Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Automatyzacja mikroskopu sił atomowych jest kluczową innowacją w ewolucji technologii w kierunku zastosowań biomedycznych. Otwiera również dostęp do badań nad właściwościami biomechanicznymi populacji komórek. Nasza metoda umożliwia rejestrację pomiarów AFM dla 1 000 komórek w ciągu czterech godzin, w porównaniu ze zwykłymi metodami, które zajmują cztery godziny na pomiar 10 komórek, jest to naprawdę znaczny zysk czasu.

Jeśli automatyzacja jest warunkiem wstępnym wprowadzenia tej technologii do laboratoriów szpitalnych, ten protokół weryfikacji koncepcji sugeruje jej potencjał do wykorzystania w opracowywaniu konkretnych medycznych strategii diagnostycznych. Protokół ten wykorzystuje wszechstronny trzpień PDMS, który może być wypełniony różnymi drobnoustrojami, co pozwala na badanie różnych systemów. Aby przygotować stempel PDMS, wymieszaj 55 gramów roztworu prepolimeru PDMS w stosunku masowym 10 do jednego w PDM, oligomerach i utwardzaczu, a następnie odgazuj otrzymany roztwór w próżni raz razy 10 do ujemnego jeden do jednego razy 10 do ujemnych dwóch prętów przez pięć do 10 minut.

Gdy wszystkie pęcherzyki pułapek zostaną usunięte, wlej 20 gramów odgazowanego roztworu na silikonową formę wzorcową do grubości dwóch do trzech milimetrów i ponownie odgazuj. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy siatkować PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę i za pomocą skalpela przeciąć stempel mikrostrukturalny PDMS równolegle do widocznych układów mikrostruktury. Następnie oderwij stempel od silikonowej formy głównej i umieść miejsce mikrostruktury stempla na szklanym szkiełku tak, aby mikrostruktury były wyrównane z bokiem szkiełka.

Aby przygotować komórki do urządzenia, należy odwirować 600 mikrolitrów zawiesiny komórek będących przedmiotem zainteresowania i dodać 200 mikrolitrów supernatantu do stempla. Odgazowywać supernatant w próżni przez około 40 minut. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy zastąpić supernatant z powierzchni PDMS 200 mikrolitrami zawieszonego roztworu komórkowego na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Aby załadować komórki do mikrostruktur stempla, użyj szklanego szkiełka przytrzymanego pod kątem od 30 do 50 stopni, aby rozłożyć komórki na stemplu w obu kierunkach, kilka razy w razie potrzeby. Po osiągnięciu wysokiego stopnia napełnienia mikrostruktur należy użyć pipety do usunięcia zawiesiny komórek i przepłukać ją trzykrotnie jednym mililitrem buforu octanowego na przemycie, aby usunąć wszelkie nieuwięzione komórki. Po ostatnim płukaniu należy użyć przepływu azotu, aby wysuszyć tylną część próbki i umieścić stempel na szalce Petriego.

Następnie dodaj do naczynia dwa mililitry świeżego buforu octanowego. W przypadku mikroskopii sił atomowych komórek, umieść szalkę na stoliku mikroskopu sił atomowych i wyśrodkuj stolik od zera do zera. Gdy stolik zostanie wyśrodkowany, przenieś szalkę do uchwytu szalki Petriego pod mikroskopem i wyrównaj krawędź stempla tak, aby była prostopadła do osi y uchwytu szalki Petriego.

Następnie umieść głowicę mikroskopu atomowego na stoliku, uważając, aby silniki krokowe były wystarczająco wysunięte, aby uniknąć uderzenia końcówki o stempel. Do obrazowania użyj pokręteł mikroskopu, aby wyśrodkować końcówkę mikroskopu sił atomowych nad lewym rogiem dołków mikrometrowych o wymiarach 4.5 na 4.5 kwadratów i wybierz tryb mapowania sił w oprogramowaniu mikroskopu. Aby ustawić mapę sił 64 na 64 na obszarze 100 na 100 mikrometrów, ustaw względną wartość zadaną na trzy do pięciu nanoniutonów, długość Z na cztery mikrometry, ruch Z na stały czas trwania, czas wydłużenia na 0,01 sekundy, opóźnienie wysuwu na zero, opóźnienie wycofania na zero, tryb opóźnienia na stałą siłę, częstotliwość próbkowania do 2048 Hz.

Odznacz zamkniętą pętlę Z i zaznacz kwadratowy obraz. Ustaw szybki dostęp na 100 mikrometrów, wolną oś na 100 mikrometrów, przesunięcie X na zero mikrometrów, przesunięcie Y na zero mikrometrów, kąt siatki na zero stopni, piksele na 64 na 64, a stosunek pikseli na jeden do jednego. Następnie otwórz oprogramowanie do automatyzacji.

W oknie podręcznym wybierz ścieżkę do pliku skryptu. Wprowadź współrzędną W1 w wierszu 239 zmiennej P1 w sekcji pola wejściowego skryptu gyfon oraz wartość współrzędnej W2 w wierszu zmiennej P2 241. Przypisz wartość skoku do linii zmiennej skoku 245 skryptu i wprowadź wymiar studni, który można określić na podstawie projektu wzorów studni, do linii zmiennej W-S 248.

Wpisz ścieżkę do katalogu zapisu w wierszu 251, aby zapisać dane w żądanym miejscu i ustaw zmienną całkowitej powierzchni linii 254 na żądanie wielokrotnego końca 100 mikrometrów. Następnie ustaw krzywe siły, macierz, wiersz i kolumnę zapisaną na studnię w linii zmiennej liczby skanów 257 i kliknij uruchom, aby uruchomić program. Aby przeanalizować dane, użyj oprogramowania do kodu studia wideo, aby otworzyć skrypt Pythona i wykonać skrypt Pythona kopii plików, aby uporządkować pliki krzywej siły w jednym folderze.

Wprowadź ścieżkę do folderu ogólnego, w którym będą przechowywane dane. Aby przeanalizować krzywe sił, otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych producenta mikroskopu sił atomowych. W menu plik wybierz partię krzywych spektroskopowych.

Następnie wybierz plik i proces ładowania, a następnie wybierz proces sztywności. Wybierz ostatni krok procesu i kliknij przycisk zachowaj i zastosuj do wszystkich, aby wszystkie krzywe siły były traktowane w ten sam sposób. Aby otworzyć skrypt języka R, załaduj pliki zawierające informacje wyodrębnione za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych do oprogramowania R studio.

W oknie środowiska kliknij pozycję importuj zestaw danych, a następnie z czytnika tekstu w oknie podręcznym kliknij przycisk Przeglądaj, aby zlokalizować plik TSV z kropką. Po załadowaniu pliku wybierz region uruchamiania kodu i uruchom wszystko, aby uruchomić cały kod. W tym miejscu przedstawiono typowe histogramy uzyskane przy użyciu protokołu, jak pokazano.

W tej analizie repartycję sztywności zarejestrowano na 957 komórkach natywnych, podczas gdy w tej analizie zmierzono sztywność 574 komórek traktowanych kaspofunginą. Wiedz, że użycie setek komórek pozwala na dwumodalny rozkład obserwowanych wartości. W mniejszych próbach zwykle obserwuje się pojedynczy rozkład, który może skutkować brakiem obserwacji niejednorodności populacji.

Porównanie tych dwóch warunków podkreśla wpływ kaspofunginy na zmniejszenie sztywności komórek. Porównanie komórek natywnych i leczonych metodą ANOVA wykazało, że te dwa stany wykazują bardzo, znacząco różną sztywność. Wartość ta została osiągnięta ze względu na dużą liczbę analizowanych komórek, zapewniającą większą pewność co do uzyskanych wyników.

Dodanie supernatantu do stempla PDMS przed wielokrotnym płukaniem komórek do studzienek, aż stempel będzie pełny, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analizy. W tym dowodzie słuszności koncepcji przeanalizowano komórki Candida albicans, ale protokół można zastosować do dowolnej grupy komórek wzorcowych, cząsteczek lub materiałów.