Name: Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj protokół różnicowania ludzkich komórek iPSC w dojrzałe podocyty nerkowe w warunkach zdefiniowanych chemicznie. Metoda osiąga wydajność powyżej 90% w ciągu 26 dni bez manipulacji genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Pratt School of Engineering na Duke University, Wydział Nefrologii w Duke Medical School, A Chair's Research Award z Wydziału Medycyny Duke University, oraz Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award dla S.M.. M.B był wspierany przez National Science Foundation's Graduate Research Fellowship Program. Dziękujemy Bursac Lab za hojne dostarczenie nam linii komórek macierzystych DU11 oraz Varghese Lab na Uniwersytecie Duke'a za tymczasowe udostępnienie naszej grupie swojego obiektu do hodowli tkankowej. Niniejsza publikacja jest dedykowana prof. Laurze L. Kiessling, profesor chemii w Massachusetts Institute of Technology, z okazji jej 60. urodzin.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 5x suplement pożywki do hodowli komórkowych hiPS (CCM) w pożywce podstawowej do hodowli komórkowych hiPS, aby otrzymać 1x roztwór hiPS CCM. 
	UWAGA: Mrożony suplement 5x hiPS CCM wymaga powolnego procesu rozmrażania, najlepiej w temperaturze 4 °C na noc. Podwielokrotności 1x hiPS CCM mogą być przechowywane do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotowanie płytek pokrytych błoną podstawną (BM) o matrycy 1 do hodowli komórek hiPS: Rozmrozić BM matrix 1 przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu przygotować podwielokrotności o odpowiednich współczynnikach rozcieńczenia, zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: Zazwyczaj podwielokrotności przygotowuje się do późniejszego rozcieńczenia w 25 ml zimnego DMEM/F12 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie dokładnego wymieszania w celu całkowitego rozpuszczenia matrycy BM 1 i uniknięcia tworzenia się pozostałych kryształów.</li>
	<li>Przenieść 1 ml roztworu BM matrix 1 do każdego dołka na płytce 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, owinięty folią parafinową. Płytki powlekane BM matrix 1 można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	<li>Przygotowanie płytek powlekanych membraną podstawną (BM) Matrix 2: Rozcieńczyć odpowiednie ilości BM matrix 2 w 9 ml sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml. Dodać 700 μl roztworu BM matrix 2 do każdego dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować po 100 μg/ml roztworów podstawowych BMP7, Activin A i VEGF w następujący sposób: rozpuścić BMP7 w sterylnej wodzie destylowanej zawierającej 0,1% (wag./obj.) BSA i rozpuścić Activinę A i VEGF oddzielnie w sterylnym PBS zawierającym 0,1% (wag./obj.) BSA. Aby uniknąć częstych cykli zamrażania i rozmrażania, należy przygotować 100 μl porcji z każdego roztworu podstawowego i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztwór podstawowy Y27632, rozpuszczając 10 mg Y27632 w 3,079 ml sterylnej wody destylowanej. Podać 100 μl z magazynu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Rozpuścić 2 mg CHIR99021 w 143,4 μl sterylnego DMSO, aby przygotować 30 mM roztwór podstawowy. Przygotować 5 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca (lub zgodnie z zaleceniami producenta).</li>
	<li>Rozpuść 10 mg kwasu all-trans retinowego w 3,33 ml sterylnego DMSO. Przygotować 500 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do różnicowania mezodermy, rozpuszczając odpowiednie roztwory podstawowe do końcowego stężenia 100 ng/ml aktywiny A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 i 1x B27 suplementu bez surowicy w odpowiedniej objętości DMEM/12 z suplementem glutaminy. 
	UWAGA: Pożywka do różnicowania mezodermy powinna być świeżo przygotowana przed etapami różnicowania i w objętości odpowiedniej do skali eksperymentu (zazwyczaj 50 ml pożywki jest odpowiednie na dwie płytki 12-dołkowe).</li>
	<li>Przygotować pośrednią pożywkę do różnicowania mezodermy, odtwarzając odpowiednie roztwory podstawowe do końcowego stężenia 100 ng / ml BMP7, 3 μM CHIR99021 i 1x B27 suplement bez surowicy w DMEM/F12 z suplementem glutaminy. 
	UWAGA: W razie potrzeby pożywkę można uzupełnić 1% (obj./obj.) penicyliną-streptomycyną. Dostosuj objętość pożywki za pomocą DMEM/F12 z suplementem glutaminy. Podłoże to można przygotowywać w dużych partiach; jednak zaleca się przechowywanie w mniejszych porcjach (np. 45 ml w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml), aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Nośnik ten można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy, a przed użyciem można go rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do indukcji podocytów, odtwarzając do końcowego stężenia 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml aktywiny A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplement B27 bez surowicy i 0,1 μM kwasu all-trans retinowego w DMEM/F12 z suplementem glutaminy. Chronić podłoże przed światłem (np. owijając pojemnik papierem foliowym). 
	UWAGA: Pożywka ta może być przygotowywana w dużych partiach i przechowywana w ciemności w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy. Zamrożone porcje należy rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować 25 ml roztworu neutralizującego trypsynę, dodając 10% (obj./obj.) inaktywowanego termicznie FBS w DMEM/F12 i przefiltrować w sterylnych warunkach.</li>
	<li>W celu utrzymania podocytów pochodzących z komórek macierzystych po różnicowaniu należy przygotować Complete Medium z pożywką podtrzymującą podocyty, dodając suplement do podłoża podstawowego zgodnie z wytycznymi producenta i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek hiPS bez karmienia przy użyciu pożywki do hodowli komórkowych hiPS
<ol>
	<li>Odessać pozostały roztwór matrycy BM 1 z wstępnie powlekanych płytek i przemyć studzienki 3 razy 1 do 2 ml ogrzanego DMEM/F12.</li>
	<li>Odessać zużyty hiPS CCM z komórek hiPS i przepłukać komórki 3 razy podgrzanym DMEM/F12. Dodać 1 ml roztworu do odrywania ciepłych komórek i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, aby pomóc w dysocjacji komórek. Przeprowadzić oględziny komórek pod mikroskopem hodowli tkankowych i upewnić się, że krawędzie kolonii komórkowych wydają się zaokrąglone, a następnie szybko odessać roztwór do odrywania komórek od komórek (upewniając się, że kolonie komórkowe są nadal przyczepione do płytki, choć luźno). Delikatnie przepłucz komórki raz za pomocą DMEM/F12, aby usunąć roztwór odłączający komórki.</li>
	<li>Dodać 3 ml hiPS CCM do komórek hiPS (w każdym dołku płytki 6-dołkowej), które potraktowano roztworem do oddzielania komórek. Zeskrob kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby usunąć luźno przylegające komórki. Dokładnie umyj płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. 
	UWAGA: Zaleca się użycie pipety o pojemności 5 ml, aby uniknąć nadmiernego ścinania komórek.</li>
	<li>Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki nowej 6-dołkowej płytki z matrycą BM pokrytej 1 powłoką zawierającą 2 ml hiPS CCM na studzienkę. Przesunąć płytkę w kształcie ósemki, aby rozmieścić kolonie komórek w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5 % CO2 . Odświeżać pożywkę codziennie, aż komórki będą gotowe do pasażowania lub wykorzystania w doświadczeniu różnicowania (około 70 % konfluencji). 
	UWAGA: Idealna wielkość kolonii do rutynowego pasażowania iPSC wynosi od 200 do 500 μm w warunkach bezzasilających przy użyciu hiPS CCM (bez inhibitora ROCK). Jeśli komórki zostaną zindywidualizowane podczas leczenia enzymami dysocjacyjnymi lub, hiPS CCM można uzupełnić inhibitorem ROCK (np. 10 μM Y27632) w celu poprawy żywotności komórek.</li>
</ol>
4. Różnicowanie komórek hiPS w komórki mezodermy (dni 0-2)
<ol>
	<li>Podczas gdy hodowle komórek hiPS znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego (w przybliżeniu w ciągu 4 dni hodowli po pasażowaniu i około 70% zbiegu), sprawdź wzrokowo obecność spontanicznie zróżnicowanych komórek na obrzeżach kolonii i wokół nich. W razie potrzeby w asepcie zeskrobać obszary różnicowania.</li>
	<li>Odessać hiPS CCM z komórek hiPS i przepłukać komórki 3 razy ciepłym DMEM/F12. Inkubować komórki z 1 ml bezenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek przez 10 minut w temperaturze 37 °C i sprawdzić dysocjację pod mikroskopem. Ze względu na nieodłączne różnice między różnymi liniami komórkowymi hiPS, rzeczywisty czas inkubacji bufora dysocjacji komórek musi być określony dla danej linii komórkowej.</li>
	<li>Delikatnie zeskrob studzienkę za pomocą podnośnika do komórek, aby usunąć luźno przylegające komórki i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby zindywidualizować komórki hiPS.
	<ol>
		<li>Doprowadzić zawiesinę komórek do objętości 15 ml za pomocą ciepłego DMEM/F12 i wirować przez 5 minut przy 290 x g w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Delikatnie zassać supernatant i ponownie zawiesić komórki ciepłym DMEM/F12 do kolejnej rundy wirowania w celu usunięcia resztkowych składników BM matrycy 1 i buforu dysocjacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do indukcji mezodermy, jak opisano powyżej. Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub licznika redlic w celu określenia odpowiedniej objętości pożywki różnicującej mezodermę, niezbędnej do osiągnięcia stężenia 1 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Odessać roztwór ECM z płytek powlekanych matrycą BM 2 i dwukrotnie przepłukać płytki ciepłym DMEM/F12. Zawiesinę komórek hiPS należy delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując. Przenieś 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka 12-dołkowych płytek z matrycą BM pokrytą 2, a następnie delikatnie potrząśnij płytkami, aby rozprowadzić komórki bardziej równomiernie.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Odśwież pożywkę indukcyjną mezodermy następnego dnia. 
	UWAGA: Po 2 dniach komórki mezodermy pochodzące z komórek hiPS byłyby gotowe do pośredniej indukcji mezodermy.</li>
</ol>
5. Różnicowanie komórek mezodermy pochodzących z komórek hiPS na mezodermę pośrednią (dni 2-16)
<ol>
	<li>W 2 dniu protokołu różnicowania odessać pożywkę do indukcji mezodermy i uzupełnić 1 ml na dołek pośredniej pożywki indukcyjnej mezodermy.</li>
	<li>Codziennie odświeżaj pożywkę, aby utrzymać dokładny próg czynników wzrostu i małych cząsteczek dla metabolicznie aktywnych komórek. Jeśli występuje znaczny wzrost komórek i szybkie wyczerpywanie się składników odżywczych pożywki (na co wskazuje żółknięcie pożywki), objętość pożywki do różnicowania mezodermy pośredniej można zwiększyć do 1,3 ml na studzienkę z 12-dołkowych płytek.</li>
	<li>Hoduj komórki przez dodatkowe 14 dni w celu uzyskania pośrednich komórek mezodermy. Do 16 dnia komórki te można poddać kriokonserwacji do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
6. Różnicowanie pośrednich komórek mezodermy pochodzących z komórek hiPS w podocyty (dni od 16 do 21)
<ol>
	<li>Przepłukać pośrednie komórki mezodermy ciepłym DMEM/F12, a następnie przeprowadzić inkubację komórek z 0,5 ml na studzienkę 0,05 % trypsyny-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić oględziny, aby upewnić się, że komórki zaczynają się dysocjować.</li>
	<li>Zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać pojedyncze (lub małe grudki) komórek. 
	UWAGA: Na tym etapie upewnij się, że komórki są w pełni zdysocjowane, ponieważ zagregowane komórki mogą nie uzyskać terminalnie zróżnicowanego fenotypu w czasie protokołu.</li>
	<li>Dodaj około 2 ml na studzienkę roztworu neutralizującego trypsynę, aby zatrzymać aktywność trypsyny.</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą DMEM/F12, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 201 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce indukcyjnej podocytów. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zapewnić końcową gęstość wysiewu około 100 000 komórek/dołek na płytce 12-dołkowej. Dodaj zawiesinę komórek do płytek pokrytych matrycą BM 2 i delikatnie potrząśnij płytką, aby pomóc w bardziej równomiernym rozprowadzeniu komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i codziennie odświeżać pożywkę przez okres do 5 dni, aby uzyskać podocyty do 21,< dnia / >
	UWAGA: Powstałe podocyty pochodzące z komórek hiPS można utrzymywać w hodowli przez dodatkowe 2-4 tygodnie przy użyciu kompletnej pożywki z pożywką podtrzymującą podocyty. Po umieszczeniu w pożywce podtrzymującej podocyty komórki mogą być karmione co drugi dzień i mogą być wykorzystywane do dalszych badań lub dalszych analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Pluripotent+Stem+Cells%3A+History%2C+Mechanisms%2C+Technologies%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).</li>
<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282, 1145(1998).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526, 564-568 (2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).</li>
<li>Pozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta1+integrin+expression+by+podocytes+is+required+to+maintain+glomerular+structural+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity.</a> Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).</li>
<li>Kanasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta1-mediated+matrix+assembly+and+signaling+are+critical+for+the+normal+development+and+function+of+the+kidney+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus.</a> Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Torban, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX2+Activates+WNT4+Expression+during+Mammalian+Kidney+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).</li>
<li>Reiser, J., Sever, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+biology+and+pathogenesis+of+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease.</a> Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).</li>
<li>Kuusniemi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Expression+of+Nephrin+in+Human+and+Pig%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig.</a> Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).</li>
<li>Guo, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WT1+is+a+key+regulator+of+podocyte+function%3A+reduced+expression+levels+cause+crescentic+glomerulonephritis+and+mesangial+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).</li>
<li>Shadrin, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiopatch+platform+enables+maturation+and+scale-up+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+heart+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues.</a> Nature Communications. 8, 1825(2017).</li>
<li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC%CE%BB+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).</li>
<li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367(2013).</li>
<li>Reya, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+in+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling in stem cells and cancer.</a> Nature. 434, 843-850 (2005).</li>
<li>Clevers, H., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%CE%B2-Catenin+Signaling+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wntβ-Catenin Signaling and Disease.</a> Cell. 149, 1192-1205 (2012).</li>
<li>Ciampi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).</li>
<li>Fuente Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Podocyte+and+Proximal+Tubule-Like+Cells+from+a+Mouse+Kidney-Derived+Stem+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line.</a> Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).</li>
<li>Chuah, J. K. C., Zink, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+kidney+cells+and+organoids%3A+Recent+breakthroughs+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications.</a> Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).</li>
<li>Becker, G. J., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+kidney+disease%3A+useful+but+not+perfect%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).</li>
</ol>

S.M. jest autorem zgłoszonego patentu na metody wytwarzania podocytów nerkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych (zgłoszenie patentowe w USA 14/950859). Pozostali autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

W niniejszym raporcie opisujemy protokół wytwarzania podocytów kłębuszków nerkowych z komórek hiPS. Podocyty pochodzące z komórek hiPS wykazują cechy morfologiczne i molekularne związane z fenotypem dojrzałych podocytów nerkowych13. W poprzednich publikacjach wykazaliśmy, że podocyty pochodzące z komórek hiPS mogą naśladować strukturę i funkcję selektywnej filtracji kłębuszków nerkowych, gdy są hodowane wspólnie z komórkami śródbłonka kłębuszków nerkowych w perfuzyjnym mikroprzepływowym urządzeniu...

Postępy w hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą zrewolucjonizować medycynę regeneracyjną, modelowanie chorób i badania przesiewowe leków, dostarczając badaczom odnawialnego, skalowalnego źródła materiału biologicznego, który można zaprojektować tak, aby uzyskać prawie każdy typ komórek w ludzkim ciele1. Strategia ta jest szczególnie przydatna do wyprowadzania wyspecjalizowanych i funkcjonalnych typów komórek, które w przeciwnym razie byłyby trudne do uzyskania. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPS)2,3,4,5 są szczególnie atrakcyjne ze względu na ich pochodzenie z komórek somatycznych i potencjał, jaki reprezentują dla medycyny spersonalizowanej. Jednak opracowanie metod wyprowadzania innych linii komórkowych z komórek hiPS pozostaje wyzwaniem ze względu na częste stosowanie słabo zdefiniowanych warunków hodowli, co prowadzi do niskiej wydajności i niespecyficznego generowania heterogenicznych populacji komórek6,7.
Przedstawiona tutaj jest metoda wyprowadzania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek hiPS o specyficzności i wysokiej wydajności w chemicznie zdefiniowanych warunkach. Biorąc pod uwagę rolę wielu czynników w mikrośrodowisku komórkowym, opracowano strategię różnicowania komórek macierzystych, która obejmowała optymalizację czynników rozpuszczalnych prezentowanych w pożywce do hodowli komórkowej, a także czynników nierozpuszczalnych, takich jak składniki macierzy zewnątrzkomórkowej lub substraty adhezyjne. Biorąc pod uwagę znaczenie sygnalizacji integrynowej w rozwoju i funkcji podocytów, początkowo zbadano ekspresję receptorów integryny na powierzchni komórki. Integryny β1 ulegały silnej ekspresji nie tylko w komórkach hiPS, ale także w ich pochodnych, w tym w mezodermie i pośrednich komórkach mezodermy8,9,10. Kolejne eksperymenty potwierdziły, że ligandy, które wiążą się z integrynami β1 (w tym fragment lamininy 511 lub lamininy 511-E8) wspierają adhezję i różnicowanie komórek hiPS w podocyty, gdy są stosowane w połączeniu z rozpuszczalnymi pożywkami indukcyjnymi opisanymi poniżej.
Indukcja zaangażowania linii komórkowej została zainicjowana poprzez potwierdzenie, że komórki hiPS hodowane na powierzchni pokrytej lamininą przez dwa dni w obecności pożywki zawierającej Activin A, CHIR99021 i inhibitor Y27632 Rock mogą różnicować się w komórki, które wyrażają wczesne markery mezodermy HAND1, goosecoid i brachyury8,11. Leczenie komórek mezodermy przez 14 dni pożywką uzupełnioną białkiem morfogenetycznym kości 7 (BMP-7) i CHIR99021 umożliwiło uzyskanie pośrednich komórek mezodermy, które wyrażały markery komórek progenitorowych nefronu Guz Wilma 1 (WT1), nieparzyste białko pokrewne 1 (OSR1)8,11 i sparowane białko genu 2 pudełka (PAX2)12. Aby uzyskać dojrzałe podocyty kłębuszkowe nerki, pośrednie komórki mezodermy traktowano przez 4-5 dni nową pożywką składającą się z BMP-7, aktywiny A, czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), kwasu all-trans retinowego i CHIR99021. Zastosowano cytometrię przepływową i barwienie immunologiczne, aby potwierdzić, że >90% otrzymanych komórek wykazywało cechy molekularne, morfologiczne i funkcjonalne dojrzałych podocytów nerkowych8,11,13. Cechy te obejmują rozwój pierwotnych i wtórnych wyrostków stopy; ekspresja genów specyficznych dla linii podocytów, w tym SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 oraz ekspresja białek, w tym podocyny, nefryny i WT114,15,16. Ponadto stwierdzono, że podocyty pochodzące z komórek hiPS mogą być utrzymywane w hodowli przez okres do czterech tygodni in vitro przy użyciu dostępnego na rynku pożywki 8,11, co zapewnia dodatkową elastyczność w czasie dalszych eksperymentów. Aby uzyskać więcej informacji na temat paneli cytometrii przepływowej używanych do określania czystości hiPS-podocytów, zapoznaj się z naszą poprzednią publikacją11.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie komórki</td> iPS Cells<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11</td> Linia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke University iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a.<td></td><td></td><td> Linia ta została przetestowana pod kątem mykoplazmy i została ostatnio kariotypowana w lipcu 2019 r. przez nasze laboratorium i stwierdzono, że jest kariotypowo normalna.</td></tr><tr><td>Growth Factors and MediaSupplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-trans retino acid (500 mg)</td><td>72262</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement bez surowicy</td><td>17504044</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>Może wykazywać różnice między partiami</td></tr><tr><td>Kompletny zestaw pożywki z CultureBoost-R</td><td>4Z0-500-R</td><td>Cell Systems</td><td>Pożywka do konserwacji podocytów</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 z suplementem GlutaMAX</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>DMEM/F12 z suplementem glutaminy</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>10082147</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka aktywina A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life Technologie</td><td></td></tr><tr><td>Human BMP7</td><td>PHC9544</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF</td><td>PHC9394</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>05850</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych hiPS (CCM)</td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna, płyn (100 razy;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 Inhibitor ROCK</td><td>1254</td><td>Tocris</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; oraz Alexa Fluor 594&ndash; sprzężone przeciwciała drugorzędowe</td><td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury(T)</td><td>ab20680</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R& D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Cząsteczki Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8) fragment</td><td>N-892012</td><td>Iwai Ameryka Północna</td><td>Matryca membrany podstawnej (BM) 2</td></tr><tr><td>Matrigel Matryca kwalifikowana do hESC, fiolka 5 ml</td><td>354277</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>Macierz błony podstawnej (BM) 1. Może wykazywać zmienność między partiami</td></tr><tr><td>enzymy i inne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A1110501</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Roztwór do odłączania komórek</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>D2438</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DMSO jest toksyczny. Powinien być obsługiwany w kapturze bezpieczeństwa chemicznego</td></tr><tr><td>Bezenzymatyczny bufor dysocjacji komórek, Hank' s zrównoważona sól</td><td>13150016</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór etanolu, 70% (obj./obj.), klasa biotechnologiczna</td><td>97065-058</td> Etanol <td>VWR</td><td>jest łatwopalny i toksyczny</td></tr><tr><td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>28906</td><td>Technologie</td> <td>Thermo/LifePFA należy obchodzić się z dygestorium chemicznego przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Unikać wdychania i kontaktu ze skórą.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>14190-250</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda destylowana</td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety zasysające, pakowane pojedynczo</td><td>29442-462</td> Wirówka <td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R</td><td>B99516</td> Stożkowa probówka wirówkowa <td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>, 15 ml</td><td>352097</td><td>Stożkowa</td> probówka wirówkowa Corning<td></td></tr><tr><td>, 50 ml</td><td>352098</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Cryoboxes</td><td>3395465</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Do przechowywania zamrożonych EVOS</td></tr><tr><td>M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Mikroskop fluorescencyjny służący do pozyskiwania obrazów utrwalonych i barwionych komórek iPS oraz ich pochodnych</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>100503-092</td> Inkubator CO2 <td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>Do rutynowej hodowli i konserwacji komórek iPS i ich pochodnych</td></tr><tr><td>Odwrócony Zeiss Axio Observer wyposażony w kamerę AxioCam 503</td><td>491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000 (kamera)</td><td>Mikroskopia Carl Zeiss</td><td>Służy do pozyskiwania obrazów z kontrastem fazowym żywych komórek iPS i ich pochodnych na każdym etapie różnicowania podocytów</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe Kimberly-Clark</td><td>40101-346</td><td>Chusteczki Kimwr Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>, duże</td><td>21905-049</td><td>Chusteczki Kimpripes VWR</td><td></td></tr>, <tr><td>małe</td><td>21905-026</td><td></td> Precyzyjne końcówki do pipet barierowych VWR <td></td></tr><tr><td>P10</td><td>P1096-FR</td><td>Końcówki</td> do pipet barierowych Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P100</td><td>P1125</td><td>Końcówki</td> do pipet barierowych Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>P1126</td><td>Końcówki</td> do pipet barierowych Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P20</td><td>P1121</td><td>Końcówki</td> do pipet barierowych Denville Scientific <td></td></tr><tr><td>P200</td><td>P1122</td><td>Denville Scientific Pipeta</td><td></td></tr><tr><td>serologiczna, 10 ml, pakowana pojedynczo</td><td>356551</td><td>Pipeta</td> serologiczna Corning<td></td></tr><tr><td>, 25 mL, pakowana pojedynczo</td><td>356525</td><td>Pipeta</td> serologiczna Corning<td></td></tr><tr><td>, 5 ml, pakowana pojedynczo</td><td>356543</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0,22 &mu; m, PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMD Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki do mikrowirówek</td><td>1138W14</td><td>Thomas Scientific</td><td>Do porcjowania czynników wzrostu</td></tr><tr><td>Hodowla tkankowa&ndash; Płytki 12-dołkowe poddane działaniu metody</td><td>353043</td> kultura <td>tkankowa Corning</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; Płytki sześciodołkowe poddane obróbce</td><td>353046</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Biały fartuch laboratoryjny VWR techuni</td><td>10141-342</td> Podnośnik komórkowy <td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>z szerokim skosem</td><td>3008</td><td>Corning</td><td></td></tr></tbody></table>

sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Choroba nerek dotyka ponad 10% światowej populacji i kosztuje miliardy dolarów wydatków federalnych. Najcięższe postacie choroby nerek i ostateczna schyłkowa niewydolność nerek są często spowodowane uszkodzeniem podocytów kłębuszkowych, które są wysoce wyspecjalizowanymi komórkami nabłonka, które działają razem z komórkami śródbłonka i błoną podstawną kłębuszków nerkowych, tworząc barierę filtracyjną nerek. Postęp w medycynie nefrologicznej jest utrudniony ze względu na ograniczoną dostępność tkanek pierwotnych i brak solidnych metod pozyskiwania funkcjonalnych ludzkich komórek nerkowych, takich jak podocyty. Możliwość pozyskiwania podocytów ze źródeł odnawialnych, takich jak komórki macierzyste, może przyczynić się do pogłębienia obecnej wiedzy na temat mechanizmów rozwoju i chorób nerek u ludzi, a także dostarczyć nowych narzędzi do odkryć terapeutycznych. Celem tego protokołu było opracowanie metody pozyskiwania dojrzałych, postmitotycznych podocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) o wysokiej wydajności i swoistości oraz w chemicznie określonych warunkach. Podocyty pochodzące z komórek hiPS wytwarzane tą metodą wyrażają markery specyficzne dla linii (w tym nefrynę, podocynę i guz Wilma 1) i wykazują wyspecjalizowane cechy morfologiczne (w tym pierwotne i wtórne procesy stopy) związane z dojrzałymi i funkcjonalnymi podocytami. Co ciekawe, te wyspecjalizowane cechy są wyraźnie nieobecne w unieśmiertelnionej linii komórkowej podocytów szeroko stosowanej w tej dziedzinie, co sugeruje, że opisany tutaj protokół wytwarza ludzkie podocyty nerkowe, które mają rozwojowo bardziej dojrzały fenotyp niż istniejące linie komórkowe podocytów zwykle używane do badania biologii ludzkich nerek.

Celem niniejszego protokołu było wykazanie, że dojrzałe ludzkie podocyty mogą być pochodzić z komórek hiPS w warunkach chemicznie zdefiniowanych. Dane przedstawione w niniejszym manuskrypcie zostały wygenerowane z wykorzystaniem linii komórkowej DU11 hiPS17, która została uprzednio przebadana i uznana za wolną od mikoplazmy. Przeprowadzono również analizę chromosomalną, która wykazała prawidłowy kariotyp komórek. Wychodząc z niezróżnicowanych komórek DU11 hiPS, zastosowano strategię różnicowania (...

Prezentowany tutaj jest chemicznie zdefiniowany protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych o wysokiej skuteczności (>90%) i niezależny od manipulacji genetycznych czy selekcji subpopulacji. Protokół ten pozwala na uzyskanie pożądanego typu komórek w ciągu 26 dni i może być przydatny do testowania nefrotoksyczności i modelowania choroby.

Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Protokoły różnicowania komórek macierzystych w funkcjonalne komórki nerkowe pozostają nieuchwytne. Metoda ta pozwala na uzyskanie dojrzałych podocytów o swoistości i wydajności, dostarczając nowych narzędzi do badania mechanizmów choroby nerek. Metoda ta wykorzystuje pożywkę do hodowli komórkowych i białka macierzy zewnątrzkomórkowej o chemicznie określonym składzie do produkcji ludzkich podocytów pochodzących z komórek iPS o wysokiej czystości bez stosowania selekcji subpopulacyjnej lub manipulacji genetycznej.Istnieją ograniczone możliwości terapeutyczne dla pacjentów z chorobami nerek. Metoda ta ma implikacje dla modelowania i zrozumienia mechanizmów chorobowych, co może ułatwić opracowanie nowych biomarkerów i środków terapeutycznych. Aby utworzyć ludzką hodowlę iPSC bez podajnika, należy odessać resztkowy roztwór macierzy membrany podstawnej 1 z wstępnie powlekanych płytek i przemyć studzienki trzykrotnie jednym do dwóch mililitrów na studzienkę podgrzanego podłoża podstawowego.Odessać zużytą pożywkę do hodowli komórkowych z ludzkiej hodowli iPSC i trzykrotnie przepłukać komórki podgrzaną pożywką. Dodaj jeden mililitr roztworu do odrywania ciepłych komórek do każdej studzienki na jednominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po potwierdzeniu zaokrąglonych krawędzi kolonii komórkowych pod mikroskopem hodowli tkankowej, szybko odessać roztwór odłączający komórki i delikatnie przepłukać komórki pożywką do hodowli komórkowych.Dodaj trzy mililitry ludzkiej pożywki hodowlanej iPSC do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych i użyj podnośnika komórkowego, aby zeskrobać kolonie. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, aby usunąć luźno przylegające komórki i dokładnie umyć płytkę, aby zapewnić pobranie wszystkich komórek. Przenieś 500 mikrolitrów komórek do każdej studzienki nowej sześciodołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej 1 zawierającej dwa mililitry indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych na studzienkę i przesuwaj płytkę w sposób ósemkowy, aby równomiernie rozprowadzić kolonie komórek w studzienkach.Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, codziennie odświeżając pożywkę, aż komórki osiągną około 70% zbieżności. W razie potrzeby należy aseptycznie zeskrobać obszary różnicowania przed zasysaniem supernatantu ze studzienek. Po trzykrotnym umyciu studzienek należy rozdzielić komórki, jak pokazano, i wyciągnąć powstałe zawiesiny komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Po wymieszaniu przez pipetowanie doprowadzić końcową objętość w probówce do 15 mililitrów ciepłym podłożem i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce w celu ponownego odwirowania i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki indukcyjnej mezodermy w celu zliczenia. Po zliczeniu ponownie zawieś komórki do jednego razy 10 do piątego stężenia komórek na mililitr pożywki indukującej mezodermę i odessaj roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej z płytek pokrytych matrycą błony podstawnej 2.Przepłukać płytki dwa razy ciepłym podłożem i wymieszać indukowaną przez człowieka zawiesinę pluripotencjalnych komórek macierzystych z delikatnym pipetowaniem. Dodaj jeden mililitr komórek do każdej studzienki 12-dołkowych płytek pokrytych matrycą błony podstawnej 2 i delikatnie potrząśnij płytkami, aby rozprowadzić komórki bardziej równomiernie. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.W dniach 2-15 różnicowania zastąp pożywkę do indukcji mezodermy jednym mililitrem pożywki do indukcji mezodermy na dołek. Jeśli obserwuje się znaczny wzrost komórek i szybkie wyczerpywanie się składników odżywczych, na co wskazuje żółknięcie pożywki, objętość pożywki do różnicowania mezodermy pośredniej można zwiększyć do 1,3 mililitra na studzienkę. W 16 dniu hodowli przepłukać pośrednie komórki mezodermy ciepłą pożywką i inkubować komórki z 500 mikrolitrami 0,05% trypsyny EDTA na studzienkę przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Kiedy komórki zaczną się dysocjować, zeskrob je podnośnikiem komórek i delikatnie wymieszaj komórki przez pipetowanie. Zatrzymaj reakcję za pomocą około dwóch mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę na studzienkę i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Doprowadzić objętość do 50 mililitrów za pomocą pożywki i zebrać komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić osad w pożywce indukcyjnej podocytów w ilości od 10 do piątej komórki na mililitr stężenia pożywki i dodać komórki do płytek pokrytych macierzą błony podstawnej 2. Następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby pomóc w bardziej równomiernym rozprowadzeniu komórek i umieść je w inkubatorze na okres do pięciu dni. Korzystając z przedstawionej strategii hodowli, komórki macierzyste można najpierw różnicować w komórki mezodermy, które wykazują ekspresję Brachyury, a następnie różnicować się w pośrednie komórki mezodermy PAX2-dodatnie, a ostatecznie dojrzałe podocyty kłębuszkowe nerki.Podocyty pochodzące z komórek macierzystych są dodatnie w stosunku do WT1, a także dla markera identyfikacyjnego linii nefryny. Co ciekawe, subkomórkowa lokalizacja nefryny występuje głównie w obrębie procesów stopy podocytów i cytoplazmy komórki, co jest zgodne z fenotypem dojrzałych podocytów. Komórki wysiane w gęstościach, które znacznie przekraczają zalecaną gęstość od jednego razy 10 do piątego komórki na dołek 12-dołkowej płytki, powodują duże skupiska komórek, które nie mają oczekiwanego morfologicznego fenotypu dojrzałych podocytów w standardowym czasie protokołu.Wysiew w gęstościach zalecanych w tym protokole daje jednak w wyniku hodowle komórek o pożądanej morfologii. Zalecamy stosowanie odpowiedniego białka błony podstawnej do odrywania komórek i utrzymywania prawidłowej gęstości wysiewu komórek do indukcji mezodermy i podocytów. Ta metoda różnicowania podocytów może być zintegrowana z systemami mikroprzepływowymi typu organ-on-chip lub technologiami biodruku 3D w celu opracowania funkcjonalnych modeli ludzkiej nerki do badań przesiewowych leków i testów nefrotoksyczności.Brak odpowiednich modeli hodowli komórkowych utrudnia postęp w zrozumieniu mechanizmów choroby nerek. Protokół ten zapewnia naukowcom niewyczerpane źródło podocytów pochodzących od pacjentów do modelowania chorób.

guided-differentiation-mature-kidney-podocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.

Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zoptymalizowaliśmy technikę mikroenkapsulacji jako efektywną platformę 3D do propagacji i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w endodermę oraz neurony dopaminergiczne (DA). Zapewnia ona również możliwość immunoisolacji komórek od gospodarza podczas transplantacji. Platforma ta może zostać dostosowana do innych typów komórek.

Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

Poznaj protokół różnicowania ludzkich komórek iPSC w dojrzałe podocyty nerkowe w warunkach zdefiniowanych chemicznie. Metoda osiąga wydajność powyżej 90% w ciągu 26 dni bez manipulacji genetycznej.

Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie (Wideo) | JoVE Journal

Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Przeglądaj więcej filmów