Name: Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę badania biotribologicznego chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty ortopedyczne. Technika ta ocenia aktywność metaboliczną chondrocytów i właściwości tribologiczne pod obciążeniem mechanicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały sfinansowane przez NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. oraz rząd kraju związkowego Dolnej Austrii w ramach programu Life Science (ID projektu: LSC15-019) oraz przez austriacki program COMET (Projekt K2 XTribology, grant nr 849109).

1. Przygotowanie metalowych cylindrów
<ol>
	<li>Analiza cylindrycznych prętów kobaltowo-chromowo-molibdenowych (CoCrMo) spełniających standardowe specyfikacje dla implantów chirurgicznych pod względem ich składu chemicznego przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) ze spektroskopią rentgenowską z dyspersją energii zgodnie z protokołem producenta w celu potwierdzenia podanych wartości. 
	UWAGA: Skład pierwiastkowy stopu CoCrMo użytego w tym eksperymencie to 65% Co, 28% Cr, 5% Mo i 2% inne.</li>
	<li>Próbki należy zmielić na mokro papierem szlifierskim z węglika krzemu, zaczynając od wielkości ziarna 500. Używaj papieru szlifierskiego w kolejności rosnącej do wielkości ziarna 4000.</li>
	<li>Wypoleruj cylinder pastą 3 μm i 1 μm, aby uzyskać chropowatość powierzchni mieszczącą się w zakresie tolerancji wymagań dotyczących wykończenia powierzchni dla metalowych implantów chirurgicznych (ISO 5832-12:2019) oraz implantów do całkowitej i częściowej wymiany stawu (ISO 21534:2007). 
	UWAGA: Średnią chropowatość powierzchni określa się za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Przyciąć pręty CoCrMo (Ø 6 mm) na cylindry o długości 10 mm.</li>
</ol>
2. Pobieranie cylindrów kostno-chrzęstnych
<ol>
	<li>U dojrzałych szkieletów bydła (w wieku 18-24 miesięcy w momencie uśmiercenia) należy użyć stawów kolanowych bydła i przechowywać je w zamknięciu i schłodzić do czasu rozbioru w ciągu 24 godzin po uśmierceniu. 
	UWAGA: Jointy kupuje się u lokalnego rzeźnika. Staw pozostaje zamknięty do momentu rozwarstwienia.</li>
	<li>Aby pobrać cylindryczne czopy kostno-chrzęstne w warunkach aseptycznych, należy zdezynfekować kolano i wykonać artrotomię oraz odsłonić kłykieć przyśrodkowy kości udowej. 
	UWAGA: Sekcję należy wykonać z zachowaniem ostrożności, aby nie uszkodzić powierzchni stawowej.</li>
	<li>Sprawdź powierzchnię stawową pod kątem uszkodzeń makroskopowych. 
	UWAGA: Próbkę należy wyrzucić, jeśli chrząstka nie ma białawego, gładkiego i błyszczącego wyglądu lub jeśli występują pęcherze, szczeliny lub większe wady.</li>
	<li>Ustaw rurkę tnącą prostopadle do powierzchni stawowej obszaru nośnego i wbij urządzenie w chrząstkę i kość podchrzęstną za pomocą mocnych uderzeń młotkiem. Przy głębokości penetracji 15 mm przekręć urządzenie nagłym ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara.</li>
	<li>Wyjmij urządzenie, włóż białe pokrętło i wkręć je, aż dolny koniec korka kostno-chrzęstnego będzie widoczny.</li>
	<li>Oznacz przednio-tylne ułożenie próbek sterylnym markerem w celu odpowiedniego rozmieszczenia cylindra kostno-chrzęstnego podczas badania. 
	UWAGA: Trójwymiarowa sieć kolagenowa i jej złożona architektura ułatwiają uzyskanie unikalnych właściwości mechanicznych chrząstki stawowej i powinny być brane pod uwagę przy orientacji próbek.</li>
	<li>Przepłukać próbkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu zmycia krwi i tkanki tłuszczowej.</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki, aby zebrać żądaną liczbę czopów kostno-chrzęstnych (średnica 8 mm, długość 15 mm). 
	UWAGA: Zazwyczaj od 9 do 12 cylindrów kostno-chrzęstnych można pobrać z obszaru nośnego na przyśrodkowym kłykciu kości udowej.</li>
	<li>Umieścić próbki w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, uzupełnionej antybiotykami (penicylina 200 j./ml; streptomycyna 0,2 mg/ml) i amfoterycyna B 2,5 μg/ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia testów w celu utrzymania żywotności.</li>
	<li>Analizuj kontrolne czopki kostno-chrzęstne natychmiast po zbiorze w celu ustalenia wartości wyjściowych (patrz sekcja analiza).</li>
</ol>
3. Badania trybologiczne
<ol>
	<li>Wykonaj eksperymenty przy użyciu dostępnego na rynku tribometru posuwisto-zwrotnego z konfiguracją cylinder na płycie. Wymagania dotyczące urządzenia to obciążenie pionowe oraz regulowane obciążenie i prędkość ślizgu. Ponadto kuweta cieczowa umożliwia wykonywanie testów w roztworze smarującym.</li>
	<li>Określić ciśnienie kontaktowe w systemie CoCrMo-on-chrząstka za pomocą folii do pomiaru ciśnienia. Umieść folię do pomiaru ciśnienia na granicy faz i przyłóż obciążenie statyczne przez 30 s, aby określić początkowy nacisk kontaktowy, rozmiar i kształt styku. Ze względu na wypukłość metalowego cylindra i chrząstki stawowej, początkowa powierzchnia styku ma w tej konfiguracji kształt eliptyczny. 
	UWAGA: Folia do pomiaru ciśnienia reaguje na przyłożone ciśnienie, pokazując czerwone przebarwienia stref, w których ciśnienie progowe zostało osiągnięte lub przekroczone. Dla 1 N obciążenia nacisk docisku określono na około 2 MPa poprzez wizualne porównanie ze zdefiniowanymi dociskami dotycznymi.</li>
	<li>Zamocuj cylindry kostno-chrzęstne na dolnym uchwycie próbki z oznaczeniem wyrównanym z kierunkiem przesuwania i zamontuj butle CoCrMo na górnym ogniwie obciążnikowym.</li>
	<li>Dodać roztwór testowy (PBS z kwasem hialuronowym 3 g/l) do płynnej komórki, co powoduje zanurzenie cylindra kostno-chrzęstnego i pokrycie ślizgowej granicy metalowo-chrzęstnej.</li>
	<li>Ustaw parametry testowe (zalecana siła normalna, skok i prędkość poślizgu), które są następnie stosowane i utrzymywane przez cały czas trwania testu. 
	UWAGA: Długość skoku ruchu posuwisto-zwrotnego musi być ustawiona zgodnie z obszarem kontaktu, aby utworzyć migrujący obszar kontaktu (MCA). W przypadku zatyczek o średnicy 8 mm, skok 2 mm umożliwia odpowiednie nawodnienie chrząstki.</li>
	<li>Rozpocznij posuwisto-zwrotne przesuwanie cylindra CoCrMo po chrząstce stawowej zanurzonej w roztworze smarującym o ustawionych parametrach obciążenia.</li>
	<li>Monitoruj współczynnik tarcia (COF) podczas eksperymentów. 
	UWAGA: COF jest oceniany automatycznie, ale można go obliczyć za pomocą równania μ=F/W (μ - współczynnik tarcia; F - siła tarcia; W - normalne obciążenie przyłożone przez system).</li>
	<li>Zakończ eksperyment po żądanym okresie testowania.</li>
	<li>Wyjąć czop kostno-chrzęstny z uchwytu na próbkę, przepłukać go PBS i przechowywać w pożywce do czasu dalszej analizy biologicznej (patrz poniżej).</li>
	<li>Zanurzyć próbki kontrolne w roztworze testowym w temperaturze pokojowej na czas trwania badania i analizować razem z próbkami, które zostały poddane obciążeniu mechanicznemu.</li>
</ol>
4. Analiza
UWAGA: Cylinder kostno-chrzęstny jest analizowany pod kątem aktywności metabolicznej i ekspresji genów w celu zbadania aktywności biologicznej; histologia jest wykonywana w celu zbadania integralności powierzchni chrząstki i leżącej pod nią matrycy.
<ol>
	<li>histologia
	<ol>
		<li>W celu analizy histologicznej zanurzyć czopki kostno-chrzęstne w 4% buforowanym roztworze formaldehydu w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.</li>
		<li>Przepłukać próbki PBS i umieścić je w plastikowym naczyniu.</li>
		<li>Dodać nadmiar gotowego do użycia roztworu odkamieniającego, tak aby wszystkie próbki były pokryte.</li>
		<li>Stosuj ciągłe mieszanie przez 4 tygodnie, aby całkowicie odwapnić.</li>
		<li>Po odwapnieniu zanurzyć próbki w rozpuszczalnych w wodzie glikolach i żywicach i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Uzyskać przekroje 6 μm przez kriosekcję poprzeczną do obszaru kontaktu.</li>
		<li>Następnie należy przygotować próbki do barwienia Safraniną O i barwienia przeciwstawnego Fastgreen zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przechwytywanie obrazów histologicznych za pomocą mikroskopu i przetwarzanie za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywność metaboliczna 
	UWAGA: Aktywność metaboliczną chondrocytów w chrząstce stawowej bada się za pomocą testu toksykologicznego ex vivo opartego na XTT.
	<ol>
		<li>Przepłukać czop kostno-chrzęstny za pomocą PBS i umieścić próbkę na szalce Petriego.</li>
		<li>Umieść 24-dołkową płytkę na wadze i wyzeruj wagę.</li>
		<li>Odetnij chrząstkę z przeszczepu kostno-chrzęstnego skalpelem w jednym kawałku.</li>
		<li>Przeciąć chrząstkę na dwie równe części, tak aby powierzchnia styku była równomiernie rozłożona na obu kawałkach chrząstki i zmielić od połowy do 1 mm³ kawałków. Druga połowa służy do analizy ekspresji genów.</li>
		<li>Przenieść zmieloną chrząstkę do jednego dołka przygotowanej płytki 24-dołkowej i określić masę tkanki.</li>
		<li>Powtórz czynności wymienione powyżej dla każdej próbki i dodaj 1 ml pożywki wzrostowej do każdego dołka płytki.</li>
		<li>Dodać roztwór XTT (490 μl odczynnika do znakowania XTT i 10 μl odczynnika aktywacyjnego) zgodnie z instrukcją producenta i wymieszać.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji usunąć supernatant i przenieść go do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Ekstrahować produkt tetrazolowy przez dodanie 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do tkanki chrzęstnej w płytce 24-dołkowej i stosować ciągłe mieszanie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń rozwiązanie DMSO i połącz je z wcześniej zebranym roztworem XTT.</li>
		<li>Przenieść 100 μl próbki w trzech egzemplarzach na 96-dołkową płytkę na czytniku płytek i zmierzyć absorbancję przy długości fali 492 nm i referencyjnej długości fali przy 690 nm.</li>
		<li>Znormalizować uzyskane wartości absorbancji do mokrej masy każdej próbki i przeprowadzić analizę za pomocą oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ekspresji genów
	<ol>
		<li>Izolacja RNA 
		UWAGA: Izolację RNA przeprowadza się za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta z niewielkimi poprawkami.
		<ol>
			<li>Drugą połowę tkanki chrzęstnej uzyskanej z czopa kostno-chrzęstnego należy rozdrobnić na małe kawałki.</li>
			<li>Przenieś je do probówki zawierającej kulki ceramiczne i 300 μl buforu do lizy (zawierającego 1% β-merkaptoetanolu). 
			UWAGA: Próbki można zamrozić w ciekłym azocie do czasu dalszej obróbki.</li>
			<li>Rozmrażać próbki przez 2 minuty i używać dostępnego w handlu lizera do homogenizacji tkanki. Stosować 6500 obr./min przez 20 s (etap homogenizacji) cztery razy z 2-minutową fazą chłodzenia po każdym przebiegu (w temperaturze 4 °C przy użyciu komercyjnego urządzenia chłodzącego lizer), aby całkowicie rozbić tkankę.</li>
			<li>Do każdej probówki dodać 20 μl proteinazy K i 580 μl wody wolnej od RNaz i inkubować w temperaturze 55 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Odwirować próbki przez 3 minuty przy 10 000 x g i przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Dodaj 0,5 objętości 90% etanolu do każdej probówki i wymieszaj.</li>
			<li>Przenieść 700 μl próbki do kolumny wiążącej RNA umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odwirować przy 8 000 x g przez 15 s.</li>
			<li>Odrzucić przepływ i powtórzyć etap wirowania dla pełnego lizatu.</li>
			<li>Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny, odwirować przy 8 000 x g przez 15 s i odrzucić przepływ.</li>
			<li>Zmieszać 10 μl roztworu podstawowego DNazy i 70 μl buforu RDD. Dodaj roztwór do membrany oczyszczającej RNA i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
			<li>Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny i odwirować przy 8 000 x g przez 15 s. Odrzucić przepływ.</li>
			<li>Dodać 500 μl buforu RPE i odwirować przy 8 000 x g przez 15 s. Wyrzucić przepływ.</li>
			<li>Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny oczyszczającej RNA i odwirować przy 8 000 x g przez 2 minuty.</li>
			<li>Umieść kolumnę w probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody wolnej od RNaz. Wirować przy 8 000 x g przez 1 min.</li>
			<li>Wyizolowany RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu syntezy cDNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synteza cDNA 
		UWAGA: Do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) z informacyjnego RNA (mRNA) użyto komercyjnego zestawu (Tabela materiałów). RNA z bakteriofaga MS2 dodano w celu stabilizacji wyizolowanego RNA podczas syntezy cDNA.
		<ol>
			<li>Rozmrozić i wymieszać odczynniki. Skład pojedynczej reakcji przedstawiono w tabeli 1.</li>
			<li>Dodać 16 μl próbki RNA do objętości dla pojedynczej reakcji (14 μL).</li>
			<li>Przeprowadzić syntezę cDNA w termocyklerze przy użyciu następujących parametrów: 10 min w temperaturze 25 °C (wyżarzanie startera), 60 min w temperaturze 50 °C (synteza DNA), 5 min w temperaturze 85 °C (denaturacja) i 5 min w temperaturze 20 °C (faza chłodzenia).</li>
			<li>Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C do czasu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RT-qPCR 
		UWAGA: Do RT-qPCR próbek bydlęcych zaprojektowano startery i sondy przy użyciu komercyjnego oprogramowania Real-Time qPCR (np. IDT) dla genów GAPDH (dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego), COL2A1 (kolagen typu 2), ACAN (Aggrekan), COL1A1 (kolagen typu 1), MMP-1 (metaloproteinaza macierzy-1) i MMP-13 (metaloproteinaza macierzy-13). Spłonki bydlęce i sondy podwójnie hartowane zostały dostarczone przez IDT. Odczynniki użyte w pojedynczej reakcji do oceny skuteczności i ekspresji genów przedstawiono w tabeli 2.
		<ol>
			<li>Dozować główną mieszaninę pojedynczej reakcji (9 μl) do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR i dodać 1 μl cDNA do każdej reakcji. Wykonać badania dla każdej próbki w trzech egzemplarzach.</li>
			<li>Zamknąć płytkę PCR za pomocą oleju uszczelniającego i odwirować przy 877 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Wykonać RT-qPCR przy użyciu precyzyjnego termocyklera o następującym protokole: 95 °C przez 10 min, 45 cykli amplifikacji (95 °C przez 10 s, wyżarzanie przez 30 s, synteza cDNA) i 37 °C przez 30 s. 
			UWAGA: Dla każdego podkładu wymagane są określone temperatury wyżarzania.</li>
			<li>Użyj GAPDH wraz z genami docelowymi, aby potwierdzić skuteczność.</li>
			<li>Użyj dostarczonego oprogramowania, aby obliczyć wydajność każdego genu.</li>
			<li>Znormalizować wartości progu cyklu (CT) do ekspresji genu referencyjnego GAPDH i użyć metody ΔΔCT do oceny ilościowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+osteochondral+lesions+of+the+talus%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surgery%2C+Sports+Traumatology%2C+Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review.</a> Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).</li>
<li>Aurich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behandlung+osteochondraler+L%C3%A4sionen+des+Sprunggelenks%3A+Empfehlungen+der+Arbeitsgemeinschaft+Klinische+Geweberegeneration+der+DGOU%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fur+Orthopadie+und+Unfallchirurgie%22%5BJournal%5D)">Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU.</a> Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).</li>
<li>Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+metallic+implantation+technique+for+osteochondral+defects+of+the+medial+talar+dome%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthopaedica%22%5BJournal%5D)">Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome.</a> Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).</li>
<li>Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Partial+Humeral+Head+Resurfacing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Partial Humeral Head Resurfacing.</a> The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).</li>
<li>Becher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+5-year+results+of+focal+articular+prosthetic+resurfacing+for+the+treatment+of+full-thickness+articular+cartilage+defects+in+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Orthopaedic+and+Trauma+Surgery%22%5BJournal%5D)">Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee.</a> Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).</li>
<li>Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+Lesion+of+the+Hip+Treated+with+Partial+Femoral+Head+Resurfacing.+Case+Report+and+Six-Year+Follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22HIP+International%22%5BJournal%5D)">Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up.</a> HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).</li>
<li>Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+contoured+articular+prosthetic+device+on+tibiofemoral+peak+contact+pressure%3A+a+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surgery%2C+Sports+Traumatology%2C+Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study.</a> Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).</li>
<li>Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+outcome+of+the+different+HemiCAP+and+UniCAP+knee+implants%3A+A+systematic+and+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedic+Reviews%22%5BJournal%5D)">The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review.</a> Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).</li>
<li>Dhollander, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+prosthetic+inlay+resurfacing+as+a+salvage+procedure+for+a+failed+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surgery%2C+Sports+Traumatology%22%5BJournal%5D)">The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair.</a> Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).</li>
<li>Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+osteochondral+defects+of+the+talus+with+a+metal+resurfacing+inlay+implant+after+failed+previous+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Joint+Journal%22%5BJournal%5D)">Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery.</a> Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).</li>
<li>Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cartilage+degeneration+and+joint+motion+of+bipolar+hemiarthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22International+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty.</a> International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).</li>
<li>Moon, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+Acetabular+Articular+Cartilage+to+Bipolar+Hemiarthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty.</a> Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).</li>
<li>Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+wear+testing+of+living+cartilage+articulating+against+alumina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina.</a> Journal of Orthopaedic Research. , (2016).</li>
<li>Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+geometry+tribological+study+of+osteochondral+graft+implantation+in+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%3A+Journal+of+Engineering+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).</li>
<li>Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+preclinical+natural+porcine+knee+simulation+model+for+the+tribological+assessment+of+osteochondral+grafts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).</li>
<li>Trevino, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+live+cartilage-on-cartilage+interface+for+tribological+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotribology%22%5BJournal%5D)">Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing.</a> Biotribology. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Oungoulian, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wear+and+damage+of+articular+cartilage+with+friction+against+orthopedic+implant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials.</a> Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).</li>
<li>Stotter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Loading+Conditions+on+Articular+Cartilage+in+a+Metal-on-Cartilage+Pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing.</a> Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).</li>
<li>Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tibiofemoral+contact+mechanics+with+a+femoral+resurfacing+prosthesis+and+a+non-functional+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus.</a> Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).</li>
<li>Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+and+bovine+articular+cartilage%3A+a+comparison+of+frequency-dependent+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).</li>
<li>Caligaris, M., Ateshian, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sustained+interstitial+fluid+pressurization+under+migrating+contact+area%2C+and+boundary+lubrication+by+synovial+fluid%2C+on+cartilage+friction%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).</li>
<li>Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Sliding+and+Hydrodynamics+Contribute+to+Articular+Cartilage+Fluid+and+Lubrication+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Tribology+Letters%22%5BJournal%5D)">How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery.</a> Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).</li>
<li>Mamat, N., Nor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+measurement+of+contact+pressure+in+the+tibiofemoral+joint+during+gait%5BTitle%5D)+AND+%22International+Conference+on+Biomedical+Engineering+%28ICoBE%29%22%5BJournal%5D)">Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait.</a> International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).</li>
<li>Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+simulations+of+a+focal+knee+resurfacing+implant+applied+to+localized+cartilage+defects+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model.</a> Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Ogniskowe implanty metalowe stanowią procedurę ratunkową w przypadku wad kostno-chrzęstnych, zwłaszcza u pacjentów w średnim wieku i po nieudanym leczeniu podstawowym. Chociaż badania kliniczne wykazały obiecujące wyniki krótkoterminowe, jednym z zaobserwowanych powikłań jest uszkodzenie przeciwstawnej, rodzimej chrząstki10. Badania zwłok i badania biomechaniczne pokazują wyraźne dowody na to, że prawidłowa implantacja z płaskim lub lekko wklęsłym ustawieniem utrzymuje naturalne naciski kontaktowe...

Leczenie wad kostno-chrzęstnych jest wymagające i w wielu przypadkach wymaga operacji. W przypadku ogniskowych zmian kostno-chrzęstnych u pacjentów w średnim wieku ogniskowe implanty metalowe są realną opcją, zwłaszcza po niepowodzeniu podstawowego leczenia, takiego jak stymulacja szpiku kostnego (BMS) lub autologiczna implantacja chondrocytów (ACI)1. Częściowa wymiana powierzchni może być uważana za procedury ratunkowe, które mogą zmniejszyć ból i poprawić zakres ruchu2. Implanty te są zazwyczaj wykonane ze stopu CoCrMo i są dostępne w różnych rozmiarach i konfiguracjach offsetowych, aby dopasować się do normalnej anatomii3. Chociaż początkowo opracowano je z myślą o wadach przyśrodkowego kłykcia kości udowej w kolanie, takie implanty są obecnie dostępne i stosowane w biodrze, kostce, barku i łokciu4,5,6. Aby uzyskać zadowalający wynik, kluczowa jest ocena mechanicznego ustawienia stawu i stanu przeciwstawnej chrząstki. Ponadto wykazano, że prawidłowa implantacja bez wystającego implantu ma fundamentalne znaczenie7.
Badania kliniczne wykazały doskonałe krótkoterminowe wyniki w zakresie redukcji bólu i poprawy funkcji u pacjentów w średnim wieku w różnych lokalizacjach5,6,8. W porównaniu z implantacją przeszczepu allogenicznego, ogniskowe implanty metalowe umożliwiają wczesne przenoszenie ciężaru. Jednak przeciwległa chrząstka stawowa wykazywała przyspieszone zużycie u znacznej liczby pacjentów9,10. W związku z tym, nawet przy prawidłowym umieszczeniu, w wielu przypadkach zwyrodnienie rodzimej chrząstki wydaje się nieuniknione, podczas gdy mechanizmy leżące u podstaw pozostają niejasne. Podobne zmiany zwyrodnieniowe zaobserwowano po dwubiegunowej hemiartroplastyce stawu biodrowego11 i nasilają się wraz z aktywnością i obciążeniem12.
Eksperymenty trybologiczne dają możliwość badania takich par in vitro i symulowania różnych sytuacji obciążenia występujących w warunkach fizjologicznych13. Zastosowanie szpilek kostno-chrzęstnych oferuje prosty model geometryczny do zbadania trybologii ślizgania się chrząstki stawowej po chrząstce natywnej lub dowolnym materiale implantu14 i może być dalej stosowany w całych modelach symulacyjnych stawów15. Pary metal-chrząstka wykazują przyspieszone zużycie chrząstki, rozerwanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zmniejszoną żywotność komórek w strefie powierzchownej w porównaniu z parowaniem chrząstka-chrząstka16. Uszkodzenie chrząstki występowało głównie w postaci rozwarstwienia między strefą powierzchowną a środkową17. Jednak mechanizmy prowadzące do zwyrodnienia chrząstki nie są do końca poznane. Protokół ten zapewnia kompleksową analizę aktywności biosyntetycznej chrząstki stawowej. Poprzez określenie aktywności metabolicznej i poziomów ekspresji genów katabolicznych można zidentyfikować wczesne oznaki rozpadu chrząstki. Zaletą eksperymentów tribologicznych in vitro jest to, że parametry obciążenia można dostosować tak, aby imitowały różne warunki obciążenia.
Stąd, poniższy protokół jest odpowiedni do symulacji pary metal-chrząstka, reprezentując eksperymentalny model hemiartroplastyki.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma? Aldrich Chemie GmbH</td><td>A-2942-100ML</td><td></td></tr><tr><td>buforowany roztwór formaldehydu 4%</td> Zestaw do proliferacji komórek <td>VWR</td><td>97131000</td><td></td></tr><tr><td>II (XTT)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11465015001</td><td>Test toksykologiczny ex vivo oparty na XTT</td></tr><tr><td>Surowiec CoCrMo</td><td>Acnis International</td><td></td><td>Pręty CoCrMo o średnicy 6 mm</td></tr><tr><td>CryoStar NX70 Cryostat</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td>urządzenie do kriosekcji</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sidma-Aldrich Chemie</td><td>D 2438-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średnia</td><td>Sigma? Aldrich Chemie GmbH</td><td></td><td>średnia</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas hialuronowy</td><td>Anika Therapeutics Inc.</td><td></td><td>składnik roztworu smarującego</td></tr><tr><td>iCycler</td><td>BioRad</td><td></td><td>termocykler</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DM?1000</td> Mikroskop <td>Leica</td><td></td><td>do histologii</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca LightCycler 480</td> Roche <td>Diagnostics Termocykler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td>do PCR</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Zielone Koraliki</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td></td>3358941001</tr><tr><td>System transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego (OATS)</td><td>Arthrex Inc.</td><td></td><td>Rura tnąca do zbioru cylindrów kostno-chrzęstnych</td></tr><tr><td>osteosoft</td><td>Merck</td><td>1017279010</td><td>roztwór odkamieniający</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Sigma? Aldrich Chemie GmbH</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana</td><td>Sigma? Aldrich Chemie GmbH</td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Prescale Niskociśnieniowa</td><td>folia wskazująca ciśnienie</td><td>Fujifilm</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw tkanek włóknistych RNeasy</td><td>QIAGEN</td><td>74404</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2</td><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Tetra? Falex MUST</td><td>Falex Tribology</td><td></td><td>Tribometer</td></tr><tr><td>Tissue? Tek O.C.T.</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>preparat do zatapiania</td></tr><tr><td>Transkryptor Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA Roche</td><td>Diagnostics</td><td>40897030001</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sidma-Aldrich Chemie</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Wady kostno-chrzęstne u pacjentów w średnim wieku mogą być leczone za pomocą ogniskowych implantów metalowych. Implanty, które po raz pierwszy zostały opracowane z myślą o wadach stawu kolanowego, są obecnie dostępne dla barku, biodra, stawu skokowego i pierwszego stawu śródstopia-kości krzyżowej. Zapewniając zmniejszenie bólu i poprawę kliniczną, u wielu pacjentów obserwuje się postępujące zmiany zwyrodnieniowe przeciwstawnej chrząstki. Mechanizmy prowadzące do tego uszkodzenia nie są w pełni poznane. Protokół ten opisuje eksperyment trybologiczny mający na celu symulację parowania metalu na chrząstce i kompleksową analizę chrząstki stawowej. Metalowy materiał implantu jest testowany w porównaniu z bydlęcymi cylindrami kostno-chrzęstnymi jako model ludzkiej chrząstki stawowej. Stosując różne obciążenia i prędkości poślizgu, można naśladować fizjologiczne warunki obciążenia. Aby zapewnić kompleksową analizę wpływu na chrząstkę stawową, w niniejszym protokole opisano histologię, aktywność metaboliczną i analizę ekspresji genów. Główną zaletą badań tribologicznych jest to, że parametry obciążenia można dowolnie dostosowywać w celu symulacji warunków in vivo. Ponadto można zastosować różne rozwiązania testowe w celu zbadania wpływu środków smarnych lub prozapalnych. Za pomocą analizy ekspresji genów specyficznych dla chrząstki i genów katabolicznych można wykryć wczesne zmiany w metabolizmie chondrocytów stawowych w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne.

Obszar kontaktu oraz nacisk kontaktu należy potwierdzić przy użyciu folii pomiarowej do nacisku (Rycina 1). Fizjologiczne warunki obciążenia można potwierdzić poprzez porównanie z odciskami referencyjnymi dla określonych wartości nacisku kontaktu. Podczas testowania stale monitorowany jest współczynnik tarcia. Przy migrującym obszarze kontaktu niski współczynnik tarcia może być utrzymywany przez co najmniej 1 h (Rycina 2). Wykorzystując barwienie Safraniną O, mo...

Ten protokół opisuje przygotowanie, badania biotribologiczne i analizę cylindrów kostno-chrzęstnych ślizgających się po metalowym materiale implantu. Miarami wyników zawartymi w tym protokole są aktywność metaboliczna, ekspresja genów i histologia.

Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Nasz protokół umożliwia przetestowanie ślizgania się metalu do implantów ortopedycznych w stosunku do chrząstki stawowej, a tym samym zbadanie wpływu implantów ogniskowych lub hemiartropplastyki na aktywność biosyntetyczną poszczególnych chondracytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia kompleksowy wgląd zarówno w właściwości trybologiczne, jak i biologiczne skutki obciążenia mechanicznego w parowaniu chrząstek. Technika ta może uzupełniać wyniki kliniczne po zabiegach chirurgicznych, takich jak wszczepienie ogniskowych implantów metalowych w celu leczenia wady kostno-chrzęstnej kolana lub hemiartropplastyki stawu biodrowego. Procedurę zademonstruje Christopher Bauer, doktor habilitowany z mojego laboratorium na Uniwersytecie Dunajskim.Używaj dostępnego na rynku tribometru posuwisto-zwrotnego z konfiguracją cylindra na płycie, możliwością obciążenia pionowego oraz regulowaną prędkością obciążenia i poślizgu. Dodatkowo do wykonania testów w roztworze smarnym wymagana jest płynna cela. Zamocować cylindry kostno-chrzęstne na dolnym uchwycie próbki z oznaczeniem wyrównanym z kierunkiem przesuwania.Zacznij od określenia nacisku kontaktowego w kobaltowo-chromowo-molibdenowym układzie chrząstki za pomocą folii do pomiaru ciśnienia. Umieść folię do pomiaru ciśnienia na granicy faz i przyłóż obciążenie statyczne przez 30 sekund, aby określić początkowy nacisk kontaktowy, rozmiar styku i kształt. Zamontuj butle kobaltowo-chromowo-molibdenowe na górnym ogniwie obciążnikowym.Dodaj roztwór testowy do płynnej komórki, aby zanurzyć cylinder kostno-chrzęstny i zakryć przesuwający się interfejs metalowej chrząstki. Ustaw parametry testowe, takie jak opisane w normalnym skoku siły i prędkości poślizgu, które będą utrzymywane przez cały czas trwania testu. Rozpocznij posuwisto-zwrotne przesuwanie metalowego cylindra po chrząstce stawowej zanurzonej w roztworze smarującym.Monitorowanie współczynnika tarcia przez cały czas trwania eksperymentu, zakończenie eksperymentu. Po upływie pożądanego okresu badania wyjmij czop kostno-chrzęstny z uchwytu na próbkę, przepłucz go PBS i przechowuj w pożywce do czasu dalszej analizy biologicznej. Próbki kontrolne i roztwór testowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas trwania badania i analizować je razem z próbkami, które zostały poddane obciążeniu mechanicznemu.Umieść 24-dołkową płytkę na wadze i wyzeruj ją. Przepłukać czop kostno-chrzęstny PBS i umieścić go na szalce Petriego. Następnie za pomocą skalpela przeciąć chrząstkę z przeszczepu na jeden kawałek, przeciąć chrząstkę na dwie równe części, tak aby obszar styku był równomiernie rozłożony na obu kawałkach chrząstki i zmielić jedną połowę na około milimetrowe kawałki sześcienne.Użyj drugiej połowy do analizy ekspresji genów, przenieś zmieloną chrząstkę do jednego dołka przygotowanej w 24 dołkach płytki i określ masę tkanki, powtórz ten proces dla każdej próbki i dodaj jeden mililitr pożywki wzrostowej do każdego dołka płytki. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu XTT do każdej studzienki i wymieszaj, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny po inkubacji, usuń supernatant i przenieś go do pięciomililitrowej probówki. Wyekstrahować produkt tetrazolowy przez dodanie 500 mikrolitrów DMSO do tkanki chrzęstnej w każdym dołku i stosować ciągłe mieszanie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, usunąć roztwór DMSO i wyciągnąć go z wcześniej zebranym roztworem XTT.Przenieść 100 mikrolitrów każdej próbki w trzech porcjach na płytkę 96-dołkową. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć absorbancję przy długości fali 492 nanometrów i referencyjnej długości fali 690 nanometrów. Aby wyizolować RNA, rozdrobnij drugą połowę tkanki chrzęstnej uzyskanej z czopa kostno-chrzęstnego na małe kawałki, przenieś tkankę do probówki zawierającej kulki ceramiczne i 300 mikrolitrów licencjonowanego buforu.Z 1% beta merkaptoetanolem użyj komercyjnego lizatu do homogenizacji tkanki, stosując 6 500 obr./min przez 20 sekund cztery razy z 20-minutową fazą chłodzenia po każdym przebiegu. Do każdej próbki dodaj 20 mikrolitrów proteinazy K i 580 mikrolitrów wolnej wody RNA i inkubuj je w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut. Odwirować próbki przez trzy minuty w temperaturze 10 000 razy G i przenieść supernatant do probówek o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj 0,5 objętości 90% etanolu do każdej probówki i wymieszaj, a następnie przenieś 700 mikrolitrów próbki do kolumny wiążącej RNA w dwumililitrowej probówce zbiorczej i odwiruj ją przy 8 000 razy G przez 15 sekund. Odrzucić przepływ i powtórzyć etap wirowania dla reszty lizatu. Dodaj 350 mikrolitrów buforu RW do kolumny.Odwirować go w temperaturze 8 000 razy G przez 15 sekund i odrzucić przepływ. Wymieszać 10 mikrolitrów roztworu podstawowego DNA i 70 mikrolitrów buforu RDD. Dodaj roztwór do membrany oczyszczającej RNA i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodaj 350 mikrolitrów buforu RW do kolumny.Odwirować go przy 8 000 razy G przez 15 sekund i odrzucić przepływ, dodać 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny oczyszczającej RNA i odwirować go przy 8 000 razy G przez 15 sekund, odrzucić przepływ i dodać kolejne 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny oczyszczającej RNA, a następnie odwirować go przy 8, 000 razy G przez dwie minuty umieść kolumnę w nowej 1,5 mililitrowej probówce zbiorczej i dodaj 30 mikrolitrów wolnej wody RNA, odwiruj probówkę przy 8 000 razy G przez jedną minutę, aby nawiązać do zsyntetyzowanego RNA cDNA za pomocą komercyjnego zestawu rozmrozić i wymieszać wszystkie regiony, dodać próbkę RNA i przeprowadzić reakcję i termocykler zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Dodaj dziewięć mikrolitrów głównej mieszanki RTQ PCR i jeden mikrolitr cDNA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, przy czym każda próbka w trzech powtórzeniach naświetla płytkę PCR olejem sufitowym i odwiruj ją w temperaturze 877 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, wykonaj RTQ PCR oraz precyzyjny i termiczny cykler. Zgodnie ze wskazówkami rękopisu.Przed badaniem powierzchnię styku i nacisk kontaktowy na granicy faz chrząstki metalowej należy potwierdzić za pomocą folii do pomiaru ciśnienia. Fizjologiczny stan obciążenia można następnie potwierdzić, porównując uzyskany odcisk z wnioskowaniem referencyjnym dla zdefiniowanego kontaktu. Niski współczynnik tarcia może być utrzymany przez co najmniej jedną godzinę przy migrującej powierzchni kontaktu. Skład i strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej można określić za pomocą barwienia szafranem i O.Intensywność barwienia szafranem i O jest proporcjonalna do zawartości proteoglikanów. Zawartość proteoglikanów zmienia się na powierzchni stawowej, ale powinna być jednolita w całym przekroju tkanki w próbkach wyjściowych, wykazywać ekstrakcję glikozaminoglikanów, której można przeciwdziałać poprzez obciążenie mechaniczne. Aktywność metaboliczna chondracytów stawowych bydła jest niezależna od miejsca zbioru, ale wykazuje wzrost wraz z obciążeniem mechanicznym.Poziomy ekspresji genów specyficznych dla chrząstki zwiększały się wraz z fizjologicznymi warunkami obciążenia. Natomiast geny kataboliczne są regulowane w górę za pomocą stacjonarnego obszaru kontaktu. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę, w tym wyznaczenie produktów wstęgi chrzęstnej oraz analizę powierzchni stawowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, a ponadto staramy się zoptymalizować smarowanie chrząstki stawowej w różnych parach tribologicznych.

biotribological-testing-analysis-articular-cartilage-sliding-against

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Przedstawiono ulepszoną metodę mechanicznego testowania zakotwiczenia kości na powierzchniach potencjalnych implantów. Metoda ta pozwala na wyrównanie siły rozrywającej dokładnie prostopadle lub równolegle do płaszczyzny powierzchni implantu i zapewnia dokładny sposób kierowania sił zakłócających na dokładny obszar wokół implantu.

Ulepszona metoda badań mechanicznych do oceny zakotwiczenia implantu kostnego

Biomechanika tkanek jest ważna dla utrzymania kształtu i funkcji komórki oraz dla określenia fenotypu. W niniejszym raporcie przedstawiono nieniszczące protokoły mechaniczne do charakteryzowania elastycznych i lepkosprężystych właściwości ludzkich tkanek miękkich, które można bezpośrednio zastosować do podłoży inżynierii tkankowej, aby umożliwić ścisłe dopasowanie materiałów inżynieryjnych do tkanek natywnych.

Charakterystyka biomechaniczna tkanek miękkich człowieka za pomocą prób wgnieceń i rozciągania

Opisujemy ustandaryzowaną metodę oceny artefaktów obrazowania rezonansu magnetycznego spowodowanych przez implanty, aby oszacować przydatność implantów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i/lub podatność różnych sekwencji impulsów na artefakty metaliczne jednocześnie.

Protokół oceny artefaktów MRI spowodowanych przez implanty metalowe w celu oceny przydatności implantów i wrażliwości sekwencji impulsów

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru szybkości trybokorozji i synergii zużycia i korozji cienkich warstw i luzem stopów Al w symulowanej wodzie morskiej w temperaturze pokojowej.

Określanie szybkości trybokorozji i synergii zużycie-korozji masowych i cienkowarstwowych stopów aluminium

Sondowanie podczas operacji artroskopii jest zwykle wykonywane w celu oceny stanu tkanek miękkich, ale to podejście zawsze było subiektywne i jakościowe. W niniejszym raporcie opisano urządzenie pomiarowe, które może mierzyć ilościowo opór tkanek miękkich za pomocą trójosiowego czujnika siły podczas artroskopii.

Urządzenie pomiarowe do ilościowego pomiaru właściwości mechanicznych tkanek miękkich podczas artroskopii

Obecny protokół opisuje urządzenie do testowania tarcia, które stosuje jednocześnie wzajemne przesuwanie i normalne obciążenie do dwóch stykających się biologicznych powierzchni stykających się.

Urządzenie do testowania tarcia - bioreaktor do badania biomechaniki stawów maziowych, mechanobiologii i regulacji fizycznej

Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.

Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej

Opisujemy nową technikę wektorowego obrazowania dopplerowskiego tkanek opartą na ultradźwiękach do pomiaru prędkości skurczu mięśni, napięcia i szybkości odkształcania z submilisekundową rozdzielczością czasową podczas dynamicznych aktywności. Podejście to zapewnia uzupełniające pomiary dynamicznej funkcji mięśni i może prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń układu mięśniowo-szkieletowego.

Nowe zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego układu mięśniowo-szkieletowego

Tutaj opisujemy techniki histologiczne wizualizacji tkanki oka bezpośrednio przylegającej do metalowej protezy nasiatkówkowej i siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej: Część 2 Implanty nasiatkówkowe z pinezkami siatkówkowymi

Poznaj metodę badania biotribologicznego chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty ortopedyczne. Technika ta ocenia aktywność metaboliczną chondrocytów i właściwości tribologiczne pod obciążeniem mechanicznym.

Badania biotribologiczne i analiza chrząstki stawowej ślizgającej się po metalu pod implanty

Przeglądaj więcej filmów