Założenie i utrzymanie gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana)

Protokół generowania gnotobiotycznych karaluchów ułatwia testowanie wpływu usuwania i zastępowania rodzimych społeczności mikroorganizmów jelitowych na zdrowie gospodarza i tworzenie mikrobiomu. Technika ta wykorzystuje metody z wielu źródeł, aby stworzyć spójny, usprawniony przepływ pracy do generowania gnotobiotycznych karaluchów bez użycia drogiego specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Biorąc pod uwagę wiele różnych ruchomych części tego protokołu gnotobiotycznego, wizualizacja pomaga naukowcom w łatwiejszym tworzeniu własnych, małych, tanich, stacjonarnych obiektów gnotobiotycznych.

Aby ułatwić zebranie odpowiedniej liczby samic noszących oothecae do planowanych eksperymentów, należy użyć kleszczy do przesuwania tekturowych probówek zawierających ciężarne samice w zbiorniku podstawowym. Jeśli kartonowa tuba zawiera wiele owadów oprócz ciężarnej samicy, wstrząśnij zawartością probówki do dodatkowego plastikowego pojemnika otoczonego wazeliną i zachęć docelowego owada do samodzielnego wdrapania się z powrotem do tekturowej tuby. Po pobraniu należy przenieść każdą ciężarną suczkę na oddział położniczy.

Gdy samice upuszczą oothecae, wróć do zbiornika i użyj kleszczy, aby odzyskać oothecae z miotu. Aby oczyścić oothecae, umieść do pięciu pojemników na jajka w pięciomililitrowej probówce wirówkowej zawierającej trzy mililitry dodecylosiarczanu sodu i wiruj oothecae przez 10 sekund. Po drugim umyciu, jak właśnie pokazano, użyj delikatnej chusteczki do zadań, aby delikatnie wyszorować powierzchnię każdej ootheca, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i umieść oczyszczoną ootheca w łodzi do ważenia.

Przed sterylizacją napełnij dwie 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe na ootheca jednym mililitrem sterylnej wody na probówkę. Dodaj również 10 mikrolitrów 32% roztworu podstawowego kwasu nadoctowego do 3,2 mililitra podwójnie destylowanej wody w pięciomililitrowej probówce wirówkowej w dygestorium. Zakręć i odwróć kilka razy, aby wymieszać i umieścić do pięciu oczyszczonych oothecae w świeżo przygotowanym 0,1% roztworze kwasu nadoctowego na pięć minut, odwracając probówkę kilka razy co 60 sekund.

Kwas nadoctowy jest silnym utleniaczem, działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe, jest łatwopalny i. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi i odpowiednio utylizuj odpady. Pod koniec inkubacji użyj sterylnych kleszczyków i kaptura z przepływem laminarnym, aby przenieść każdą oothekę do własnej probówki wirówkowej ze sterylną wodą do płukania.

Odwróć kilka razy, aby wymieszać przed przeniesieniem oothecae do drugiego zestawu probówek z wodą do płukania. Po drugim płukaniu za pomocą sterylnych kleszczy przenieś oothecae na poszczególne skosy BHI. Umieść skosy w wysterylizowanym pojemniku wtórnym i przenieś pojemnik do nawilżonego inkubatora o temperaturze 30 stopni Celsjusza na cztery do pięciu tygodni, aż się wykluje.

Sprawdzaj skosy regularnie raz do dwóch razy w tygodniu pod kątem rozwoju grzybów lub bakterii do czwartego tygodnia, kiedy to skosy powinny być sprawdzane codziennie. Kiedy nimfy zaczną się wykluwać, użyj sterylnych kleszczy i kaptura z przepływem laminarnym, aby aseptycznie przenieść granulkę wysterylizowanej karmy dla szczurów do przygotowanej kolby BHI. W celu sprawdzenia sterylności umieścić kolbę w pojemniku wtórnym w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na 24 godziny, aby potwierdzić brak zanieczyszczającego wzrostu.

Jeżeli kolba pozostała sterylna, należy strząsnąć nimfy ze skosu, pozwalając im wpaść do kolby w kapturze z przepływem laminarnym. Następnie raz w tygodniu podlewaj nimfy 300 mikrolitrami sterylnej wody w okapie z przepływem laminarnym. Kiedy kał nimf zacznie pokrywać podłoże, przenieś nimfy do nowej kolby BHI zawierającej wysterylizowaną karmę dla szczurów dodaną 24 godziny wcześniej, jak pokazano.

Ciężarne samice można rozpoznać po ootheca przyczepionej do ich tylnych odwłoków. Oothecae wykluwają się średnio 34 dni po sterylizacji. W przypadku nieudanej sterylizacji podczas inkubacji wokół oothecae może pojawić się wzrost, który pogarsza status gnotobiotyczny piskląt.

Następnie tempo wzrostu nimfal można śledzić, mierząc długość ciała owada. Polimorfizm długości fragmentu restrykcyjnego rybosomalnego DNA 16S z homogenizowanej nimfy może być wykorzystany do potwierdzenia statusu gnotobiotycznego. Gnotobiotyczne karaluchy można zaszczepić syntetycznymi lub ksenobiotycznymi zbiorowiskami mikroorganizmów.

Chociaż ten konkretny przepływ pracy jest nowy, poprzednie badania z użyciem gnotobiotycznych karaluchów przyniosły wgląd w tworzenie mikrobiomu jelitowego i role drobnoustrojów w kształtowaniu zachowań społecznych, zdrowia jelit i odporności ich owadzich gospodarzy.