Name: Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj automatyzację mikroskopii sił atomowych dla badania właściwości biomechanicznych komórek C. albicans. Ta metoda umożliwia pomiar 1000 komórek w cztery godziny, znacznie przyspieszając diagnostykę mikrobiologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować FONCYCYT z CONACYT (Meksyk), ministerstwu spraw zagranicznych Francji i Université Paris 13, poprzez wsparcie finansowe międzynarodowego projektu ECOS-NORD o nazwie Nano-palpation for diagnosis, No. 263337 (Meksyk) i MI5P02 (Francja). AMR dziękuje za wsparcie finansowe SIP-IPN w ramach projektu nr 20195489. SPC jest wspierany przez stypendium doktoranckie CONACYT (nr 288029) oraz IPN na podstawie umowy cotutelle o uzyskanie podwójnego dyplomu doktora (IPN-UPS). ED i CFD są naukowcami w Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Hodowla komórek drobnoustrojów
<ol>
	<li>Ożyw komórki z zapasu glicerolu. 
	UWAGA: C. albicans są przechowywane w temperaturze -80 °C w zapasach glicerolu, na marmurach.
	<ol>
		<li>Wybierz kulkę z bulionu o temperaturze -80 °C i wetrzyj ją w agar z dekstrozą peptonową (YPD) drożdżową. Hodować komórki przez 2 dni w temperaturze 30 °C, przed hodowlą płynną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płynne kultury.
	<ol>
		<li>Napełnij probówkę hodowlaną 5 ml sterylnego bulionu YPD i dodaj pojedynczą kolonię komórek C. albicans, wyhodowanych na płytce agarowej YPD.</li>
		<li>Hodować kulturę w warunkach statycznych w temperaturze 30 °C przez 20 godzin przed zbiorem przez odwirowanie (4000 x g, 5 min). Usunąć sklarowany osad i wyeliminować go jako odpad stanowiący zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Przemyć granulki 2x 10 ml buforu octanowego (8 mM octanu sodu, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5,2). Odwirować (4000 x g, 5 min) pomiędzy płukaniami.</li>
		<li>Zawiesić osad w 2 ml buforu octanowego i użyć tego roztworu do immobilizacji komórek na stemplu PDMS. 
		UWAGA: Zawiesina ta nie może być przechowywana i powinna być przygotowana w stanie świeżym zgodnie z punktem 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie pieczęci PDMS
<ol>
	<li>Przygotowanie formy silikonowej
	<ol>
		<li>Narysuj żądane mikrostruktury za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). 
		UWAGA: Zaprojektowane studnie powinny mieć podobną wielkość do mikrobów do pułapki. Projekt powinien przewidywać dużą matrycę studni 100 x 100 na liście. Najlepiej jest wykonać kilka tablic o nieco różnych rozmiarach wokół średniej wielkości drobnoustroju.</li>
		<li>Jeśli pomieszczenie czyste jest dostępne, wykonaj kroki od 2 do 12 z wcześniej opublikowanego protocol12. W przeciwnym razie silikonową formę wzorcową można nabyć z komercyjnych pomieszczeń czystych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formowanie stempla PDMS
	<ol>
		<li>Przygotować 55 g roztworu prepolimeru PDMS zawierającego mieszaninę oligomerów PDMS i utwardzacza w stosunku masowym 10 do 1 (tabela materiałów).</li>
		<li>Wymieszaj i odgazuj ten roztwór w próżni (w zakresie 10-1-10-2 barów), aż wszystkie uwięzione pęcherzyki zostaną usunięte z roztworu PDMS (5-10 min).</li>
		<li>Wlać 20 g odgazowanego roztworu na formę silikonową i ponownie odgazować (w zakresie 10-1-10-2 barów). 
		UWAGA: Grubość stempla powinna wynosić około 2−3 mm.</li>
		<li>Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy siatkować PDMS w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wytnij stempel mikrostrukturalny PDMS skalpelem (0,5 x 1,5 cm2) w kierunku równoległym do widocznych układów mikrostruktury.</li>
		<li>Oderwij stempel od silikonowej formy wzorcowej.</li>
		<li>Zwróć stempel, aby pokazać mikrostruktury na jego górnej stronie i umieść go na szkiełku podstawowym. Upewnij się, że mikrostruktury są skierowane do góry, z dala od szkiełka. Wyrównaj mikrostruktury widoczne na stemplu z bokiem szkiełka podstawowego, które później posłuży jako odniesienie dla procedury automatyzacji AFM. 
		UWAGA: Na tym etapie stempel PDMS jest gotowy do unieruchomienia komórki. Stemple PDMS mogą być przechowywane na silikonowej formie wzorcowej przez kilka miesięcy. Gdy cały PDMS zostanie usunięty z formy wzorcowej, nowy stempel PDMS może zostać ponownie odlany na formę wzorcową (aby zapewnić bezpieczeństwo formy wzorcowej, można ją powielić w poliuretanie)14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Unieruchomienie komórek
	<ol>
		<li>Odwirować (500 x g, 5 min) 600 μl zawieszonego roztworu komórkowego w celu oddzielenia buforu od komórek.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl supernatantu z kroku 3.1.1 na stempel PDMS i odgazować pod próżnią (w zakresie 10-1-10-2 barów) przez około 40 minut. 
		UWAGA: Ten krok jest ważny, aby poprawić unieruchomienie komórek wewnątrz studzienek. Cząsteczki ze ściany komórkowej drożdży, obecne w supernatancie, są prawdopodobnie osadzane na powierzchni PDMS podczas tego etapu wstępnego zwilżania. Cząsteczki te najprawdopodobniej zwiększają adhezję komórek i przyczyniają się do wzrostu szybkości wypełniania stempla.</li>
		<li>Po 40 minutach za pomocą pipety usunąć bufor z powierzchni PDMS i nałożyć pipetą 200 μl roztworu komórkowego z kroku 1.2.4 na 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść komórki w mikrostrukturach stempla przez montaż konwekcyjny/kapilarny. W tym celu należy ręcznie rozprowadzić 200 μl zawiesiny komórek na stemplu za pomocą szkiełka w obu kierunkach pod kątem od 30 do 50°. Może być konieczne kilkakrotne przełożenie szkiełka na stemplu, aby uzyskać wysoki współczynnik napełniania. 
		UWAGA: Pełny opis tej metody jest dostępny13.</li>
		<li>Usunąć zawiesinę komórek za pomocą pipety. Umyj stempel 3x 1 ml buforu octanowego o pH 5,2, aby usunąć komórki, które nie zostały uwięzione.</li>
		<li>Wysuszyć tylną część stempla za pomocą przepływu azotu, aby upewnić się, że stempel przylega do suchej szalki Petriego.</li>
		<li>Na koniec umieścić stempel PDMS wypełniony komórkami na szalce Petriego (Tabela Materiałów) i napełnić go 2 ml buforu octanowego w celu utrzymania komórek w płynnym podłożu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie stempla na stoliku AFM
	<ol>
		<li>Wyśrodkuj scenę przy 0:0 podczas rozpoczynania operacji AFM.</li>
		<li>Skalibruj czułość i stałą sprężystości wspornika na szkle i w wodzie, jak opisano w Unsay et al.15</li>
		<li>Weź szalkę Petriego ze stemplem i umieść ją w uchwycie szalki Petriego AFM.</li>
		<li>Wyrównaj krawędź stempla prostopadle do osi Y uchwytu szalki Petriego. 
		UWAGA: Dopuszczalny kąt nachylenia wynosi poniżej 5°, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.</li>
		<li>Umieść głowicę AFM na stage i uważaj, aby silniki krokowe były wystarczająco wysunięte, aby uniknąć rozbicia końcówki o stempel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Uruchamianie programu AFM
UWAGA: Program AFM jest dostarczany jako Materiał Uzupełniający (AutomatipSoftware2019.pdf). Wymaga JPK-Bruker AFM Nanowizard II lub III wyposażonego w zmotoryzowany stolik i oprogramowanie komputerowe JPK w wersji 4.3. Program został opracowany pod Jython (wersja oparta na pythonie 2.7)
<ol>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Wyśrodkuj końcówkę AFM w lewym rogu dołków 4.5 x 4.5 μm2 (odpowiadających rozmiarowi komórki) za pomocą mikroskopu optycznego AFM. Jeśli potrzebny jest inny rozmiar studzienki, wyśrodkuj w lewym górnym rogu żądanych studzienek.</li>
		<li>Wykonaj mapę sił 64 x 64 (zakres Z = 4 μm, prędkość końcówki = 90 μm·s-1, przyłożona siła 3 do 5 nN) na obszarze 100 x 100 μm². Wybierz tryb mapowania siły z listy rozwijanej Tryb pomiaru. W panelu mapowania sterowania siłą wprowadź następujące parametry: Rel. Wartość zadana = 3 do 5 nN; Długość z 4 μm; Ruch Z: stały czas trwania; wydłużenie czasu: 0,01 s; opóźnienie zewnętrzne:0; Opóźnienie wycofania: 0, Tryb opóźnienia: Stała siła, Częstotliwość próbkowania 2048 Hz; Z odznacz zamkniętą pętlę; Siatka: sprawdź Kwadratowy obraz, Szybki 100 μm, Wolny: 100 μm, Przesunięcie X: 0 μm; Przesunięcie Y: 0 μm; kąt siatki: 0 stopni; Piksele: 64x64; Proporcje pikseli: 1:1 
		UWAGA: Typowy wynik jest pokazany w Rysunek 2. Ten obraz pomoże zmierzyć i zweryfikować skok między dwiema studniami.</li>
		<li>Zwróć uwagę na współrzędne środka lewego górnego dołka (W1) i lewego dolnego dołka (określanego jako W2 na Rysunek 2). Aby to zrobić, zrób kwadratowe pudełko wokół studni. Współrzędna środka pola pojawia się w lewym panelu oprogramowania AFM w polach współrzędnych x,y.</li>
		<li>Aby otworzyć oprogramowanie do automatyzacji (Automatip_scan.py): w programie komputerowym JPK kliknij na Zaawansowane w menu na górnym pasku i wybierz Otwórz skrypt. W oknie, które zostanie otwarte, wybierz ścieżkę do pliku skryptu podanego w sekcji Dane uzupełniające (Automatip_scan.py).</li>
		<li>Zaimplementuj wartości współrzędnych W1 i W2 w sekcji Inputs (Wejścia) skryptu Jython (Rysunek 3). Wprowadź współrzędne W1 w wierszu zmiennej P1 239 skryptu, a współrzędne W2 w wierszu zmiennej P2 241. 
		UWAGA: Studzienki wybrane jako współrzędne początkowe (W1 i W2) nie powinny znajdować się zbyt blisko krawędzi obszaru skanowania. W przeciwnym razie algorytm centrowania nie zostanie wykonany poprawnie, ponieważ musi zmierzyć wysokość na powierzchni PDMS po każdej stronie studni. Aby zapoznać się z przykładem, zobacz Rysunek 4.</li>
		<li>Przypisz wartość wysokości dźwięku do wiersza 245 zmiennej wysokości dźwięku w skrypcie.</li>
		<li>Wprowadź wymiar studni w wierszu zmiennej Ws 248. Jest to znane z projektu wzorów studni i można je sprawdzić na tym samym obrazie, który został użyty do weryfikacji wysokości dźwięku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
		<li>Wpisz ścieżkę do katalogu zapisu w wierszu 251, aby zapisać dane w żądanym miejscu.</li>
		<li>Ustaw zmienną totalArea w wierszu 254 na żądaną wielokrotność "n" równą 100 μm (jest to maksymalny obszar skanowania używanego AFM). Całkowitą liczbę studzienek, które zostaną zbadane, można obliczyć przy użyciu tej wartości i skoku: maksymalny obszar skanowania/skok*n2, 
		UWAGA: W przykładzie Rysunek 3, analizowanych będzie 9 obszarów o wymiarach 100 x 100μm2.</li>
		<li>Ustawić macierz, wiersz i kolumnę krzywych siły (3, 3 lub 4, 4), rejestrowane dla każdego dołka w wierszu zmiennej numScans 257. 
		UWAGA: W przykładzie na rysunku 3 dla każdej studzienki zostanie zarejestrowana matryca 3 x 3 = 9 FC.</li>
		<li>Uruchom program. Kliknij przycisk Start. 
		UWAGA: Program najpierw automatycznie wykonuje algorytm centrowania, aby lepiej określić środek studni W1 i W2 (krok 1). Następnie automatycznie pobiera matrycę krzywych siły (FCs) na każdym dołku pierwszego obszaru skanowania (krok 2). Gdy wszystkie studzienki w tym obszarze zostaną zbadane, skrypt automatycznie przesuwa końcówkę AFM do pierwszego dołka następnego obszaru skanowania. Końcówka jest chowana, stolik mikroskopu przesuwa się do następnego obszaru, końcówka jest ponownie zbliżana do stempla i algorytm centrowania jest ponownie wykonywany, aby automatycznie ponownie wyśrodkować się na pierwszym dołku (1') tego obszaru (krok 3). Pierwszy obszar jest definiowany przez użytkownika, drugi znajduje się po prawej stronie itd., aż do osiągnięcia n. Obszar n+1 znajduje się pod n, n+2 na lewo od n+1 itd., aż do osiągnięcia 2n. 2n+1 znajduje się pod 2n, a 2n+2 jest po prawej stronie na 2n itd. Globalnie końcówka wije się serpentynami przez całą powierzchnię. Kroki 2 i 3 są powtarzane automatycznie, aż do zmierzenia całkowitej liczby "n2" skanowanych obszarów. Rysunek 5 przedstawia schemat blokowy programu. Ukończenie programu zajmuje ~4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Wykonaj skrypt Pythona "Kopiuj pliki" (Copy_files_L.py, podany w danych uzupełniających), aby uporządkować pliki FC w jednym folderze. Ten skrypt został opracowany przy użyciu Pythona 2.7 i modułu SciPy. Użyj oprogramowania Visual Studio Code, aby otworzyć skrypt języka Python. Wprowadź ścieżkę do folderu general (wiersz 67 skryptu podany w danych uzupełniających) i miejsca, w którym będzie on przechowywany (wiersz 73).</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych producenta AFM, aby przeanalizować krzywe siły. W górnym menu Plik wybierz otwartą partię krzywych spektroskopowych.</li>
		<li>W oknie przetwarzania wsadowego wybierz proces podany w Dane uzupełniające (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Wybierz ostatni krok procesu i kliknij Zachowaj i Zastosuj do wszystkich. Wszystkie krzywe siły będą traktowane w ten sam sposób. 
		UWAGA: Proces wykorzystuje kalibrację z plików FCs do przekształcenia krzywych ugięcia na krzywe siły skalibrowane w niutonach; stosowany jest algorytm wygładzania danych (średnia z 3 kolejnych punktów); linia bazowa jest przekształcana tak, aby spoczywała na osi zerowej; punkt kontaktowy ekstrapoluje się, a punkt kontaktowy przesuwa się w celu umieszczenia punktu kontaktowego na współrzędnych (0,0); zginanie wspornika jest odejmowane do FCs, dopasowane jest nachylenie cofania. Na końcu przetwarzania danych oprogramowanie generuje plik, który zawiera tabelę podającą dla każdego FC: jego nazwę, moduł Younga, punkt kontaktu, siłę przyczepności, nachylenia itp.</li>
		<li>Powtórz kroki od 4.2.1 do 4.2.3 dla wszystkich eksperymentów. Zachowaj ostrożność, aby zapisać dane w różnych folderach (np.: "...\TREATED\" i "...\UNTREATED\")</li>
		<li>Użyj skryptu języka R dostępnego w danych uzupełniających, aby wykreślić histogramy i wykresy pudełkowe oraz wykonać zabiegi statystyczne ANOVA.
		<ol>
			<li>Aby otworzyć skrypt języka R (DataAnalisys.R), użyj oprogramowania R studio i załaduj pliki zawierające informacje wyodrębnione za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych (tsv).</li>
			<li>W oknie środowiska użyj przycisku Importuj zestaw danych, z wyświetlonej listy wybierz z tekstu (readr) i w nowym oknie wybierz przycisk Przeglądarka i znajdź plik tsv.</li>
			<li>Po załadowaniu pliku wybierz kolumny (sztywność i przyczepność), które mają zostać uwzględnione w analizie. Aby uruchomić cały kod, naciśnij Ctrl+Alt+R. 
			UWAGA: Skrypt działa z 4 zestawami danych, rozważ dwa eksperymenty, zarówno z komórkami nieleczonymi, jak i leczonymi. Możliwe jest wykonanie bloków skryptu i zobaczenie, jak zmienne zmieniają się w zależności od wykonywanych funkcji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li>
<li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Electroporation%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li>
<li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li>
<li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology%3A+From+microbiology+to+cancerology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li>
<li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li>
<li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li>
<li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li>
<li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853(2019).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li>
<li>Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM%3A+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Horizons%22%5BJournal%5D)">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li>
<li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li>
<li>Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867(2015).</li>
<li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species%2C+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li>
<li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li>
<li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Główną poprawą zapewnioną przez tę metodologię jest znaczny wzrost liczby mierzonych komórek w określonym czasie. Odpowiednikiem jest zmniejszenie liczby punktów mierzonych na komórkę. Oznacza to, że ta metoda nie jest przeznaczona do zapewnienia szczegółowej analizy pojedynczej komórki. Metoda ma zastosowanie tylko do komórek, które mogą zmieścić się w studzienkach stempla PDMS. Stempel jest dość wszechstronny, a jednocześnie zawiera studzienki o wymiarach od 1,5 x 1,5 μm2 do 6 x 6 μm2. Nadal nie j...

Ta praca dostarcza metodologii do wykonywania automatycznych pomiarów siły na setkach żywych komórek za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Zapewnia również metodę unieruchamiania drobnoustrojów na mikrostrukturalnym stemplu PDMS, która jest kompatybilna z eksperymentami AFM prowadzonymi w środowisku płynnym.
Bio-AFM to wysoce wyspecjalizowana technologia opracowana do zastosowań w biologii, a następnie używana do badania żywych komórek. Wymaga to wyszkolonego inżyniera, który może analizować jedną komórkę na raz. W tych warunkach liczba różnych komórek, które można przeanalizować, jest raczej niewielka, typowo od 5 do 10 komórek w ciągu 4-5 godzin. Jednak ilość pomiarów siły rejestrowanych na pojedynczej komórce jest zwykle bardzo duża i może z łatwością osiągnąć 1000. Tak więc obecny paradygmat pomiarów siły AFM na żywych komórkach polega na rejestrowaniu setek krzywych sił (FC), ale na ograniczonej liczbie komórek.
Statystycznie rzecz biorąc, takie podejście jest wątpliwe i podnosi kwestię reprezentatywności próby. Rzeczywiście, trudno jest na przykład ocenić niejednorodność populacji komórek, mierząc tylko kilka komórek, nawet jeśli na tych kilku komórkach zarejestrowano setki pomiarów. Jednak to właśnie w oparciu o ten paradygmat poczyniono znaczne postępy w biofizyce, mikrobiologii i nanomedycynie1,2,3. Rzeczywiście, analiza nanometryczna w skali pojedynczych komórek dostarczyła nowych informacji na temat nanomechaniki komórkowej, organizacji białek transbłonowych lub mechanizmu działania leków przeciwbakteryjnych lub przeciwnowotworowych4,5,6,7. Ostatnio jednak pojawiło się kilka wysokoprzepustowych testów biomechanicznych przeprowadzonych na komórkach8, co świadczy o zainteresowaniu społeczności naukowej zmianą tego paradygmatu i uzyskaniem dostępu do heterogeniczności populacji komórek. Wszystkie te testy opierają się na układach mikroprzepływowych do deformacji komórek i optycznego pomiaru ich deformacji pod wpływem naprężeń, aby uzyskać pośrednią miarę ich ogólnej elastyczności powierzchni8. Jednak ważną kwestią związaną z tymi metodami jest to, że są one monoparametryczne: można badać tylko elastyczność komórek. Co więcej, nie pozwalają one na pomiar parametrów mechanicznych przylegających komórek, co może być ograniczające dla badań na przykład niekrążących komórek ssaków lub biofilmów.
Podejścia wykorzystujące AFM zostały opracowane przez zespoły S. Scheuring9 i M. Favre10. Scheuring i wsp. unieruchomili komórki na wzorcach fibronektyny9, zmuszając poszczególne komórki do przyjęcia kształtu wzorca9. Następnie zespół zmapował właściwości mechaniczne kilku komórek, aby zdefiniować średnie dane, reprezentatywne dla 14 do 18 komórek. Prace rozwojowe przeprowadzone przez Farve i wsp. miały na celu multipleksowanie pomiarów poprzez równoległość wsporników AFM10. O ile nam wiadomo, te prace w kierunku multipleksowania nie doprowadziły do pomiarów na żywych komórkach.
Interesujące podejście zaproponowane przez zespół Dujardina przedstawia zautomatyzowany AFM zdolny do identyfikacji komórek i obrazowania ich na dnie specjalnie wykonanych studni. Chociaż metoda ta nie pozwala na analizę dużej populacji komórek, pozwala na automatyczne testowanie różnych warunków w każdej studni11.
Nasz cel w tej pracy jest bardziej ambitny, ponieważ chcieliśmy zmierzyć co najmniej 1000 komórek, aby uzyskać dostęp nie do przeciętnej komórki, ale wręcz przeciwnie, do niejednorodności między komórkami. Opracowana przez nas strategia dostępu do niejednorodności populacji komórek za pomocą AFM opiera się na analizie setek komórek, na których zarejestrowana jest ograniczona liczba krzywych sił. W porównaniu z "klasycznym" podejściem polegającym na rejestrowaniu dużej liczby krzywych siły na ograniczonej liczbie komórek, podejście to należy uznać za uzupełniające, ponieważ nie dostarcza tych samych informacji. Rzeczywiście, podczas gdy typowa metoda pozwala na badanie niejednorodności powierzchni poszczególnych komórek, przy użyciu naszego podejścia jesteśmy w stanie uzyskać dostęp do niejednorodności całej populacji komórek. Aby osiągnąć ten cel, połączyliśmy metodę, która bezpośrednio unieruchamia drobnoustroje (w tym przypadku gatunek drożdży Candida albicans) do studzienek mikrostrukturalnego PDMS stamp12 i opracowujemy oryginalny program do automatycznego przesuwania końcówki AFM z komórki do komórki13 i pomiaru właściwości mechanicznych każdej komórki.

<table><tbody><tr><td>Wspornik AFM</td><td>Sondy AFM Bruker MLCT</td><td></td><td>Zastosowane wsporniki były oznaczone " C&rdquo; o częstotliwości rezonansowej od 7 do 10 kHz i k: 0,01 N/m</td></tr><tr><td>Analiza danych AFM</td><td>JPK-Bruker</td><td>JPK Wersja przetwarzania danych minimum 5.1.8</td><td>Można pobrać z konta użytkownika JPK-Bruker</td></tr><tr><td>AFM szalki Petriego</td><td>WPI</td><td>FluoroDish FD35-100</td><td>Grzałka służyła do monitorowania zmian temperatury podczas eksperymentu</td></tr><tr><td>Mikroskop sił atomowych (AFM)</td><td>JPK-Bruker</td><td>Nanowizard II lub III</td><td>AFM powinien być zamontowany na odwróconym mikroskopie optycznym z zmotoryzowanym stolikiem</td></tr><tr><td>Kaspofungina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425-5MG</td><td>Zastosowano kaspofunginę o stężeniu 4 MIC (minimalne stężenie inhibitora)</td></tr><tr><td>Edytor kodu</td><td>Microsoft</td><td>Visual Studio Code wersja 1.40.1</td><td>https://code.visualstudio.com/</td></tr> <tr><td>Cryobeads</td><td>IFU</td><td>CB12</td><td></td></tr><tr><td>Desykator / Odgazowywanie komora</td><td>Fisherbrand</td><td>15594635</td><td>Sprzęt służy do odgazowywania stempli PDMS przez około 50 minut, wystarczy każdy eksykator sprzężony z pompą próżniową.</td></tr><tr><td>Podgrzewacz do szalek Petriego</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>Jest to dodatek do JPK/Bruker AFM. Grzałka służyła do monitorowania zmian temperatury podczas eksperymentu</td></tr><tr><td>Bufor octanu sodu pH 5,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>Roztwór zawiera 18 mM octanu sodu, 1 mM CaCl2 i 1 mM MnCl2. Dostosuj pH za pomocą lodowatego kwasu octowego. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez 2 miesiące</td></tr><tr><td>Język analizy statystycznej</td><td>https://www.r-project.org</td><td>R wersja 3.6.1</td><td>R to język i środowisko do obliczeń statystycznych i grafiki. Jest to projekt GNU, który jest podobny do języka i środowiska S</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>https://rstudio.com</td><td>R studio w wersji 1.1.463</td><td>współpraca między R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP i innymi. RStudio i Shiny są projektami afiliowanymi Fundacji Statystyki Otwartego Dostępu</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028</td><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) i utwardzacz w jednym zestawie</td></tr><tr><td>Drożdże Pepton D Rosół</td><td>Difco</td><td>242820</td><td></td></tr><tr><td>YPD Agar</td><td>Difco</td><td>DF0427-17-6</td><td></td></tr></tbody></table>

automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek c. albicans

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Metoda przedstawiona w tym artykule ma na celu automatyzację eksperymentów Bio-AFM i rejestrowania krzywych siły. Za pomocą tej metody możliwe jest automatyczne rejestrowanie krzywych sił na 1000 ogniwach w ciągu 4 godzin. Aby utrzymać 4-godzinny czas analizy, liczba krzywych sił na komórkę jest zmniejszana do 9 lub 16. Metoda łączy w sobie program oparty na Jythonie i strategię składania komórek według zdefiniowanych wzorców. Program, zaimplementowany w komercyjnym Bio-AFM, może wyśrodkować końcówkę na pierwszej komórce tablicy, a następnie automatycznie przemieszczać się z komórki do komórki, rejestrując krzywe siły na każdej komórce. Korzystając z tej metodologii, możliwe jest uzyskanie dostępu do parametrów biofizycznych komórek, takich jak ich sztywność, właściwości adhezyjne itp. Dzięki automatyzacji i dużej liczbie analizowanych komórek można uzyskać dostęp do zachowania populacji komórek. Jest to przełom w dziedzinie bio-AFM, gdzie do tej pory dane zarejestrowano tylko na kilkudziesięciu komórkach.

Opisany protokół wykorzystaliśmy do analizy wpływu kaspofunginy na właściwości biofizyczne oportunistycznego patogenu człowieka C. albicans w formie drożdżakowej. Kaspofungina jest lekiem przeciwgrzybiczym ostatniej szansy, stosowanym w sytuacjach, gdy inne preparaty okazują się nieskuteczne ze względu na mechanizmy oporności wypracowane przez komórki. Jej mechanizm działania opiera się na hamowaniu podjednostki Fks2 kompleksu fks1/Fks2 odpowiedzialnego za syntezę ß-glukanów. Ponieważ ß-glukany są głównym składn...

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Automatyzacja mikroskopu sił atomowych jest kluczową innowacją w ewolucji technologii w kierunku zastosowań biomedycznych. Otwiera również dostęp do badań nad właściwościami biomechanicznymi populacji komórek. Nasza metoda umożliwia rejestrację pomiarów AFM dla 1 000 komórek w ciągu czterech godzin, w porównaniu ze zwykłymi metodami, które zajmują cztery godziny na pomiar 10 komórek, jest to naprawdę znaczny zysk czasu.Jeśli automatyzacja jest warunkiem wstępnym wprowadzenia tej technologii do laboratoriów szpitalnych, ten protokół weryfikacji koncepcji sugeruje jej potencjał do wykorzystania w opracowywaniu konkretnych medycznych strategii diagnostycznych. Protokół ten wykorzystuje wszechstronny trzpień PDMS, który może być wypełniony różnymi drobnoustrojami, co pozwala na badanie różnych systemów. Aby przygotować stempel PDMS, wymieszaj 55 gramów roztworu prepolimeru PDMS w stosunku masowym 10 do jednego w PDM, oligomerach i utwardzaczu, a następnie odgazuj otrzymany roztwór w próżni raz razy 10 do ujemnego jeden do jednego razy 10 do ujemnych dwóch prętów przez pięć do 10 minut.Gdy wszystkie pęcherzyki pułapek zostaną usunięte, wlej 20 gramów odgazowanego roztworu na silikonową formę wzorcową do grubości dwóch do trzech milimetrów i ponownie odgazuj. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy siatkować PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę i za pomocą skalpela przeciąć stempel mikrostrukturalny PDMS równolegle do widocznych układów mikrostruktury. Następnie oderwij stempel od silikonowej formy głównej i umieść miejsce mikrostruktury stempla na szklanym szkiełku tak, aby mikrostruktury były wyrównane z bokiem szkiełka.Aby przygotować komórki do urządzenia, należy odwirować 600 mikrolitrów zawiesiny komórek będących przedmiotem zainteresowania i dodać 200 mikrolitrów supernatantu do stempla. Odgazowywać supernatant w próżni przez około 40 minut. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków należy zastąpić supernatant z powierzchni PDMS 200 mikrolitrami zawieszonego roztworu komórkowego na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Aby załadować komórki do mikrostruktur stempla, użyj szklanego szkiełka przytrzymanego pod kątem od 30 do 50 stopni, aby rozłożyć komórki na stemplu w obu kierunkach, kilka razy w razie potrzeby. Po osiągnięciu wysokiego stopnia napełnienia mikrostruktur należy użyć pipety do usunięcia zawiesiny komórek i przepłukać ją trzykrotnie jednym mililitrem buforu octanowego na przemycie, aby usunąć wszelkie nieuwięzione komórki. Po ostatnim płukaniu należy użyć przepływu azotu, aby wysuszyć tylną część próbki i umieścić stempel na szalce Petriego.Następnie dodaj do naczynia dwa mililitry świeżego buforu octanowego. W przypadku mikroskopii sił atomowych komórek, umieść szalkę na stoliku mikroskopu sił atomowych i wyśrodkuj stolik od zera do zera. Gdy stolik zostanie wyśrodkowany, przenieś szalkę do uchwytu szalki Petriego pod mikroskopem i wyrównaj krawędź stempla tak, aby była prostopadła do osi y uchwytu szalki Petriego.Następnie umieść głowicę mikroskopu atomowego na stoliku, uważając, aby silniki krokowe były wystarczająco wysunięte, aby uniknąć uderzenia końcówki o stempel. Do obrazowania użyj pokręteł mikroskopu, aby wyśrodkować końcówkę mikroskopu sił atomowych nad lewym rogiem dołków mikrometrowych o wymiarach 4.5 na 4.5 kwadratów i wybierz tryb mapowania sił w oprogramowaniu mikroskopu. Aby ustawić mapę sił 64 na 64 na obszarze 100 na 100 mikrometrów, ustaw względną wartość zadaną na trzy do pięciu nanoniutonów, długość Z na cztery mikrometry, ruch Z na stały czas trwania, czas wydłużenia na 0,01 sekundy, opóźnienie wysuwu na zero, opóźnienie wycofania na zero, tryb opóźnienia na stałą siłę, częstotliwość próbkowania do 2048 Hz.Odznacz zamkniętą pętlę Z i zaznacz kwadratowy obraz. Ustaw szybki dostęp na 100 mikrometrów, wolną oś na 100 mikrometrów, przesunięcie X na zero mikrometrów, przesunięcie Y na zero mikrometrów, kąt siatki na zero stopni, piksele na 64 na 64, a stosunek pikseli na jeden do jednego. Następnie otwórz oprogramowanie do automatyzacji.W oknie podręcznym wybierz ścieżkę do pliku skryptu. Wprowadź współrzędną W1 w wierszu 239 zmiennej P1 w sekcji pola wejściowego skryptu gyfon oraz wartość współrzędnej W2 w wierszu zmiennej P2 241. Przypisz wartość skoku do linii zmiennej skoku 245 skryptu i wprowadź wymiar studni, który można określić na podstawie projektu wzorów studni, do linii zmiennej W-S 248.Wpisz ścieżkę do katalogu zapisu w wierszu 251, aby zapisać dane w żądanym miejscu i ustaw zmienną całkowitej powierzchni linii 254 na żądanie wielokrotnego końca 100 mikrometrów. Następnie ustaw krzywe siły, macierz, wiersz i kolumnę zapisaną na studnię w linii zmiennej liczby skanów 257 i kliknij uruchom, aby uruchomić program. Aby przeanalizować dane, użyj oprogramowania do kodu studia wideo, aby otworzyć skrypt Pythona i wykonać skrypt Pythona kopii plików, aby uporządkować pliki krzywej siły w jednym folderze.Wprowadź ścieżkę do folderu ogólnego, w którym będą przechowywane dane. Aby przeanalizować krzywe sił, otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych producenta mikroskopu sił atomowych. W menu plik wybierz partię krzywych spektroskopowych.Następnie wybierz plik i proces ładowania, a następnie wybierz proces sztywności. Wybierz ostatni krok procesu i kliknij przycisk zachowaj i zastosuj do wszystkich, aby wszystkie krzywe siły były traktowane w ten sam sposób. Aby otworzyć skrypt języka R, załaduj pliki zawierające informacje wyodrębnione za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych do oprogramowania R studio.W oknie środowiska kliknij pozycję importuj zestaw danych, a następnie z czytnika tekstu w oknie podręcznym kliknij przycisk Przeglądaj, aby zlokalizować plik TSV z kropką. Po załadowaniu pliku wybierz region uruchamiania kodu i uruchom wszystko, aby uruchomić cały kod. W tym miejscu przedstawiono typowe histogramy uzyskane przy użyciu protokołu, jak pokazano.W tej analizie repartycję sztywności zarejestrowano na 957 komórkach natywnych, podczas gdy w tej analizie zmierzono sztywność 574 komórek traktowanych kaspofunginą. Wiedz, że użycie setek komórek pozwala na dwumodalny rozkład obserwowanych wartości. W mniejszych próbach zwykle obserwuje się pojedynczy rozkład, który może skutkować brakiem obserwacji niejednorodności populacji.Porównanie tych dwóch warunków podkreśla wpływ kaspofunginy na zmniejszenie sztywności komórek. Porównanie komórek natywnych i leczonych metodą ANOVA wykazało, że te dwa stany wykazują bardzo, znacząco różną sztywność. Wartość ta została osiągnięta ze względu na dużą liczbę analizowanych komórek, zapewniającą większą pewność co do uzyskanych wyników.Dodanie supernatantu do stempla PDMS przed wielokrotnym płukaniem komórek do studzienek, aż stempel będzie pełny, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analizy. W tym dowodzie słuszności koncepcji przeanalizowano komórki Candida albicans, ale protokół można zastosować do dowolnej grupy komórek wzorcowych, cząsteczek lub materiałów.

automation-bio-atomic-force-microscope-measurements-on-hundreds-c

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) jako prostej i szybkiej metody charakteryzacji bakterii i analizujemy szczegóły, takie jak rozmiar i kształt bakterii, biofilmy kultur bakteryjnych oraz aktywność nanocząsteczek jako środków bakteriobójczych.

Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Poznaj automatyzację mikroskopii sił atomowych dla badania właściwości biomechanicznych komórek C. albicans. Ta metoda umożliwia pomiar 1000 komórek w cztery godziny, znacznie przyspieszając diagnostykę mikrobiologiczną.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Przeglądaj więcej filmów