protokole daje jednak w wyniku hodowle komórek o pożądanej morfologii. Zalecamy stosowanie odpowiedniego białka błony podstawnej do odrywania komórek i utrzymywania prawidłowej gęstości wysiewu komórek do indukcji mezodermy i podocytów. Ta metoda różnicowania podocytów może być zintegrowana z systemami mikroprzepływowymi typu organ-on-chip lub technologiami biodruku 3D w celu opracowania funkcjonalnych modeli ludzkiej nerki do badań przesiewowych leków i testów nefrotoksyczności.

Brak odpowiednich modeli hodowli komórkowych utrudnia postęp w zrozumieniu mechanizmów choroby nerek. Protokół ten zapewnia naukowcom niewyczerpane źródło podocytów pochodzących od pacjentów do modelowania chorób.