Name: Podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do Cisterna Magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj model krwotoku podpajęczynówkowego u myszy poprzez podwójne wstrzyknięcie krwi do cisterna magna. Ta metoda umożliwia kontrolę rozlewu krwi i badanie nowych celów terapeutycznych w neurochirurgii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy platformie PRIMACEN (Uniwersytet Normandie Rouen, Francja) za sprzęt do obrazowania oraz Panu Arnaud Arabo, Pani Julie Maucotel i Pani Martine Dubois za trzymanie i opiekę nad zwierzętami. Dziękujemy Pani Celeste Nicola za użyczenie swojego głosu w nagraniu protokołu na wideo. Prace te były wspierane przez program dojrzewania Seinari Normandy, Fundację AVC pod egidą FRM, Uniwersytet Normandie Rouen i Inserm. Region Normandii i Unia Europejska (projekt 3R). Europa angażuje się w Normandii w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone pod nadzorem H. Castela, zgodnie z Francuskim Komitetem Etyki oraz wytycznymi Parlamentu Europejskiego Dyrektywa 2010/63/UE i Rady ds. Ochrony Zwierząt Wykorzystywanych do Celów Naukowych. Projekt ten został zatwierdzony przez lokalną CENOMEXA i krajowe komisje etyczne ds. badań i testów na zwierzętach. Samce myszy C57Bl/6J Rj (Janvier), w wieku 8–12 tygodni, trzymano w kontrolowanych standardowych warunkach środowiskowych: 22 °C ± 1 °C, 12 godzin/12 godzin cyklu jasnego/ciemnego oraz woda i pożywienie dostępne ad libitum.
1. Przygotowanie do operacji SAH i iniekcji
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem operacji należy pobrać odpowiednią liczbę szklanych naczyń włosowatych za pomocą ściągacza do mikropipet. Pipeta iniekcyjna powinna mieć średnicę wewnętrzną 0,86 mm i zewnętrzną 1,5 mm.</li>
	<li>Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) na stan pozorowany.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór ze 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukozy, 26,2 mM NaHCO3 w H2O, pH 7,4.</li>
		<li>Gaz aCSF o stężeniu 95%O2 i 5% CO2 przez 15 min, a następnie dodaj 2,5 mM CaCl2.</li>
		<li>Wysterylizuj natleniony aCSF za pomocą aparatu filtrującego 0,22 μm. Roztwór aCSF może być stabilny przez 3-4 tygodnie w temperaturze 4 °C. Jeśli pojawiło się zanieczyszczenie (mętnienie roztworu) lub tworzenie się osadów, wyrzuć i wykonaj świeży płyn CSF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobranie krwi od homologicznego dawcy myszy
	<ol>
		<li>Odizoluj tętnicę szyjną wzdłuż tchawicy i zbierz maksymalną ilość krwi przez nakłucie tętnicy szyjnej.</li>
		<li>W praktyce mysz należy umieścić w komorze anestezjologicznej i załadować ją 5% izofluranem, aż zwierzę straci przytomność.</li>
		<li>Sprawdź brak odruchów, zaciskając jedną z dwóch tylnych kończyn, aby umożliwić ustawienie chirurgicznego zabiegu eksperymentalnego.</li>
		<li>Pokryć strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem heparyny za pomocą igły 26 G (heparyna sodowa). Zapobiegnie to krzepnięciu krwi podczas kolejnych kroków.</li>
		<li>Umieść zwierzę w odleżynie grzbietowej z rozstawionymi nogami, a nos w masce anestezjologicznej (utrzymanie znieczulenia za pomocą 2 do 2,5% izofluranu).</li>
		<li>Odizoluj tętnicę szyjną wzdłuż tchawicy, przecinając mięsień omohyoidalny wzdłużnie. Po wyizolowaniu tętnicy wbij igłę w kierunku serca za pomocą haka do mikropreparacji i kleszczy i zbierz maksimum krwi poprzez nakłucie tętnicy szyjnej (potrzeba 60 μl na mysz SAH).</li>
		<li>Znieczuloną mysz dawcy należy poświęcić natychmiast po pobraniu krwi, stosując zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt (8-10-tygodniowe samce myszy C57BL/6J)
<ol>
	<li>Zważ każdą mysz precyzyjnie za pomocą wagi elektronicznej. W obecnym badaniu myszy miałyby masę ciała w zakresie od 20 do 25 gramów tuż przed operacją.</li>
	<li>Jak wyjaśniono wcześniej (patrz kroki 1.3.2 i 1.3.3), wywołaj znieczulenie myszy do operacji.</li>
	<li>Ogol szyję i przestrzeń między uszami za pomocą odpowiedniej elektrycznej maszynki do strzyżenia.</li>
	<li>Zamontuj zwierzę znajdujące się w brzusznym odleżynie z rozstawionymi nogami i nosem w masce anestezjologicznej (utrzymanie znieczulenia 2 i 2,5% izofluranem) na ramie stereotaktycznej.</li>
	<li>Sprawdź, czy mysz śpi i czy jej głowa jest prawidłowo zablokowana.</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć 100 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg) za pomocą igły 26 G w dolną część pleców, aby uniknąć bólu po przebudzeniu.</li>
	<li>Zapobiegaj suchości oczu, stosując żel ochronny w płynie i utrzymuj temperaturę doodbytniczą 37 °C za pomocą automatycznie regulowanego koca elektrycznego.</li>
	<li>Potraktuj ogolony obszar tylnej szyi roztworem antyseptycznym (jodon lub chlorheksydyna za pomocą sterylnej bawełnianej drogi).</li>
	<li>Wstępnie wysterylizuj wszystkie narzędzia mające kontakt z przygotowaną skórą/tkanką podskórną (podgrzewanie do 200 °C przez 2 godziny) i postępuj z nimi w sposób aseptyczny.</li>
</ol>
3. Indukcja SAH
<ol>
	<li>W pierwszym dniu (D-1)
	<ol>
		<li>Wytnij 1 cm nacięcie cienkimi nożyczkami w tylnej części szyi, a następnie oddziel mięśnie wzdłuż linii środkowej, aby uzyskać dostęp do cisterna magna.</li>
		<li>Odetnij końcówkę pustej szklanej pipety cienkimi nożyczkami. Następnie dostosuj do strzykawki podłączonej do elastycznego silikonowego łącznika.</li>
		<li>Przenieść 60 μl krwi lub aCSF (odpowiednio dla SAH lub stanu pozorowanego) w probówce o pojemności 0,5 ml za pomocą precyzyjnej mikropipety.</li>
		<li>Odssać do szklanej pipety 60 μl krwi w przypadku stanu SAH lub 60 μl aCSF w przypadku stanu pozorowanego.</li>
		<li>Do wstrzykiwania należy zamontować pipetę na ramie stereotaktycznej za pomocą pierścienia lub pinezki i powoli przyłożyć końcówkę pipety do membrany na styku z cisterna magna.</li>
		<li>Powoli wprowadzić końcówkę pipety przez błonę atlanto-potyliczną do cisterna magna, używając mikromanipulatora ramy stereotaktycznej.</li>
		<li>Podłączyć pipetę uprzednio napełnioną krwią lub płynem mózgowo-rdzeniowym do strzykawki gotowej do indukcji ciśnienia.</li>
		<li>Wstrzykiwać, naciskając tłok z małą szybkością około 10 μl/min, aby uniknąć ostrego ciśnienia śródczaszkowego.</li>
		<li>Podczas wstrzykiwania należy ściśle monitorować częstość oddechów i temperaturę w odbycie.</li>
		<li>Po zakończeniu iniekcji ostrożnie zdjąć pipetę za pomocą mikromanipulatora i upewnić się, że podczas pobierania nie ma wycieku.</li>
		<li>Osiągnij hemostazę za pomocą wchłanialnego hemostatu i uruchom dwa szwy z plecionką, niewchłanialną nicią do szycia.</li>
		<li>Bezpośrednio po zabiegu należy odizolować i ustawić mysz w zmniejszającym się odleżynie i przykryć ją kocem ratunkowym w otwartym pudełku na czas rekonwalescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugi dzień indukcji (D0)
	<ol>
		<li>Po 24 godzinach wywołać znieczulenie (patrz kroki 1.3.2 i 1.3.3). Ponownie wstrzyknąć podskórnie 100 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg) i zapobiec suchości oczu za pomocą ochronnego żelu w płynie (patrz kroki 2.7 i 2.8).</li>
		<li>Zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej, tak jak dzień wcześniej.</li>
		<li>Ostrożnie usuń szwy za pomocą mikronożyczek.</li>
		<li>Przygotować błonę atlanto-potyliczną jak poprzednio i nanieść preparat antyseptyczny na ogolony obszar szyi za pomocą sterylnego bawełnianego pręta.</li>
		<li>Wstrzyknąć 30 μl krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego z małą szybkością (patrz kroki 3.1.2 do 3.1.8). Monitoruj częstość oddechów i temperaturę w odbycie.</li>
		<li>Pod koniec wstrzyknięcia ostrożnie zdejmij pipetę i sprawdź, czy podczas pobierania krwi nie ma wycieku.</li>
		<li>Osiągnij hemostazę i uruchom dwa szwy z plecioną wchłanialną nicią do szycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obserwacja pooperacyjna i zakończenie eksperymentu
<ol>
	<li>Natychmiast po zabiegu należy odizolować i umieścić mysz w pogarszającym się odleżynie z kocem przetrwania na grzbiecie w otwartym pudełku podczas rekonwalescencji.</li>
	<li>Waż i uważnie obserwuj codziennie zachowanie każdej myszy aż do złożenia w ofierze (np. D7 po operacji).</li>
	<li>Wśród humanitarnych punktów końcowych klasycznie zauważa się znaczną utratę masy ciała (>15% masy). Postawa "zgarbionych pleców", powolne ruchy, pokłony, nieprawidłowe wokalizacje bólu i/lub znaczące agresywne zachowanie są również ważnymi oznakami cierpienia zwierząt. Jeśli pojawi się którykolwiek z tych objawów lub kombinacja objawów, monitorowanie zwierzęcia jest wzmocnione w ciągu kilku godzin od ich pojawienia się. Jeśli dobrostan zwierzęcia pogorszy się lub nie poprawi się w ciągu 48 godzin, uznaje się, że osiągnięto poziom cierpienia nie do zniesienia i przeprowadza się eutanazję.</li>
	<li>W momencie wyboru należy złożyć w ofierze znieczulone myszy przez dekapitację i pobrać mózgi do dalszych analiz.</li>
	<li>Przeprowadzić eutanazję (dekapitację) po znieczuleniu izofluranem (5%).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo intensywności badań w dziedzinie SAH i rozwoju strategii terapeutycznych, takich jak opcje leczenia wewnątrznaczyniowego i farmakologicznego, które wzrosły w ciągu ostatnich dwudziestu lat, śmiertelność utrzymuje się na wysokim poziomie w ciągu pierwszego tygodnia od przyjęcia do szpitala i osiąga około 50% w ciągu kolejnych 6 miesięcy24,25. Ten obecny model przedkliniczny polegający na codziennym podwójnym wstrzyknięciu homologicznej krwi...

Krwotok podpajęczynówkowy (SAH) stanowi do 5% wszystkich przypadków udaru mózgu i stanowi stosunkowo powszechną patologię z częstością występowania od 7,2 do 9 pacjentów na 100 000 rocznie, ze śmiertelnością 20%-60% w zależności od badania1,2,3. W ostrej fazie śmiertelność jest związana z nasileniem krwawienia, krwawienia ponownego, skurczu naczyń mózgowych (CVS) i/lub powikłań medycznych4. U osób, które przeżyły, wczesne uszkodzenie mózgu (EBI) wiąże się z wydłużeniem krwotoku miąższowego i nagłym wzrostem ciśnienia śródczaszkowego, co może skutkować pierwotnym niedokrwieniem mózgu5 i natychmiastową śmiercią w około 10%-15% przypadków6. Po początkowym "ostrym" stadium SAH rokowanie zależy od wystąpienia "wtórnego" lub opóźnionego niedokrwienia mózgu (DCI), wykrytego u blisko 40% pacjentów za pomocą tomografii komputerowej mózgu i do 80% pacjentów po rezonansie magnetycznym (MRI)7,8. Oprócz CVS występującego od 4 do 21 dni po pęknięciu tętniaka u większości pacjentów z SAH, DCI9 może wynikać z wieloczynnikowych rozlanych zmian w mózgu wtórnych do tworzenia mikrozakrzepicy, zmniejszonej perfuzji mózgowej, zapalenia nerwów i depresji rozprzestrzeniającej się korowo (CSD)10,11,12,13. Dotyczy to 30% osób, które przeżyły SAH i wpływa na funkcje poznawcze, w tym pamięć wzrokową, pamięć werbalną, czas reakcji oraz funkcje wykonawcze, wzrokowo-przestrzenne i językowe14 upośledzając codzienne życie15. Obecne standardowe terapie mające na celu zapobieganie CVS i/lub złym wynikom poznawczym u pacjentów z SAH opierają się na zablokowaniu sygnalizacji Ca2 + i zwężeniu naczyń krwionośnych za pomocą inhibitorów kanału Ca2 + w postaci nimodypiny. Jednak nowsze badania kliniczne ukierunkowane na zwężenie naczyń krwionośnych wykazały dysocjację między wynikiem neurologicznym pacjenta a zapobieganiem CVS16, co sugeruje bardziej złożone mechanizmy patofizjologiczne zaangażowane w długoterminowe konsekwencje SAH. W związku z tym istnieje medyczna potrzeba lepszego zrozumienia liczby zdarzeń patologicznych towarzyszących SAH oraz opracowania ważnych i standaryzowanych modeli zwierzęcych w celu przetestowania oryginalnych interwencji terapeutycznych.
Pęknięcie tętniaka wewnątrzczaszkowego, głównie odpowiedzialnego za SAH u ludzi, jest prawdopodobnie trudne do naśladowania w przedklinicznych modelach zwierzęcych. Obecnie pęknięcie tętniaka i sytuacja SAH mogą być wstępnie badane przez perforację tętnicy środkowej mózgu (model nakłucia wewnątrznaczyniowego) odpowiedzialną za CVS i dysfunkcje sensitivomotoryczne u myszy17,18. Ze względu na brak jakiejkolwiek możliwej kontroli nad wystąpieniem krwawienia i dyfuzją krwi w tym modelu, u gryzoni opracowano inne metody generowania modeli SAH bez pęknięcia wewnątrznaczyniowego. Dokładniej rzecz ujmując, polegają one na bezpośrednim podaniu krwi tętniczej do przestrzeni podpajęczynówkowej poprzez pojedyncze lub podwójne wstrzyknięcie w magna cisterna19 lub pojedyncze wstrzyknięcie do cysterny prechiazmatycznej 20. Główną zaletą tych modeli mysich bez pęknięcia wewnątrznaczyniowego jest możliwość powtarzalnego opanowania procedury chirurgicznej oraz jakości i ilości wstrzykniętej próbki krwi. Kolejną przewagą tego modelu nad modelem w przypadku perforacji wewnątrznaczyniowej jest w szczególności zachowanie ogólnego dobrostanu zwierzęcia. W rzeczywistości ta operacja jest mniej inwazyjna i technicznie mniej wymagająca niż ta wymagana do spowodowania pęknięcia ściany szyjnej. W tym ostatnim modelu zwierzę musi być zaintubowane i wentylowane mechanicznie, podczas gdy żyłka jest wprowadzana do tętnicy szyjnej zewnętrznej i wprowadzana do tętnicy szyjnej wewnętrznej. Prawdopodobnie prowadzi to do przejściowego niedokrwienia z powodu niedrożności naczynia przez ścieżkę drutu. W związku z tym współzachorowalność (stan agonalny, silny ból i śmierć) związana z zabiegiem chirurgicznym jest mniej istotna w modelu podwójnej iniekcji w porównaniu z modelem perforacji wewnątrznaczyniowej. Oprócz tego, że jest to bardziej spójny SAH, metoda podwójnej iniekcji bezpośredniej jest zgodna z dobrostanem zwierząt w badaniach i testach (skrócony czas pod narkozą, ból spowodowany uszkodzeniem tkanek podczas operacji i dystresu) i prowadzi do minimalnej całkowitej liczby zwierząt wykorzystanych do badania protokołu i szkolenia personelu.
Ponadto, pozwala to na implementację tego samego protokołu dla myszy transgenicznych, prowadząc do zoptymalizowanego patologicznego zrozumienia SAH i możliwości testowania porównawczego potencjalnych związków terapeutycznych. Tutaj przedstawiamy standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego (SAH) poprzez podwójne codzienne kolejne wstrzyknięcie autologicznej krwi tętniczej do cisterna magna u 6-8 tygodniowych samców myszy C57Bl / 6J. Główną zaletą tego modelu jest kontrola objętości krwawienia w porównaniu z modelem perforacji wewnątrznaczyniowej oraz wzmocnienie krwawienia bez drastycznego wzrostu ciśnienia śródczaszkowego21. Ostatnio podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do cisterna magna zostało dobrze opisane w kwestiach eksperymentalnych i fizjopatologicznych u myszy. Rzeczywiście, niedawno wykazaliśmy CVS dużych tętnic mózgowych (tętnice mózgowe podstawne (BA), środkowe (MCA) i przednie (ACA)), odkładanie fibryny mózgowo-naczyniowej i apoptozę komórek od 3 dnia (D3) do 10 (D10), wady krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego w stanie okołonaczyniowym, którym towarzyszą zmienione funkcje sensywnomotoryczne i poznawcze u myszy, 10 dni po SAH w tym modelu22. W ten sposób sprawia, że model ten jest opanowany, zwalidowany i scharakteryzowany dla krótkotrwałych i długotrwałych zdarzeń po SAH. Powinien idealnie nadawać się do prospektywnej identyfikacji nowych celów oraz do badań nad silnymi i skutecznymi strategiami terapeutycznymi przeciwko powikłaniom związanym z SAH.

<table><tbody><tr><td>wchłanialny hemostat</td><td>Aticon</td>, <td>wchłanialna</td> nić do szycia Ethicon Surgicel <td></td></tr> Koc elektryczny z automatyczną regulacją <tr><td></td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 5.0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparat Harvard</td><td>50-7087-F</td><td></td></tr><tr><td>bluetack do mocowania kapilarnego</td><td>Waga</td> elektroniczna <td>UHU Patafix</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Denver Instrument</td><td>MXX-2001</td><td></td></tr><tr><td>kapilary szklane</td><td>Aparat Harvarda</td><td>GC150F-15</td><td>średnica wewnętrzna 0,86 mm średnica zewnętrzna 1,5 mm</td></tr><tr><td>parownik izofluranowy</td> ściągacz do mikropipet <td>Phymep</td><td>V100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>igła Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>26 G</td><td>Mikrowaga BD</td><td>300300</td><td></td></tr><tr><td>niewchłanialna nić do szycia</td><td>Peters surgical</td><td>Filapeau 4.0</td><td></td></tr><tr><td>rama stereotaktyczna</td><td>Instrumenty Davida Kopfa</td><td>Model 902</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt chirurgiczny</td><td>Kent naukowy</td><td>zacisk, mikronożyczki, cienkie</td><td></td>nożyczki</tr><tr><td>strzykawka 20 ml TERUMO</td><td>Thermofisher</td><td>11866071</td><td></td></tr></tbody></table>

podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do cisterna magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Wśród udarów, krwotok podpajęczynówkowy (SAH) następujący po pęknięciu tętniaka tętnicy mózgowej stanowi 5-9%, ale jest odpowiedzialny za około 30% całkowitej śmiertelności związanej z udarem mózgu z istotną chorobowością pod względem wyniku neurologicznego. Opóźniony skurcz naczyń mózgowych (CVS) może wystąpić najczęściej w połączeniu z opóźnionym niedokrwieniem mózgu. Obecnie stosuje się różne modele zwierzęce SAH, w tym perforację wewnątrznaczyniową i bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do cysterny wielkiej, a nawet spłuczki prechiazmatycznej, z których każdy ma odrębne zalety i wady. W artykule przedstawiono standaryzowany mysi model SAH poprzez dwukrotne bezpośrednie wstrzyknięcie określonych objętości autologicznej krwi pełnej do cisterna magna. Krótko mówiąc, myszy zważono, a następnie znieczulono przez inhalację izofluranu. Następnie zwierzę umieszczono w pozycji półleżącej na podgrzewanym kocu, utrzymując temperaturę w odbycie 37 °C i umieszczono w ramie stereotaktycznej z zgięciem szyjki macicy około 30°. Po umieszczeniu na miejscu, końcówkę wydłużonej szklanej mikropipety wypełnionej homologiczną krwią tętniczą pobraną z tętnicy szyjnej innej myszy w tym samym wieku i tej samej płci (C57Bl/6J) umieszczono pod kątem prostym w kontakcie z błoną atlantyczno-potyliczną za pomocą mikromanipulatora. Następnie wstrzyknięto 60 μl krwi do cisterna magna, a następnie zwierzę przechylono w dół o 30° przez 2 minuty. Drugi wlew 30 μl krwi do cisterna magna wykonano 24 godziny po pierwszym. Indywidualna obserwacja każdego zwierzęcia jest przeprowadzana codziennie (dokładna ocena wagi i samopoczucia). Procedura ta pozwala na przewidywalną i wysoce powtarzalną dystrybucję krwi, której prawdopodobnie towarzyszy wzrost ciśnienia śródczaszkowego, który można naśladować przez równoważne wstrzyknięcie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), i reprezentuje ostry lub łagodny model SAH powodujący niską śmiertelność.

Harmonogram eksperymentu, procedura, obserwacje i śmiertelność 
Rysunek 1A oraz Rysunek 1B podsumowują protokół modelu SAH polegający na podwójnej iniekcji krwi do cysterny. W skrócie, w pierwszym dniu indukcji SAH (D-1), do cysterny wielkiej wstrzyknięto odpowiednio 60 µL krwi pobranej od homologicznej myszy (w grupie SAH) lub 60 µL sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (w grupie kontrolnej/sham). Następnego dnia (D0), do cysterny wiel...

Opisaliśmy w tym protokole standaryzowany model myszy z krwotokiem podpajęczynówkowym (SAH) poprzez podwójne wstrzyknięcie autologicznej krwi pełnej do cisterna magna. Wysoki stopień standaryzacji procedury podwójnej iniekcji stanowi model SAH od średniego do ostrego ze względnym bezpieczeństwem w odniesieniu do śmiertelności.

Podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do Cisterna Magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Ogólnym celem tego filmu jest wyjaśnienie protokołu podwójnego bezpośredniego wstrzyknięcia krwi do cisterna magna jako modelu krwotoku podpajęczynówkowego. Fizjologia krwotoku podpajęczynówkowego jest często spowodowana pęknięciem tętniaka. Najpierw przeprowadzamy wynaczynienie krwi do przedziału między mózgiem a tkanką pokrywającą mózg.Ten przedział jest przestrzenią podpajęczynówkową. Krwotok podpajęczynówkowy stanowi do 7% wszystkich przypadków strajków. Śmiertelność waha się od 30 do 50% w badaniach populacyjnych, a osoby, które przeżyły krwotok podpajęczynówkowy, często doświadczają następstw poznawczych, takich jak deficyty pamięci, osłabienie lub zaburzenia nastroju.Główną przyczyną częstego występowania złych wyników jest niedokrwienie mózgu. Badania wykazały związek między występowaniem niedokrwienia w zwężeniu naczyń krwionośnych dużych tętnic mózgowych, zwanym mikroskopijnym skurczem naczyń, który można wykryć u większości pacjentów między czwartym a piętnastym dniem po pierwszym wzdęciu. Ze względu na nieskuteczność obecnych opcji terapeutycznych istnieje oczywista medyczna potrzeba lepszego zrozumienia zdarzeń patologicznych.Towarzyszący krwotok podpajęczynówkowy i nowe cele terapeutyczne powinny być testowane, ale wymaga to zróżnicowanych i ustandaryzowanych modeli zwierzęcych. Pęknięcie tętniaka międzyczaszkowego, głównie odpowiedzialnego za krwotok podpajęczynówkowy u ludzi, jest prawdopodobnie trudne do stworzenia modeli przedklinicznych i ludzkich. U zwierząt główne trudności dotyczą kontrolnej częstości występowania krwotoku i dystrybucji krwi, ale ostatnie badania koncentrują się na opracowaniu bardziej dedykacyjnych modeli krwotoku podpajęczynówkowego.Poniżej przedstawiono znormalizowany mysi model dwóch kolejnych wstrzyknięć autologicznej krwi tętniczej z naszych dwóch dni do cisterna magna. Główne zalety tego modelu to powtarzalne opanowanie nieinwazyjnego zabiegu chirurgicznego, dostosowanie jakości i ilości wstrzykiwanej krwi oraz wzmocnienie krwawienia bez drastycznego wzrostu ciśnienia śródczaszkowego. Przed rozpoczęciem operacji należy założyć kolejną dużą liczbę szklanych naczynek za pomocą ściągacza do mikropipet.Pipeta iniekcyjna powinna mieć średnicę wewnętrzną 0,86 milimetra i średnicę zewnętrzną 0,5 milimetra. Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do stanu pozorowanego, jak wskazano w pisemnym protokole. Musisz zdać sobie sprawę z tego, że jest to natleniony sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z aparatem filtrującym o wielkości 0,22 mikrona.Pierwszym krokiem naszego modelu krwotoku podpajęczynówkowego jest izolacja tętnicy szyjnej wzdłuż tchawicy i pobranie maksimum krwi z nakłucia tętnicy szyjnej. Po znieczuleniu izofluranem należy sprawdzić brak odruchów, zaciskając jedną lub dwie kończyny tylne, aby umożliwić ustawienie procedury eksperymentalnej. Zakoduj strzykawkę o średnicy jednego milimetra za pomocą igły o rozmiarze 26.Zapobiegnie to krzepnięciu krwi podczas kolejnych kroków. Zważ każdą mysz precyzyjnie za pomocą wagi elektronicznej. W obecnym badaniu myszy miałyby masę ciała w zakresie od 20 do 25 gramów tuż przed operacją.Jak wyjaśniono wcześniej, indukowane znieczulenie operowanej myszy, a następnie golenie szyi i przestrzeni między każdym uchem za pomocą odpowiedniej elektrycznej maszynki do strzyżenia. Sprawdź, czy mysz jest uśpiona, a głowa myszy jest dobrze zablokowana. Wstrzyknąć podskórnie 100 mikrolitrów buprenorfiny w dawce 0,1 miligrama na kilogram za pomocą igły o rozmiarze 26 w dolnej części pleców, aby uniknąć bólu po przebudzeniu.Zapobiegaj suchości oczu za pomocą ochronnego płynnego żelu i utrzymuj temperaturę wewnątrzprzewodową 37 stopni za pomocą automatycznie regulowanego koca elektrycznego. Przed potraktowaniem ogolonego obszaru roztworem antyseptycznym wszystkie narzędzia mające kontakt z tkanką zostały wysterylizowane i traktowane w sposób aseptyczny. Pierwszego dnia wytnij jednocentymetrowe nacięcie w tylnej części szyi, a następnie rozdziel mięśnie wzdłuż linii środkowej, aby uzyskać dostęp do cisterna magna.Odetnij końcówkę pustej szklanej pipety cienkimi nożyczkami. Następnie dostosuj do strzykawki podłączonej do elastycznego silikonowego łącznika. Następnie przenieś 60 mikrolitrów krwi lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w probówce o pojemności 0,5 mililitra za pomocą precyzyjnej mikropipety Zassaj do szklanej pipety 60 mikrolitrów krwi w przypadku krwotoku podpajęczynówkowego lub 60 mikrolitrów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w przypadku stanu pozorowanego.Do wstrzykiwania należy umieścić pipetę na ramce stereotaktycznej za pomocą np. naszego pierścienia A lub a i powoli zbliżyć końcówkę pipety do membrany na styku z cisterna magna. Powoli wprowadzić końcówkę pipety przez błonę atlanto-potyliczną do cisterna magna za pomocą mikromanipulatora ramy stereotaktycznej. Podłączyć pipetę do wcześniej napełnionej strzykawki, gotowej do indukcji ciśnieniowej.Wstrzykiwać pod ciśnieniem z niską szybkością około 10 mikrolitrów na minutę, aby uniknąć ostrego nadciśnienia śródczaszkowego. Podczas wstrzykiwania należy ściśle monitorować częstość oddechów i temperaturę w odbycie. Po zakończeniu iniekcji należy ostrożnie zdjąć pipetę za pomocą mikromanipulatora i upewnić się, że podczas pobierania nie ma wycieku.Osiągnij homeostazę i wykonaj dwa szwy z plecionką, niewchłanialną nicią do szycia. Bezpośrednio po zabiegu należy odizolować i ustawić mysz w zmniejszającym się odleżynie i przykryć kocem ratunkowym w otwartym pudełku na czas rekonwalescencji. Po 24 godzinach ponownie wywołaj znieczulenie, zainstaluj mysz na ramie stereotaktycznej jak dzień wcześniej i ostrożnie usuń szwy mikronożyczkami.Przygotować jak poprzednio aseptyczną błonę atlanto-potyliczną, nakładając na ogolony obszar i aseptyczny roztwór za pomocą bawełnianego pręta. Wstrzyknąć, tak jak dzień wcześniej, 30 mikrolitrów krwi lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w niewielkiej dawce. Jak już wspomniano, monitoruj częstość oddechów i temperaturę w odbycie.Pod koniec wstrzyknięcia ostrożnie zdejmij pipetę i sprawdź, czy podczas pobierania krwi nie ma wycieku. Osiągnij homeostazę i wykonaj dwa szwy za pomocą plecionej wchłanialnej nici do szycia. Od pierwszego dnia po operacji do dnia złożenia ofiary, masa ciała powinna być codziennie oceniana jako czuły wskaźnik ogólnego samopoczucia.Wykazano znacznie zmniejszony przyrost masy ciała w krwotoku podpajęczynówkowym w porównaniu ze zwierzętami pozorowanymi, co sugeruje długotrwały proces odzyskiwania aktywności i przedłużone zdarzenia patologiczne po krwotoku podpajęczynówkowym. Dlaczego śmiertelność nie jest w stanie pozorowanym? Śmiertelność wynosi blisko 30% w siódmym dniu w stanie krwotoku podpajęczynówkowego, przy czym większość zwierząt umiera w pierwszym lub czwartym dniu po operacji.Wśród humanitarnych punktów końcowych odnotowuje się znaczną utratę masy ciała przekraczającą 15% masy początkowej. Zgarbiona postawa, powolne ruchy, rany, nieprawidłowe wokalizacje lub znaczna agresja są również oznakami, że zwierzę cierpi. Jeśli pojawi się którykolwiek z tych objawów lub kombinacja objawów, śledzenie zwierzęcia zostanie wzmocnione w ciągu kilku godzin po jego pojawieniu się.Jeśli stan zwierzęcia pogorszy się w ciągu następnej godziny lub nie poprawi się w ciągu 48 godzin, uznaje się, że osiągnięto poziom nieznośnego cierpienia i przeprowadza się uśmiercanie. W tym przykładzie w pierwszym dniu operacji można to zaobserwować na próbce mózgu, skrzepy krwi wzdłuż dużych tętnic wielokąta Willisa u osoby z krwotokiem podpajęczynówkowym. W piątym dniu po operacji i przed ofiarą, międzynaczyniowe wstrzyknięcie indyjskiego atramentu pozwala na wykrycie makroskopowego skurczu naczyń odpowiadającego zwężeniu dużych tętnic móżdżkowych, Zabarwienie wycinków mózgu hematoksyliną i eozyną pozwala na pomiar skurczu naczyń mózgowych.Tutaj, jak pokazano na tej mikrofotografii fotograficznej, można zaobserwować skurcz naczyń tętnicy podstawnej. W tym modelu bezpośredniego wstrzykiwania krwi do cisterna magna wykazaliśmy ostatnio skurcz naczyń mózgowych dużych tętnic mózgowych, odkładanie się włókienek naczyniowych mózgu i apoptozę komórek, którym towarzyszą zmienione funkcje czuciowe, motoryczne i poznawcze u myszy. W ten sposób sprawia, że model ten jest walidowany i charakteryzowany dla krótkotrwałych i długotrwałych zdarzeń, po krwotoku podpajęczynówkowym.Powinien idealnie nadawać się do prospektywnej identyfikacji nowych celów oraz do badań nad skutecznymi strategiami terapeutycznymi przeciwko powikłaniom związanym z krwotokiem podpajęczynówkowym.

double-direct-injection-blood-into-cisterna-magna-as-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.

Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy

Aneuryzmalny krwotok podpajęczynówkowy (SAH) to krwawienie do przestrzeni podpajęczynówkowej następujące po pęknięciu tętniaka. Choć zapadalność i śmiertelność z powodu tego zdarzenia spadły dzięki lepszym metodom leczenia, ryzyko wystąpienia skurczu naczyń po krwotoku podpajęczynówkowym pozostaje na tym samym poziomie, co kilka lat temu. Znaczenie opracowania kompleksowego i powtarzalnego modelu zwierzęcego w celu zidentyfikowania zdarzeń inicjujących mózgowy skurcz naczyń było przedmiotem...

Model szczura o niskiej śmiertelności do oceny opóźnionego naczyniowego skurczu mózgu po eksperymentalnym krwotoku podpółczepkowym

Klinicznie istotne modele zwierzęce krwotoku wewnątrzczaszkowego (ICH) są niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat udaru krwotocznego oraz do badania nowych strategii terapeutycznych. W niniejszym badaniu opisujemy i oceniamy dwa modele ICH, w których stosuje się jednostronne wstrzyknięcia autologicznej krwi pełnej lub bakteryjnej kolagenazy do jąder podstawy (ciała prążkowanego) myszy.

Modelowanie krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy: wstrzykiwanie krwi autologicznej lub bakteryjnej kolagenazy

Ten film pokazuje procedurę ustanawiania modelu szczura krwotoku podpajęczynówkowego. Znieczulonemu szczurowi wszczepia się sondy do pomiaru ciśnienia śródczaszkowego i przepływu krwi w mózgu. Miejsce docelowe jest identyfikowane, a igła jest wprowadzana w pozycji wstępnej chiazmatycznej. Krew autologiczna jest następnie wstrzykiwana do przestrzeni podpajęczynówkowej, zwiększając ciśnienie śródczaszkowe i zmniejszając przepływ krwi w mózgu, ustanawiając model.

Ustalenie modelu szczurzego krwotoku podpajęczynówkowego wywołanego przez autologiczne wstrzyknięcie krwi

Źródło: Tang, X. et. al., Masywny krwotok z mostu przez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej. J. Vis. Exp. (2021)Ten protokół opisuje kontrolowaną infuzję autologicznej krwi do obszaru mostu mózgu szczura w celu modelowania masywnego krwotoku mostowego. Celem jest symulacja miejscowego krwawienia do mózgu poprzez zwiększenie miejscowego ciśnienia.

Wywoływanie masywnego krwotoku pontyńskiego w modelu szczurzym za pomocą autologicznego wstrzyknięcia krwi

Opisano standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego za pomocą wewnątrzświetlnego koła perforacji Willisa. Perforacja naczynia i krwawienie podpajęczynówkowe są monitorowane za pomocą monitorowania ciśnienia śródczaszkowego. Ponadto rejestrowane i kontrolowane są różne parametry życiowe w celu utrzymania warunków fizjologicznych.

Mysi model krwotoku podpajęczynówkowego

Eksperymentalny model krwotoku podpajęczynówkowego (SAH) z kontrolowanym ciśnieniem śródczaszkowym u królika łączy standardowe procedury — kaniulację tętnicy podobojczykowej i przezskórne nakłucie cisterna magna, co umożliwia dokładne naśladowanie ludzkich stanów patofizjologicznych po SAH. Przedstawiamy instrukcje krok po kroku i omawiamy kluczowe punkty chirurgiczne dla udanego eksperymentalnego tworzenia SAH.

Model przetoczkowy krwi królika do badania ostrych i późnych następstw krwotoku podpajęczynówkowego: aspekty techniczne

Przedstawiamy protokół do stworzenia modelu masywnego krwotoku pontine u szczura poprzez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej.

Masywny krwotok mostowy przez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej

Krwotok pajęczynówkowy nadal niesie ze sobą duże obciążenie śmiertelnością i zachorowalnością u człowieka. Aby ułatwić dalsze badania nad schorzeniem i jego patofizjologią, przedstawiono model prechiazmatycznego pojedynczego wstrzyknięcia.

Przedchiazmatyczne, pojedyncze wstrzyknięcie autologicznej krwi w celu wywołania eksperymentalnego krwotoku podpajęczynówkowego w modelu szczurzym

Tutaj prezentujemy standaryzowany model myszy SAH, indukowany przez wewnątrznaczyniową perforację filamentu, w połączeniu z obrazowaniem metodą rezonansu magnetycznego (MRI) 24 godziny po operacji, aby zapewnić prawidłowe miejsce krwawienia i wykluczyć inne istotne patologie wewnątrzczaszkowe.

Model perforacji wewnątrznaczyniowej krwotoku podpajęczynówkowego w połączeniu z obrazowaniem metodą rezonansu magnetycznego (MRI)

Poznaj model krwotoku podpajęczynówkowego u myszy poprzez podwójne wstrzyknięcie krwi do cisterna magna. Ta metoda umożliwia kontrolę rozlewu krwi i badanie nowych celów terapeutycznych w neurochirurgii.

Podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do Cisterna Magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego

Przeglądaj więcej filmów