Name: Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj metodę kolorymetryczną do kwantyfikacji spożycia pokarmu u larw Drosophila melanogaster w badaniach termogenetycznych. Protokół umożliwia identyfikację populacji neuronowych kontrolujących wybór makroskładników odżywczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC) za udostępnienie nam części eksperymentalnego sprzętu opisanego w tym protokole. Prace te były wspierane przez Portugalską Fundację na rzecz Nauki i Technologii (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 i La Caixa HR17-00595 na rzecz PMD oraz przez stypendium Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259) na rzecz CKM.

1. Przygotowanie diety sacharozowo-drożdżowej (SY)
<ol>
	<li>Zważ wszystkie suche składniki (agar, drożdże, sacharoza) do zrównoważenia makroskładników odżywczych i diety hodowlanej L3. Ilości w gramach dla każdego ze składników potrzebnych do przygotowania 1 litra żywności są wskazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. 
	UWAGA: Weź pod uwagę, że do napełnienia szalki Petriego o średnicy 60 mm potrzeba około 13 ml pokarmu.</li>
	<li>Rozpuść wszystkie składniki w sterylnej wodzie destylowanej (użyj około 50% całkowitej objętości wody potrzebnej do przygotowania potrawy) i mieszaj podłoże przez 5-10 min.</li>
	<li>Autoklaw przez 50 min.</li>
	<li>Po pozostawieniu pożywek do ostygnięcia, dodaj do diety roztwory nipaginy i kwasu propionowego o końcowym stężeniu (v/v) odpowiednio 3% i 0,3%. Do diet równoważących makroskładniki odżywcze dodaj niebieski barwnik spożywczy do końcowego stężenia (v/v) 1%. Uzupełnij całkowite objętości wodą destylowaną.</li>
	<li>Ostrożnie wlej diety spożywcze na szalki Petriego o średnicy 60 mm, tak aby ilość wlanego pokarmu była w przybliżeniu taka sama na każdej z płytek. Oznacz talerze stosunkami P:C diet. 
	UWAGA: Przygotuj diety równoważące makroskładniki odżywcze w dniu testu karmienia. Jeśli nie jest to możliwe, przygotowane diety należy przechowywać w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętym pojemniku przez okres nie dłuższy niż 3 dni. Dłuższe okresy przechowywania sprawiają, że dieta jest zbyt sucha i twarda, a larwy nie mogą zakopać się w podłożu.</li>
</ol>
2. Krzyżówka genetyczna linii rodzicielskich
UWAGA: Użyj systemu Gal4/UAS21, aby skonfigurować krzyżówki genetyczne. W tym protokole, w celu aktywacji funkcji neuronalnych w określonych populacjach neuronów, wykorzystano dziewicze samice UAS dTRPA1 line17 i skrzyżowano je z samcami z linii Janelia Gal4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Zastosowana kontrola genetyczna była potomstwem krzyżówki linii dTRPA1 i "pustej linii GAL4", która przenosi Gal4 w wektorze użytym do wygenerowania kolekcji Rubin Gal4, ale bez obecnego fragmentu regulatorowego (attP2)22. Aby promować tłumienie neuronów, zamiast dTRPA1 można użyć linii UAS kodującej ShibireTS20.
<ol>
	<li>Ustaw klatki do pobierania zarodków o średnicy 60 mm z płytkami diety hodowlanej L3, uzupełnionymi aktywną pastą drożdżową.</li>
	<li>Przenieś dorosłe dziewicze samice UAS dTRPA1 i samce Janelia Gal4 w wieku 5-8 dni do klatek do pobierania zarodków i pozwól na krycie przez 24-48 godzin, w temperaturze 25 °C, przy wilgotności 60% i cyklu jasno-ciemnym 12:12 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). W przypadku klatek do pobierania zarodków o średnicy 60 mm należy użyć około 100 dziewiczych samic i 30 samców na krzyżówkę.</li>
	<li>Pod koniec okresu krycia należy usunąć i wyrzucić płytki diety L3 używane w krzyżówkach genetycznych. Zastąp je świeżymi płytkami z dietą odchowu L3 w celu przeprowadzenia składania jaj i oceny stanu larw.</li>
</ol>
3. Przygotowanie larw trzeciego stadium rozwojowego (L3)
<ol>
	<li>Przenieść pokryte dorosłe muchy na świeże płytki z dietą odchowu L3 i pozwolić na składanie jaj przez 3-4 godziny, w temperaturze 25 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Upewnij się, że wszystkie płytki są oznaczone genotypem, stosunkiem P:C diety i datą złożenia jaj. 
	UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, składanie jaj należy wykonywać bezpośrednio w paszy odchowawczej L3, co pozwala uniknąć dodatkowego obchodzenia się z jajami. W przypadku badań genetycznych na małą skalę, optymalizację składania jaj można uzyskać poprzez zastosowanie płytek agarowych z sokiem jabłkowym.</li>
	<li>Pod koniec okresu składania jaj wyjmij talerze z klatek i przykryj je plastikowymi pokrywkami. W przypadku, gdy ekstrakt drożdżowy jest używany do uzupełnienia płytek odchowawczych L3, należy upewnić się, że wszystkie resztki drożdży zostały usunięte pod koniec składania jaj. Jest to ważne, aby uniknąć nierównomiernego żerowania podczas wzrostu larw. 
	UWAGA: Kryte dorosłe osobniki można przenieść na świeże płytki z dietą odchowową L3, dzięki czemu przeprowadza się więcej składania jaj i można uzyskać więcej eksperymentalnych larw. Kolejne składanie jaj może odbywać się z tymi samymi dorosłymi osobnikami w ciągu jednego tygodnia roboczego.</li>
	<li>Oszacuj liczbę jaj na płytce i utrzymuj gęstość larw na maksymalnie 200 zarodków na płytce. Oszacowanie to można przeprowadzić, licząc liczbę zarodków w jednej czwartej płytki. 
	UWAGA: Przepełniona płytka opóźni rozwój larw i wpłynie na zachowania żywieniowe larw.</li>
	<li>Inkubuj płytki hodowlane L3 w temperaturze 18 °C (dopuszczalna temperatura), wilgotności 60% i cyklu 12:12 jasno-ciemność i pozwól larwom rosnąć przez 9 dni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Dziewiątego dnia po złożeniu jaj (AEL) zebrać trzy grupy po 10 L3 z każdego z genotypów (oraz dla kontrprób), które mają zostać poddane badaniu. Dodatkowo zbierz grupy po 10 L3 do kontroli "żywności bez barwnika". Upewnij się, że pobieranie larw odbywa się w równoważnych porach dnia wykorzystywanych do składania jaj (np. jeśli składanie jaj miało miejsce między 10 a 14, zbierz larwy w tym samym okresie 9 dni AEL) i jest wykonywane, tak delikatnie, jak to możliwe, za pomocą kleszczy #5 lub kleszczy do wagi piórkowej. Bezpośrednio przenieść larwy, jak wskazano w następnym kroku (3.6). 
	UWAGA: Zwierzęta kontrolne "pokarm o zerowym barwniku" to larwy, które w teście żywieniowym otrzymują pokarm bez niebieskiego barwnika. Kontrola ta jest niezbędna do usunięcia absorbancji tła ekstraktów larwalnych.</li>
	<li>Przenieś zebrane larwy doświadczalne do plastikowych naczyń zawierających 1 ml wody. Upewnij się, że zbierane są L3, a nie L2, postępując zgodnie ze wskazówkami podanymi w Rysunek 3. 
	UWAGA: Zbieranie L3 do plastikowych łodzi zawierających wodę lub 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) jest ważne, aby utrzymać larwy dobrze nawodnione przed rozpoczęciem testu karmienia. Jest to szczególnie ważne, jeśli w tym samym czasie pobieranych jest kilka eksperymentalnych grup L3 z różnych genotypów. Śledź kolejność odbioru dla każdej grupy, aby zminimalizować różnice w czasie trwania deprywacji żywności dla każdej grupy. Użycie plastikowych łódek na tym etapie ułatwia opcjonalny krok 4.3, ponieważ umożliwia larwom unoszenie się bezpośrednio do łaźni wodnej.</li>
</ol>
4. Aktywacja termogenetyczna i test żywienia bez wyboru
UWAGA: Zaleca się przeprowadzanie testów żywieniowych mniej więcej o tej samej porze dnia, aby zminimalizować możliwe różnice związane z rytmem okołodobowym. Ponadto zawsze przeprowadzaj eksperymenty kontrolne (potomstwo linii "pustej Gal4" skrzyżowane z UAS dTRPA1 i larwy "bezbarwnego pokarmu"), równolegle z interesującymi genotypami.
<ol>
	<li>Ustawić inkubator na 30 °C (temperatura niedopuszczalna) i utrzymywać wysoki poziom wilgotności (co najmniej 65%), aby uniknąć odwodnienia larw podczas testu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem oznaczania karmienia należy zrównoważyć temperaturę płytek testowych, ogrzewając je w temperaturze 30 °C przez 30 minut.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Szok termiczny eksperymentalnych larw przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C. Wykonaj ten krok ze zwierzętami w plastikowych łodziach z balastem zawierających trochę wody. 
	UWAGA: Celem tego etapu jest intensyfikacja aktywacji neuronów poprzez promowanie wypalania neuronów od początku testu karmienia.</li>
	<li>Trzymaj w pogotowiu wiele timerów na 1 godzinę. Liczba timerów, które należy zastosować, zależy od liczby badanych grup eksperymentalnych oraz od poziomu umiejętności eksperymentatora w obchodzeniu się z larwami. 
	UWAGA: Użycie wielu timerów ma kluczowe znaczenie dla utrzymania spójnego czasu trwania testu dla wszystkich genotypów.</li>
	<li>Ostrożnie spuść wodę z plastikowych łódek i za pomocą zwilżonej miękkiej szczotki delikatnie przenieś grupy L3 z łodzi na środek płytek testowych. Załóż pokrywki talerzy z powrotem i uruchom minutnik dla każdej płytki (lub grupy talerzy), aby utrzymać dokładne 1-godzinne sesje karmienia.</li>
	<li>Pozwól larwom żerować przez 1 godzinę, w temperaturze 30 °C, w ciemności (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Wydajność testu w ciemności jest ważna dla kontrolowania różnic w sygnałach wizualnych w różnych dietach, ponieważ diety będą różnić się tonami, nawet jeśli zawierają takie samo stężenie barwnika.</li>
	<li>Przerwij test karmienia, przenosząc płytki do łaźni lodowej. Dociśnij lód tak mocno, jak to możliwe, aby zapewnić stabilną powierzchnię dla talerzy. 
	UWAGA: Niskie temperatury będą sprzyjać końcowi karmienia, hamując zachowania związane z kopaniem i kopaniem. Większość larw po kilku minutach wynurzy się na talerze z jedzeniem, ułatwiając ich powrót do zdrowia w kolejnych krokach.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja barwnika spożywczego
<ol>
	<li>Przygotuj 2 ml mikroprobówek dla każdej grupy 10 badanych L3, zawierających w przybliżeniu taką samą ilość szklanych kulek o średnicy 0,5 mm (wystarczającą do wypełnienia dolnej części mikroprobówki) i 300 μl lodowatego metanolu. Trzymaj mikroprobówki w chłodzie, używając chłodziarki stołowej. 
	UWAGA: Metanol jest wysoce łatwopalny i toksyczny. Postępuj zgodnie ze wszystkimi procedurami bezpieczeństwa zalecanymi do obchodzenia się z tym odczynnikiem, w tym pracy w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i noszenia rękawic nitrylowych. 
	UWAGA: Stosowanie metanolu jest ważne dla utrwalenia próbek larw i uniknięcia reakcji melanizacji w naskórku.</li>
	<li>Używając #5 lub kleszczy do masek piórkowych, ostrożnie odzyskaj grupy 10 L3 z płytek testowych do karmienia i przenieś je na pokrywki płytek testowych zawierających trochę wody. Opłucz larwy, aby usunąć wszelkie resztki jedzenia z ich ciał, jednocześnie delikatnie dotykając larw, aby uniknąć obrażeń. Prowadzi się zapis liczby odzyskanych larw dla każdego genotypu na kontrpróbę, tak aby można było określić ilościowo średnią ilość pokarmu pobranego przez larwę. 
	UWAGA: Zranione larwy należy wyrzucić, ponieważ będą miały melanizowany naskórek, który nie nadaje się do kwantyfikacji kolorymetrycznej.</li>
	<li>Przenieść grupy L3 do mikroprobówek o objętości 2 ml przygotowanych w 5.1.</li>
	<li>Poddać lizie tkanki larwalne w celu wyekstrahowania barwnika pokarmowego z jelit metodą lizy mechanicznej przy użyciu lizera tkankowego i szklanych kulek dodanych w kroku 5.1. (Jeśli lyzer tkankowy nie jest dostępny, użyj tłuczka homogenizującego). Preferencyjnie wykonaj ten krok w temperaturze 4 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Czas trwania tego kroku będzie zależał od używanego sprzętu. Przy użyciu konwencjonalnego lizera tkankowego wystarczająca jest 1 minuta ekstrakcji. W przypadku ograniczeń czasowych protokół może zostać wstrzymany na końcu tego kroku i kontynuowany później. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przenieś ekstrakty do czystych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, bezpośrednio odwracając mikroprobówki o pojemności 2 ml na nowe mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli zostanie to wykonane delikatnie, większość szklanych kulek pozostanie na dnie mikroprobówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Usunąć resztki komórkowe, odwirowując ekstrakty, z maksymalną prędkością przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatanty do oczyszczenia mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Jeśli szczątki komórkowe są nadal widoczne w supernatantach, powtórz kroki 5.6 i 5.7.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja kolorymetryczna spożycia żywności
<ol>
	<li>Przygotować roztwory wzorcowe w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej, wykonując seryjne rozcieńczenia 1:2 w metanolu wyjściowego roztworu niebieskiego barwnika. Jako ślepą próbę należy używać tylko metanolu. Stężenie norm zależy od poziomu spożycia pokarmu przez zwierzęta. 
	UWAGA: W przypadku prezentowanego tu ekranu pilotażowego, ze względu na to, że stężenia barwnika uzyskane dla ekstraktów larwalnych mieściły się w zakresie od 0,02 do 1,93 μL/ml, zastosowano krzywą wzorcową uzyskaną poprzez pomiar absorbancji 8 seryjnych rozcieńczeń roztworu barwnika niebieskiego o stężeniu 2 μL/ml w metanolu. W razie potrzeby zwiększyć lub zmniejszyć stężenie tych roztworów, w zależności od stężenia barwnika w próbkach doświadczalnych.</li>
	<li>Przenieść 100 μl próbek doświadczalnych (otrzymanych w kroku 5.7), wzorców i ślepej próby (krok 6.1) do dołków 96-dołkowej mikropłytki i zmierzyć absorbancję przy 600 nm, używając czytnika płytek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E). Aby usunąć absorbancję tła, należy zmierzyć absorbancję ekstraktów otrzymanych od larw karmionych pokarmem bez niebieskiego barwnika jako "zero" dla ekstraktów z larw ("kontrola żywności bez barwnika").</li>
	<li>Wygeneruj krzywą wzorcową i skoreluj wartości absorbancji uzyskane dla próbek z każdej doświadczalnej grupy larwalnej z ilością pobranego pokarmu (objętość w ml). Znajdź średnie spożycie pokarmu na larwę, biorąc pod uwagę liczbę larw zebranych dla każdej grupy w kroku 5.2</li>
</ol>

<ol><li>Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaubenheimer%2C+D+%22Nature+of+nutrition+-+a+unifying+framework+from+animal+adaptation+to+human%22">Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human</a>. , (2012).</li>
<li>Carvahlo, M. J. a, Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+morphology+with+behavior+during+development%3A+an+integrative+approach+from+a+fly+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).</li>
<li>Steck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+amino+acid+state+modulates+yeast+taste+neurons+to+support+protein+homeostasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila.</a> Elife. 7, 31625(2018).</li>
<li>Itskov, P. M., Ribeiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dilemmas+of+the+gourmet+fly%3A+the+molecular+and+neuronal+mechanisms+of+feeding+and+nutrient+decision+making+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila.</a> Frontiers in Neuroscience. 7, 12(2013).</li>
<li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li>
<li>Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+imbalance+explains+extension+of+lifespan+by+dietary+restriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila.</a> Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).</li>
<li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila%3A+New+insights+from+nutritional+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).</li>
<li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+protein+intake+is+associated+with+a+major+reduction+in+IGF-1%2C+cancer%2C+and+overall+mortality+in+the+65+and+younger+but+not+older+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).</li>
<li>Solon-Biet, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+macronutrients%2C+not+caloric+intake%2C+dictates+cardiometabolic+health%2C+aging%2C+and+longevity+in+ad+libitum-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).</li>
<li>Piper, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li>
<li>Jones, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+reach+of+the+GAL4%2FUAS+system+into+the+behavioral+neurobiology+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila.</a> BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).</li>
<li>Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+drug+screening+in+Drosophila+identifies+the+5HT2A+receptor+as+a+feeding+modulation+target%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target.</a> Scientific Reports. 3, (2013).</li>
<li>Schoofs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+motor+programs+for+suppressing+food+intake+and+inducing+locomotion+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain.</a> PLoS Biology. 12 (6), 1001893(2014).</li>
<li>Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+does+diet+matter%3F+The+roles+of+larval+and+adult+nutrition+in+regulating+adult+size+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. , 104051(2020).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).</li>
<li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+control+of+Drosophila+courtship+song%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Motor control of Drosophila courtship song.</a> Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).</li>
<li>Mirth, C. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+intake+and+food+choice+are+altered+by+the+developmental+transition+at+critical+weight+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).</li>
<li>Simpson, S. J., Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+the+protein+leverage+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Obesity: the protein leverage hypothesis.</a> Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).</li>
<li>Raubenheimer, D., Simpson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+models+of+nutrient+balancing%3A+application+to+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates.</a> Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).</li>
<li>Li, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).</li>
<li>Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062(2013).</li>
<li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li>
<li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ol1mpiad%3A+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, Pt 13 2452-2475 (2017).</li>
<li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li>
<li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+food+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063(2009).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li>
<li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li>
<li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki temu protokołowi można przetestować zdolność larw pod wpływem aktywacji termogenetycznej określonych populacji neuronów do regulowania poziomu spożycia białka i węglowodanów, dwóch głównych makroskładników, po wystawieniu na dietę o różnym składzie P:C. Metoda ta została przetestowana w kontekście wstępnych badań przesiewowych larw, których celem była identyfikacja populacji neuronów związanych z kontrolą spożycia pokarmu w dietach o różnej jakości makroskładników. Praca ta przyczynia się również do wykazania, że ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1 was updated from:
<img alt="Macronutrient balancing chart and table; protein-carbohydrate ratios in L3 larvae diets, experiments." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Protein-carbohydrate ratio chart, diet composition graph for L3 larvae, macronutrient quantification." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Wszystkie zwierzęta polegają na zbilansowanej diecie, aby zdobyć niezbędne ilości składników odżywczych do przetrwania, wzrostu i reprodukcji1. Na wybór tego, co i ile jeść, wpływa wiele czynników związanych ze stanem wewnętrznym zwierzęcia, takich jak poziom sytości i warunki środowiskowe, takie jak jakość jedzenia2,3,4,5. Białko i węglowodany to dwa główne makroskładniki, a ich zbilansowane spożycie jest niezbędne do podtrzymania procesów fizjologicznych zwierząt. Dlatego zrozumienie mechanizmów neuronalnych kontrolujących zachowania żywieniowe i utrzymanie zrównoważonego spożycia tych makroskładników odżywczych jest niezwykle istotne. Dzieje się tak, ponieważ na cechy historii życia, takie jak długość życia, płodność i zdrowie metaboliczne, bezpośredni wpływ ma poziom spożycia białka6,7,8,9,10.
Wykorzystanie prostszych, łatwiejszych do opanowania organizmów, które wykazują ewolucyjnie zachowane nawyki żywieniowe ze złożonymi zwierzętami, w tym ssakami, jest niezbędne dla tego typu badań. Co ważne, te prostsze modele zwierzęce stanowią dobrą okazję do analizy złożonych zagadnień biologicznych w kosztownym, etycznie i technicznie bardziej efektywnym kontekście. W ostatnich dziesięcioleciach Drosophila, ze swoim potężnym zestawem narzędzi genetycznych, skomplikowanym i stereotypowym zachowaniem oraz zachowaną architekturą obwodowych i odżywczych mechanizmów wyczuwania składników odżywczych u ssaków, była owocnym modelem dla neurobiologów behawioralnych11. Ostatecznie mamy nadzieję, że dzięki zrozumieniu, w jaki sposób przyjmowanie pokarmu jest regulowane u tego zwierzęcia, z prostszym układem nerwowym, będziemy mogli zacząć rozplątywać nieprawidłowości neuronalne leżące u podstaw zaburzeń odżywiania u ludzi.
Badanie substratów neuronalnych do zachowań żywieniowych jest głęboko uzależnione od możliwości jednoczesnego mierzenia spożycia pokarmu przez zwierzęta przy jednoczesnym manipulowaniu ich aktywnością neuronalną. Ze względu na minimalne ilości spożywanego pokarmu, ilościowe określenie ilości pokarmu spożywanego przez muchy jest niezwykle trudne, a wszystkie obecnie dostępne metody mają znaczne ograniczenia. W związku z tym złotym standardem jest stosowanie kombinacji uzupełniających się metodologii12. Dorosłe muchy były historycznie faworyzowane jako model genetyczny i behawioralny. Niemniej jednak, larwy Drosophila oferują również możliwości badania substratów neuronalnych kodujących zachowania żywieniowe. Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) larwalny, składający się z około 12 000 neuronów, jest znacznie mniej złożony niż u dorosłego osobnika, który zawiera około 150 000 neuronów. Ta mniejsza złożoność jest nie tylko liczbowa, ale także funkcjonalna, ponieważ zachowania larw opierają się na prostszych funkcjach lokomotywy i systemach sensorycznych. Pomimo pozornej prostoty ich układu nerwowego, larwy nadal wykazują pełne zachowania żywieniowe, a niektóre metody ilościowego określania spożycia pokarmu u larw Drosophila zostały opisane5,13,14,15. Łącząc się z manipulacjami aktywności neuronalnej, larwy Drosophila mogą stanowić bardzo podatny model do zrozumienia neuronalnej regulacji przyjmowania pokarmu.
Dostępny tutaj jest szczegółowy protokół ilościowego określania spożycia pokarmu przez larwy narażone na diety o różnej jakości makroskładników. Diety, tak zwane diety równoważące makroskładniki, różniły się zawartością białka i węglowodanów, szczególnie w odniesieniu do stosunku białka do węglowodanów (P:C): 1:1 (dieta bogata w białko), 1:4 (dieta pośrednia) i 1:16 (dieta uboga w białko), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Krótko mówiąc, ustalono ilościowy test żywienia bez wyboru przy użyciu tych trzech diet opartych na izokalorycznych drożdżach sacharozowych (SY) barwionych niebieskim barwnikiem spożywczym. Ponieważ ekstrakt drożdżowy i sacharoza były używane jako źródła białka i węglowodanów, a oba zawierają węglowodany, różnice w proporcjach P:C uzyskano poprzez zmianę równowagi tych dwóch składników, jak opisano wcześniej16 i jak wskazano w Rysunek 1B. Schematyczny przegląd protokołu, pokazujący główne etapy eksperymentalne, jest dostępny w Rysunek 2.
Ten protokół został stworzony w celu zbadania roli określonych populacji neuronów w regulacji poziomu pokarmu larw w dietach o różnych proporcjach P:C oraz w kontekście termogenetycznego badania przesiewowego neuronów. Wykorzystano dobrze scharakteryzowane narzędzie neurogenetyczne z rodziny TRP (Transient Receptor Potential): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), który jest kanałem kationowym bramkowanym temperaturą i napięciem, umożliwiającym wyzwalanie potencjałów czynnościowych, gdy temperatura otoczenia wzrośnie powyżej 25 °C17. Aby uzyskać ekspresję transgenu dTRPA1, wykorzystaliśmy linie Gal4 oparte na regionach cis-regulatorowych z genomu Drosophila, ustalonych w laboratorium Rubin, w kontekście projektu FlyLight w Janelia Research Campus18,19.
Chociaż opisany tutaj protokół został ustalony w kontekście ekranu aktywacji, może być łatwo dostosowany przez eksperymentatora do innych konkretnych potrzeb lub zainteresowań, a mianowicie do przeprowadzenia ekranu tłumienia za pomocą wrażliwego na temperaturę tłumika neuronów ShibireTS20, jako alternatywa dla dTRPA1. Ta i inne adaptacje są omówione w sekcjach protokołu i dyskusji.

<table><tbody><tr><td>Mikroprobówki 1,5 ml</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>10xPBS</td><td>Nytech</td><td>MB18201</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml mikroprobówki</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalki Petriego</td><td>Greiner Bio-one, Austria</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe mikropłytki</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-204453</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pr&oacute;-vida, Portugalia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chłodziarka stołowa</td><td>Nalgene, USA</td><td>Labtop Cooler 5115-0032</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski barwnik spożywczy</td><td>Rayner, Billingshurst, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do rozbijania komórek</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>888-850-6208</td> <td>(koraliki szklane 0,5 mm)</td></tr><tr><td>Łodzie do naczyń</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-201606</td><td></td></tr><tr><td>Klatka do pobierania zarodków na szalki Petriego 60 mm</td><td>Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, Wielka Brytania</td><td>FLY1212 (59-100)</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze piórkowe</td><td>BioQuip Products, USA</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>Pokarm na muchy do konserwacji</td><td></td><td></td> <td>zapasów1 l karmy zawiera: 10 g agaru, 100 g ekstraktu drożdżowego, 50 g sacharozy, 30 ml nipaginu, 3 ml kwasu propionowego</td></tr><tr><td>Kleszcze #5</td><td>Dumont</td><td>0108-5-PS</td><td>Standardowe końcówki, INOX, 11cm</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>LMS Ltd, UK</td><td>Series 2, Model 230</td><td>Do termogenetycznego testu żywieniowego (30? C)</td></tr> <tr><td>Inkubator</td><td>Percival Scientific, USA</td><td>DR36NL</td><td>Do etapowania larw (19? C)</td></tr> <tr><td>Linie Janelia</td> Kampus <td></td><td>Badawczy Janelia</td><td>Szczegółowe informacje w Tabeli 2</td></tr><tr>Diety <td></td><td></td><td>równoważące makroskładniki Skład</td><td>i informacje o wartości odżywczej na rysunku 1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>Numer CAS: 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Nipagin (4-hydroksybenzoesan metylu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>VWR, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>5804 R / Numer seryjny: 5805CI364293</td><td></td></tr><tr><td>Rubin Gal4 ines</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>Stoks dostępne w Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>ShibireTS UAS line</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>Numer BDSC: 66600</td><td>Dostarczone przez Carlos Ribeiro Group</td></tr><tr><td>Miękkie szczotki</td><td></td><td></td><td>Do sortowania znieczulonych muszek owocowych</td></tr><tr><td>Czytnik płytek spektrofotometru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan Go 51119300</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>1016625</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sidul, Portugalia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta</td><td></td><td></td> hodowlana larw trzeciego stadium rozwojowego (L3) <td>Skład i informacje o wartości odżywczej na rysunku 1</td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ubijak do tkanek / kulek</td><td>MP Biomedicals, USA</td><td>FastPrep-24 6004500</td><td></td></tr><tr><td>TRPA1 Linia UAS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>Numer BDSC: 26264</td><td>Wyraża TrpA1 pod kontrolą UAS; może być używany do eksperymentalnej aktywacji neuronów w wieku 25 ? C</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Sheldon Manufacturing Inc., USA</td><td>W20M-2 / 03068308 / 9021195</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Pr&oacute;-vida, Portugalia</td><td></td><td>51% białka, 15% węglowodanów</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw drosophila

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Zachowania związane z żerowaniem i odżywianiem pozwalają zwierzętom na dostęp do źródeł energii i składników odżywczych niezbędnych dla ich rozwoju, zdrowia i sprawności. Badanie neuronalnej regulacji tych zachowań jest niezbędne do zrozumienia fizjologicznych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw homeostazy żywieniowej. Wykorzystanie genetycznie sterowalnych modeli zwierzęcych, takich jak robaki, muchy i ryby, znacznie ułatwia tego typu badania. W ostatniej dekadzie muszka owocowa Drosophila melanogaster została wykorzystana jako potężny model zwierzęcy przez neurobiologów badających neuronalną kontrolę zachowań żywieniowych i żerowania. Choć niewątpliwie cenne, większość badań dotyczy dorosłych much. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje prostszy układ nerwowy larw do badania substratów neuronalnych kontrolujących zachowania żywieniowe, gdy larwy są narażone na diety różniące się zawartością białka i węglowodanów. Nasze metody opierają się na ilościowym kolorymetrycznym teście żywieniowym bez wyboru, przeprowadzonym w kontekście neuronalnego badania przesiewowego aktywacji termogenetycznej. Jako odczyt wykorzystano ilość pokarmu spożywanego przez larwy w odstępie 1 godziny, gdy były wystawione na działanie jednej z trzech diet znakowanych barwnikami, które różnią się stosunkiem białka do węglowodanów (P: C). Skuteczność tego protokołu wykazano w kontekście neurogenetycznego badania przesiewowego u larw Drosophila, identyfikując potencjalne populacje neuronów regulujące ilość spożywanego pokarmu w dietach o różnej jakości makroskładników. Udało nam się również sklasyfikować i pogrupować badane genotypy w klasy fenotypowe. Oprócz krótkiego przeglądu obecnie dostępnych metod w literaturze, omówiono zalety i ograniczenia tych metod, a także przedstawiono pewne sugestie dotyczące tego, w jaki sposób protokół ten może zostać dostosowany do innych konkretnych eksperymentów.

Drosophila larwy regulują pobór białka kosztem spożywania nadmiaru węglowodanów23 (schemat na Rysunku 2E). W rzeczywistości taką priorytetyzację poboru białka zaobserwowano u wielu innych zwierząt; zjawisko to nazywane jest dźwignią białkową (protein leveraging)24,25.
Wykorzystując tę silną behawioralną odpowiedź żerowania, zaprojektowano przesiew behawioralny mający na cel...

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Nasz protokół umożliwia identyfikację populacji neuronów larwalnych kodujących wybory żywieniowe związane z kontrolą poziomu spożycia dwóch głównych makroskładników odżywczych, białek i węglowodanów. Prostota i stosunkowo wysoka przepustowość naszej metody pozwala na ilościowe określenie spożycia pokarmu dla kilku genotypów narażonych na różne warunki żywieniowe. Aby genetycznie przekroczyć linie rodzicielskie, ustaw 60-milimetrowe klatki do pobierania zarodków z płytkami diety hodowlanej L3 uzupełnionymi aktywną pastą drożdżową.Przenieść dorosłe dziewice TripA1 i samce Janelia GAL4 w wieku od pięciu do ośmiu dni do klatek pobierania zarodków i pozwolić na krycie przez 24 do 48 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 60% i 12-12 jasnym cyklu ciemnym. Po okresie krycia przenieś kryte dorosłe muchy na świeże płytki z dietą odchowową L3 i pozwól na składanie jaj przez trzy do czterech godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Upewnij się, że wszystkie płytki są oznaczone genotypem i datą złożenia jaj.Po zakończeniu okresu składania jaj należy wyjąć płytki z klatek i oszacować liczbę jaj na płytce, licząc liczbę zarodków w jednej czwartej płytki. Utrzymuj gęstość larw na maksymalnie 200 zarodków na płytce i przykryj płytki plastikowymi pokrywkami. Inkubuj płytki hodowlane L3 w temperaturze 18 stopni Celsjusza, wilgotności 60% i cyklu 12, 12 jasnych ciemności przez dziewięć dni.Po inkubacji należy zebrać trzy grupy po 10 L3 z każdego z genotypów, które mają być badane, a także jedną grupę po 10 L3 do kontroli żywności o zerowym barwniku. Użyj kleszczy numer pięć lub szczypiec do wagi piórkowej, wykonując zbieranie larw tak delikatnie, jak to możliwe. Przenieś zebrane larwy do plastikowych naczyń zawierających jeden mililitr wody.Ustaw inkubator o temperaturze 30 stopni Celsjusza i utrzymuj wysoki poziom wilgotności, dodając tacę wypełnioną wodą, aby uniknąć odwodnienia larw podczas testu. Zrównoważ temperaturę płytek testowych, podgrzewając je do 30 stopni Celsjusza przed rozpoczęciem. Upewnij się, że wszystkie płytki są oznaczone genotypem i stosunkiem białka do węglowodanów diety.Szok cieplny eksperymentalnych larw przez dwie minuty poprzez bezpośrednie przeniesienie plastikowych łodzi zawierających zwierzęta do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw wymaganą liczbę timerów na jedną godzinę, a następnie ostrożnie spuść wodę z plastikowych łodzi i przenieś grupy L3 z łodzi na środek płyt aktywów. Zakryj talerze i uruchom timer.Pozwól larwom żerować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności. Przerwij test karmienia, przenosząc płytki do łaźni lodowej. Przygotuj dwie mililitrowe mikroprobówki dla każdej badanej grupy L3, zawierające wystarczającą ilość szklanych kulek o średnicy 0,5 milimetra, aby wypełnić dolną część mikroprobówki i 300 mikrolitrów lodowatego metanolu.Użyj chłodnicy stołowej, aby utrzymać mikrorurki w niskiej temperaturze. Ostrożnie odzyskać grupy L3 z płytek do oznaczania karmienia i przenieść je na pokrywki płytek z niewielką ilością wody. Opłucz larwy, aby usunąć resztki jedzenia z ich ciał, uważając, aby uniknąć obrażeń.Przenieś larwy do przygotowanych mikroprobówek i poddaj je lizie lizera tkankowego, aby wyekstrahować barwnik spożywczy z jelit. Przenieś ekstrakty do czystych mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra, bezpośrednio odwracając dwie mililitrowe mikroprobówki na nowe probówki. Zrób to delikatnie, aby większość szklanych koralików pozostała na dnie dwumililitrowej tubki.Usuń resztki komórkowe, wirując ekstrakty z maksymalną prędkością i czterema stopniami Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieś supernatanty do czystych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Aby przeprowadzić kalorymetryczną kwantyfikację spożycia żywności, przygotuj wzorcowe roztwory niebieskiego barwnika, seryjnie rozcieńczając go od jednego do dwóch w metanolu. Przenieś 100 mikrolitrów próbek eksperymentalnych, wzorców i ślepej próby do studzienek 96-dołkowej mikropłytki i zmierz absorbancję przy 600 nanometrach.Protokół ten wykorzystano do ilościowego określenia względnych ilości makroskładników odżywczych spożywanych przez zwierzęta w ramach aktywacji termogenetycznej określonych populacji neuronów w larwalnym układzie nerwowym. Aktywacja różnych populacji neuronów znacząco wpłynęła na równowagę makroskładników odżywczych u larw w trzecim stadium rozwojowym. Wzorzec żywienia zaobserwowany dla linii kontrolnej, tutaj zaznaczony kolorem szarym, pokazuje oczekiwany spadek spożycia pokarmu w dietach o wyższym stosunku białka do węglowodanów, co świadczy o skuteczności metody.Pięć klas fenotypowych, które zostały ustalone dla zwierząt doświadczalnych, to jedz dużo i kompensuj rozcieńczenie białka przez przejadanie się, jedz dużo, ale nie kompensuj, jedz mało, ale kompensuj, jedz mało i nie kompensuj oraz jedz nienormalnie. Dla każdej z tych klas fenotypowych i genotypów przedstawiono wzorce GFP w ośrodkowym układzie nerwowym larw w trzecim stadium rozwojowym. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby wygenerować zsynchronizowane rozwojowo wczesne larwy w trzecim stadium rozwojowym, aby zminimalizować zmienność związaną z zachowaniem zwierząt.Zgodnie z tym protokołem, radiowe etykietowanie żywności pozwoliłoby na potwierdzenie i dalszą analizę trafień znalezionych przy użyciu tych metod.

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

To jest protokół żywieniowy diety wysokotłuszczowej do wywoływania otyłości u Drosophila, model do zrozumienia podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z lipotoksycznością. Zapewnia również wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy do pomiaru akumulacji tłuszczu u Drosophila i potencjalnie innych modeli (owadów) w różnych warunkach dietetycznych, środowiskowych, genetycznych lub fizjologicznych.

Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster

Ilościowe testy spożycia żywności z farbowaną żywnością dostarczają solidnych i wydajnych środków do oceny motywacji do karmienia. Połączenie testu spożycia żywności z termogenetycznymi i optogenetycznymi badaniami przesiewowymi jest skutecznym podejściem do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw apetytu u dorosłych Drosophila melanogaster.

Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół dla testu żywieniowego dla much z dwoma opcjami. Ten test żywieniowy jest szybki i łatwy do przeprowadzenia i nadaje się nie tylko do badań laboratoryjnych na małą skalę, ale także do wysokowydajnych badań behawioralnych u much.

Szybki test preferencji żywieniowych u Drosophila

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji transportu monokarboksylanów, glukozy i ATP w komórkach glejowych i neuronach za pomocą genetycznie kodowanych czujników rezonansu Förstera opartych na transferze energii w preparacie mózgu larwalnego ex-vivo Drosophila.

Wizualizacja monokarboksylanów i innych istotnych metabolitów w mózgu larw Drosophila ex vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników

Opisano szybki test in vivo służący do badania związków neuromodulacyjnych z wykorzystaniem systemu włókien olbrzymich (Giant Fiber System, GFS) u Drosophila melanogaster. Nanowstrzyknięcia do głowy zwierzęcia wraz z rejestracją elektrofizjologiczną GFS mogą ujawnić bioaktywność związków w obrębie neuronów lub mięśni.

Połączony test nanoiniekcji i elektrofizjologii do przesiewowej oceny bioaktywności związków z wykorzystaniem systemu włókien olbrzymich Drosophila melanogaster

W niniejszym artykule przedstawiamy testy służące do badania nocycepcji termicznej u larw Drosophila. Jeden z testów polega na stymulacji ograniczonej przestrzennie (lokalnej) nocyceptorów termicznych1,2, natomiast drugi obejmuje całkowitą (globalną) aktywację większości lub wszystkich takich neuronów3. Wspólnie techniki te umożliwiają wizualizację i kwantyfikację funkcji behawioralnych neuronów sensorycznych nocyceptywnych Drosophila.

Lokalne i globalne metody oceny nocycepcji termicznej u larw Drosophila

Poznaj metodę kolorymetryczną do kwantyfikacji spożycia pokarmu u larw Drosophila melanogaster w badaniach termogenetycznych. Protokół umożliwia identyfikację populacji neuronowych kontrolujących wybór makroskładników odżywczych.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów