Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Nasz protokół umożliwia przetestowanie ślizgania się metalu do implantów ortopedycznych w stosunku do chrząstki stawowej, a tym samym zbadanie wpływu implantów ogniskowych lub hemiartropplastyki na aktywność biosyntetyczną poszczególnych chondracytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia kompleksowy wgląd zarówno w właściwości trybologiczne, jak i biologiczne skutki obciążenia mechanicznego w parowaniu chrząstek. Technika ta może uzupełniać wyniki kliniczne po zabiegach chirurgicznych, takich jak wszczepienie ogniskowych implantów metalowych w celu leczenia wady kostno-chrzęstnej kolana lub hemiartropplastyki stawu biodrowego. Procedurę zademonstruje Christopher Bauer, doktor habilitowany z mojego laboratorium na Uniwersytecie Dunajskim.

Używaj dostępnego na rynku tribometru posuwisto-zwrotnego z konfiguracją cylindra na płycie, możliwością obciążenia pionowego oraz regulowaną prędkością obciążenia i poślizgu. Dodatkowo do wykonania testów w roztworze smarnym wymagana jest płynna cela. Zamocować cylindry kostno-chrzęstne na dolnym uchwycie próbki z oznaczeniem wyrównanym z kierunkiem przesuwania.

Zacznij od określenia nacisku kontaktowego w kobaltowo-chromowo-molibdenowym układzie chrząstki za pomocą folii do pomiaru ciśnienia. Umieść folię do pomiaru ciśnienia na granicy faz i przyłóż obciążenie statyczne przez 30 sekund, aby określić początkowy nacisk kontaktowy, rozmiar styku i kształt. Zamontuj butle kobaltowo-chromowo-molibdenowe na górnym ogniwie obciążnikowym.

Dodaj roztwór testowy do płynnej komórki, aby zanurzyć cylinder kostno-chrzęstny i zakryć przesuwający się interfejs metalowej chrząstki. Ustaw parametry testowe, takie jak opisane w normalnym skoku siły i prędkości poślizgu, które będą utrzymywane przez cały czas trwania testu. Rozpocznij posuwisto-zwrotne przesuwanie metalowego cylindra po chrząstce stawowej zanurzonej w roztworze smarującym.

Monitorowanie współczynnika tarcia przez cały czas trwania eksperymentu, zakończenie eksperymentu. Po upływie pożądanego okresu badania wyjmij czop kostno-chrzęstny z uchwytu na próbkę, przepłucz go PBS i przechowuj w pożywce do czasu dalszej analizy biologicznej. Próbki kontrolne i roztwór testowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas trwania badania i analizować je razem z próbkami, które zostały poddane obciążeniu mechanicznemu.

Umieść 24-dołkową płytkę na wadze i wyzeruj ją. Przepłukać czop kostno-chrzęstny PBS i umieścić go na szalce Petriego. Następnie za pomocą skalpela przeciąć chrząstkę z przeszczepu na jeden kawałek, przeciąć chrząstkę na dwie równe części, tak aby obszar styku był równomiernie rozłożony na obu kawałkach chrząstki i zmielić jedną połowę na około milimetrowe kawałki sześcienne.

Użyj drugiej połowy do analizy ekspresji genów, przenieś zmieloną chrząstkę do jednego dołka przygotowanej w 24 dołkach płytki i określ masę tkanki, powtórz ten proces dla każdej próbki i dodaj jeden mililitr pożywki wzrostowej do każdego dołka płytki. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu XTT do każdej studzienki i wymieszaj, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny po inkubacji, usuń supernatant i przenieś go do pięciomililitrowej probówki. Wyekstrahować produkt tetrazolowy przez dodanie 500 mikrolitrów DMSO do tkanki chrzęstnej w każdym dołku i stosować ciągłe mieszanie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, usunąć roztwór DMSO i wyciągnąć go z wcześniej zebranym roztworem XTT.

Przenieść 100 mikrolitrów każdej próbki w trzech porcjach na płytkę 96-dołkową. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć absorbancję przy długości fali 492 nanometrów i referencyjnej długości fali 690 nanometrów. Aby wyizolować RNA, rozdrobnij drugą połowę tkanki chrzęstnej uzyskanej z czopa kostno-chrzęstnego na małe kawałki, przenieś tkankę do probówki zawierającej kulki ceramiczne i 300 mikrolitrów licencjonowanego buforu.

Z 1% beta merkaptoetanolem użyj komercyjnego lizatu do homogenizacji tkanki, stosując 6 500 obr./min przez 20 sekund cztery razy z 20-minutową fazą chłodzenia po każdym przebiegu. Do każdej próbki dodaj 20 mikrolitrów proteinazy K i 580 mikrolitrów wolnej wody RNA i inkubuj je w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut. Odwirować próbki przez trzy minuty w temperaturze 10 000 razy G i przenieść supernatant do probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 0,5 objętości 90% etanolu do każdej probówki i wymieszaj, a następnie przenieś 700 mikrolitrów próbki do kolumny wiążącej RNA w dwumililitrowej probówce zbiorczej i odwiruj ją przy 8 000 razy G przez 15 sekund. Odrzucić przepływ i powtórzyć etap wirowania dla reszty lizatu. Dodaj 350 mikrolitrów buforu RW do kolumny.

Odwirować go w temperaturze 8 000 razy G przez 15 sekund i odrzucić przepływ. Wymieszać 10 mikrolitrów roztworu podstawowego DNA i 70 mikrolitrów buforu RDD. Dodaj roztwór do membrany oczyszczającej RNA i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodaj 350 mikrolitrów buforu RW do kolumny.

Odwirować go przy 8 000 razy G przez 15 sekund i odrzucić przepływ, dodać 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny oczyszczającej RNA i odwirować go przy 8 000 razy G przez 15 sekund, odrzucić przepływ i dodać kolejne 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny oczyszczającej RNA, a następnie odwirować go przy 8, 000 razy G przez dwie minuty umieść kolumnę w nowej 1,5 mililitrowej probówce zbiorczej i dodaj 30 mikrolitrów wolnej wody RNA, odwiruj probówkę przy 8 000 razy G przez jedną minutę, aby nawiązać do zsyntetyzowanego RNA cDNA za pomocą komercyjnego zestawu rozmrozić i wymieszać wszystkie regiony, dodać próbkę RNA i przeprowadzić reakcję i termocykler zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Dodaj dziewięć mikrolitrów głównej mieszanki RTQ PCR i jeden mikrolitr cDNA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, przy czym każda próbka w trzech powtórzeniach naświetla płytkę PCR olejem sufitowym i odwiruj ją w temperaturze 877 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, wykonaj RTQ PCR oraz precyzyjny i termiczny cykler. Zgodnie ze wskazówkami rękopisu.

Przed badaniem powierzchnię styku i nacisk kontaktowy na granicy faz chrząstki metalowej należy potwierdzić za pomocą folii do pomiaru ciśnienia. Fizjologiczny stan obciążenia można następnie potwierdzić, porównując uzyskany odcisk z wnioskowaniem referencyjnym dla zdefiniowanego kontaktu. Niski współczynnik tarcia może być utrzymany przez co najmniej jedną godzinę przy migrującej powierzchni kontaktu. Skład i strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej można określić za pomocą barwienia szafranem i O.

Intensywność barwienia szafranem i O jest proporcjonalna do zawartości proteoglikanów. Zawartość proteoglikanów zmienia się na powierzchni stawowej, ale powinna być jednolita w całym przekroju tkanki w próbkach wyjściowych, wykazywać ekstrakcję glikozaminoglikanów, której można przeciwdziałać poprzez obciążenie mechaniczne. Aktywność metaboliczna chondracytów stawowych bydła jest niezależna od miejsca zbioru, ale wykazuje wzrost wraz z obciążeniem mechanicznym.

Poziomy ekspresji genów specyficznych dla chrząstki zwiększały się wraz z fizjologicznymi warunkami obciążenia. Natomiast geny kataboliczne są regulowane w górę za pomocą stacjonarnego obszaru kontaktu. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę, w tym wyznaczenie produktów wstęgi chrzęstnej oraz analizę powierzchni stawowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, a ponadto staramy się zoptymalizować smarowanie chrząstki stawowej w różnych parach tribologicznych.