Podwójne bezpośrednie wstrzyknięcie krwi do Cisterna Magna jako model krwotoku podpajęczynówkowego

Ogólnym celem tego filmu jest wyjaśnienie protokołu podwójnego bezpośredniego wstrzyknięcia krwi do cisterna magna jako modelu krwotoku podpajęczynówkowego. Fizjologia krwotoku podpajęczynówkowego jest często spowodowana pęknięciem tętniaka. Najpierw przeprowadzamy wynaczynienie krwi do przedziału między mózgiem a tkanką pokrywającą mózg

Ten przedział jest przestrzenią podpajęczynówkową. Krwotok podpajęczynówkowy stanowi do 7% wszystkich przypadków strajków. Śmiertelność waha się od 30 do 50% w badaniach populacyjnych, a osoby, które przeżyły krwotok podpajęczynówkowy, często doświadczają następstw poznawczych, takich jak deficyty pamięci, osłabienie lub zaburzenia nastroju.

Główną przyczyną częstego występowania złych wyników jest niedokrwienie mózgu. Badania wykazały związek między występowaniem niedokrwienia w zwężeniu naczyń krwionośnych dużych tętnic mózgowych, zwanym mikroskopijnym skurczem naczyń, który można wykryć u większości pacjentów między czwartym a piętnastym dniem po pierwszym wzdęciu. Ze względu na nieskuteczność obecnych opcji terapeutycznych istnieje oczywista medyczna potrzeba lepszego zrozumienia zdarzeń patologicznych.

Towarzyszący krwotok podpajęczynówkowy i nowe cele terapeutyczne powinny być testowane, ale wymaga to zróżnicowanych i ustandaryzowanych modeli zwierzęcych. Pęknięcie tętniaka międzyczaszkowego, głównie odpowiedzialnego za krwotok podpajęczynówkowy u ludzi, jest prawdopodobnie trudne do stworzenia modeli przedklinicznych i ludzkich. U zwierząt główne trudności dotyczą kontrolnej częstości występowania krwotoku i dystrybucji krwi, ale ostatnie badania koncentrują się na opracowaniu bardziej dedykacyjnych modeli krwotoku podpajęczynówkowego.

Poniżej przedstawiono znormalizowany mysi model dwóch kolejnych wstrzyknięć autologicznej krwi tętniczej z naszych dwóch dni do cisterna magna. Główne zalety tego modelu to powtarzalne opanowanie nieinwazyjnego zabiegu chirurgicznego, dostosowanie jakości i ilości wstrzykiwanej krwi oraz wzmocnienie krwawienia bez drastycznego wzrostu ciśnienia śródczaszkowego. Przed rozpoczęciem operacji należy założyć kolejną dużą liczbę szklanych naczynek za pomocą ściągacza do mikropipet.

Pipeta iniekcyjna powinna mieć średnicę wewnętrzną 0,86 milimetra i średnicę zewnętrzną 0,5 milimetra. Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do stanu pozorowanego, jak wskazano w pisemnym protokole. Musisz zdać sobie sprawę z tego, że jest to natleniony sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z aparatem filtrującym o wielkości 0,22 mikrona.

Pierwszym krokiem naszego modelu krwotoku podpajęczynówkowego jest izolacja tętnicy szyjnej wzdłuż tchawicy i pobranie maksimum krwi z nakłucia tętnicy szyjnej. Po znieczuleniu izofluranem należy sprawdzić brak odruchów, zaciskając jedną lub dwie kończyny tylne, aby umożliwić ustawienie procedury eksperymentalnej. Zakoduj strzykawkę o średnicy jednego milimetra za pomocą igły o rozmiarze 26.

Zapobiegnie to krzepnięciu krwi podczas kolejnych kroków. Zważ każdą mysz precyzyjnie za pomocą wagi elektronicznej. W obecnym badaniu myszy miałyby masę ciała w zakresie od 20 do 25 gramów tuż przed operacją.

Jak wyjaśniono wcześniej, indukowane znieczulenie operowanej myszy, a następnie golenie szyi i przestrzeni między każdym uchem za pomocą odpowiedniej elektrycznej maszynki do strzyżenia. Sprawdź, czy mysz jest uśpiona, a głowa myszy jest dobrze zablokowana. Wstrzyknąć podskórnie 100 mikrolitrów buprenorfiny w dawce 0,1 miligrama na kilogram za pomocą igły o rozmiarze 26 w dolnej części pleców, aby uniknąć bólu po przebudzeniu.

Zapobiegaj suchości oczu za pomocą ochronnego płynnego żelu i utrzymuj temperaturę wewnątrzprzewodową 37 stopni za pomocą automatycznie regulowanego koca elektrycznego. Przed potraktowaniem ogolonego obszaru roztworem antyseptycznym wszystkie narzędzia mające kontakt z tkanką zostały wysterylizowane i traktowane w sposób aseptyczny. Pierwszego dnia wytnij jednocentymetrowe nacięcie w tylnej części szyi, a następnie rozdziel mięśnie wzdłuż linii środkowej, aby uzyskać dostęp do cisterna magna.

Odetnij końcówkę pustej szklanej pipety cienkimi nożyczkami. Następnie dostosuj do strzykawki podłączonej do elastycznego silikonowego łącznika. Następnie przenieś 60 mikrolitrów krwi lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w probówce o pojemności 0,5 mililitra za pomocą precyzyjnej mikropipety Zassaj do szklanej pipety 60 mikrolitrów krwi w przypadku krwotoku podpajęczynówkowego lub 60 mikrolitrów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w przypadku stanu pozorowanego.

Do wstrzykiwania należy umieścić pipetę na ramce stereotaktycznej za pomocą np. naszego pierścienia A lub a i powoli zbliżyć końcówkę pipety do membrany na styku z cisterna magna. Powoli wprowadzić końcówkę pipety przez błonę atlanto-potyliczną do cisterna magna za pomocą mikromanipulatora ramy stereotaktycznej. Podłączyć pipetę do wcześniej napełnionej strzykawki, gotowej do indukcji ciśnieniowej.

Wstrzykiwać pod ciśnieniem z niską szybkością około 10 mikrolitrów na minutę, aby uniknąć ostrego nadciśnienia śródczaszkowego. Podczas wstrzykiwania należy ściśle monitorować częstość oddechów i temperaturę w odbycie. Po zakończeniu iniekcji należy ostrożnie zdjąć pipetę za pomocą mikromanipulatora i upewnić się, że podczas pobierania nie ma wycieku.

Osiągnij homeostazę i wykonaj dwa szwy z plecionką, niewchłanialną nicią do szycia. Bezpośrednio po zabiegu należy odizolować i ustawić mysz w zmniejszającym się odleżynie i przykryć kocem ratunkowym w otwartym pudełku na czas rekonwalescencji. Po 24 godzinach ponownie wywołaj znieczulenie, zainstaluj mysz na ramie stereotaktycznej jak dzień wcześniej i ostrożnie usuń szwy mikronożyczkami.

Przygotować jak poprzednio aseptyczną błonę atlanto-potyliczną, nakładając na ogolony obszar i aseptyczny roztwór za pomocą bawełnianego pręta. Wstrzyknąć, tak jak dzień wcześniej, 30 mikrolitrów krwi lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w niewielkiej dawce. Jak już wspomniano, monitoruj częstość oddechów i temperaturę w odbycie.

Pod koniec wstrzyknięcia ostrożnie zdejmij pipetę i sprawdź, czy podczas pobierania krwi nie ma wycieku. Osiągnij homeostazę i wykonaj dwa szwy za pomocą plecionej wchłanialnej nici do szycia. Od pierwszego dnia po operacji do dnia złożenia ofiary, masa ciała powinna być codziennie oceniana jako czuły wskaźnik ogólnego samopoczucia.

Wykazano znacznie zmniejszony przyrost masy ciała w krwotoku podpajęczynówkowym w porównaniu ze zwierzętami pozorowanymi, co sugeruje długotrwały proces odzyskiwania aktywności i przedłużone zdarzenia patologiczne po krwotoku podpajęczynówkowym. Dlaczego śmiertelność nie jest w stanie pozorowanym? Śmiertelność wynosi blisko 30% w siódmym dniu w stanie krwotoku podpajęczynówkowego, przy czym większość zwierząt umiera w pierwszym lub czwartym dniu po operacji.

Wśród humanitarnych punktów końcowych odnotowuje się znaczną utratę masy ciała przekraczającą 15% masy początkowej. Zgarbiona postawa, powolne ruchy, rany, nieprawidłowe wokalizacje lub znaczna agresja są również oznakami, że zwierzę cierpi. Jeśli pojawi się którykolwiek z tych objawów lub kombinacja objawów, śledzenie zwierzęcia zostanie wzmocnione w ciągu kilku godzin po jego pojawieniu się.

Jeśli stan zwierzęcia pogorszy się w ciągu następnej godziny lub nie poprawi się w ciągu 48 godzin, uznaje się, że osiągnięto poziom nieznośnego cierpienia i przeprowadza się uśmiercanie. W tym przykładzie w pierwszym dniu operacji można to zaobserwować na próbce mózgu, skrzepy krwi wzdłuż dużych tętnic wielokąta Willisa u osoby z krwotokiem podpajęczynówkowym. W piątym dniu po operacji i przed ofiarą, międzynaczyniowe wstrzyknięcie indyjskiego atramentu pozwala na wykrycie makroskopowego skurczu naczyń odpowiadającego zwężeniu dużych tętnic móżdżkowych, Zabarwienie wycinków mózgu hematoksyliną i eozyną pozwala na pomiar skurczu naczyń mózgowych.

Tutaj, jak pokazano na tej mikrofotografii fotograficznej, można zaobserwować skurcz naczyń tętnicy podstawnej. W tym modelu bezpośredniego wstrzykiwania krwi do cisterna magna wykazaliśmy ostatnio skurcz naczyń mózgowych dużych tętnic mózgowych, odkładanie się włókienek naczyniowych mózgu i apoptozę komórek, którym towarzyszą zmienione funkcje czuciowe, motoryczne i poznawcze u myszy. W ten sposób sprawia, że model ten jest walidowany i charakteryzowany dla krótkotrwałych i długotrwałych zdarzeń, po krwotoku podpajęczynówkowym.

Powinien idealnie nadawać się do prospektywnej identyfikacji nowych celów oraz do badań nad skutecznymi strategiami terapeutycznymi przeciwko powikłaniom związanym z krwotokiem podpajęczynówkowym.