Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila
June 11th, 2020
Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.
Nasz protokół umożliwia identyfikację populacji neuronów larwalnych kodujących wybory żywieniowe związane z kontrolą poziomu spożycia dwóch głównych makroskładników odżywczych, białek i węglowodanów. Prostota i stosunkowo wysoka przepustowość naszej metody pozwala na ilościowe określenie spożycia pokarmu dla kilku genotypów narażonych na różne warunki żywieniowe. Aby genetycznie przekroczyć linie rodzicielskie, ustaw 60-milimetrowe klatki do pobierania zarodków z płytkami diety hodowlanej L3 uzupełnionymi aktywną pastą drożdżową.
Przenieść dorosłe dziewice TripA1 i samce Janelia GAL4 w wieku od pięciu do ośmiu dni do klatek pobierania zarodków i pozwolić na krycie przez 24 do 48 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 60% i 12-12 jasnym cyklu ciemnym. Po okresie krycia przenieś kryte dorosłe muchy na świeże płytki z dietą odchowową L3 i pozwól na składanie jaj przez trzy do czterech godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Upewnij się, że wszystkie płytki są oznaczone genotypem i datą złożenia jaj.
Po zakończeniu okresu składania jaj należy wyjąć płytki z klatek i oszacować liczbę jaj na płytce, licząc liczbę zarodków w jednej czwartej płytki. Utrzymuj gęstość larw na maksymalnie 200 zarodków na płytce i przykryj płytki plastikowymi pokrywkami. Inkubuj płytki hodowlane L3 w temperaturze 18 stopni Celsjusza, wilgotności 60% i cyklu 12, 12 jasnych ciemności przez dziewięć dni.
Po inkubacji należy zebrać trzy grupy po 10 L3 z każdego z genotypów, które mają być badane, a także jedną grupę po 10 L3 do kontroli żywności o zerowym barwniku. Użyj kleszczy numer pięć lub szczypiec do wagi piórkowej, wykonując zbieranie larw tak delikatnie, jak to możliwe. Przenieś zebrane larwy do plastikowych naczyń zawierających jeden mililitr wody.
Ustaw inkubator o temperaturze 30 stopni Celsjusza i utrzymuj wysoki poziom wilgotności, dodając tacę wypełnioną wodą, aby uniknąć odwodnienia larw podczas testu. Zrównoważ temperaturę płytek testowych, podgrzewając je do 30 stopni Celsjusza przed rozpoczęciem. Upewnij się, że wszystkie płytki są oznaczone genotypem i stosunkiem białka do węglowodanów diety.
Szok cieplny eksperymentalnych larw przez dwie minuty poprzez bezpośrednie przeniesienie plastikowych łodzi zawierających zwierzęta do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw wymaganą liczbę timerów na jedną godzinę, a następnie ostrożnie spuść wodę z plastikowych łodzi i przenieś grupy L3 z łodzi na środek płyt aktywów. Zakryj talerze i uruchom timer.
Pozwól larwom żerować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciemności. Przerwij test karmienia, przenosząc płytki do łaźni lodowej. Przygotuj dwie mililitrowe mikroprobówki dla każdej badanej grupy L3, zawierające wystarczającą ilość szklanych kulek o średnicy 0,5 milimetra, aby wypełnić dolną część mikroprobówki i 300 mikrolitrów lodowatego metanolu.
Użyj chłodnicy stołowej, aby utrzymać mikrorurki w niskiej temperaturze. Ostrożnie odzyskać grupy L3 z płytek do oznaczania karmienia i przenieść je na pokrywki płytek z niewielką ilością wody. Opłucz larwy, aby usunąć resztki jedzenia z ich ciał, uważając, aby uniknąć obrażeń.
Przenieś larwy do przygotowanych mikroprobówek i poddaj je lizie lizera tkankowego, aby wyekstrahować barwnik spożywczy z jelit. Przenieś ekstrakty do czystych mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra, bezpośrednio odwracając dwie mililitrowe mikroprobówki na nowe probówki. Zrób to delikatnie, aby większość szklanych koralików pozostała na dnie dwumililitrowej tubki.
Usuń resztki komórkowe, wirując ekstrakty z maksymalną prędkością i czterema stopniami Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieś supernatanty do czystych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Aby przeprowadzić kalorymetryczną kwantyfikację spożycia żywności, przygotuj wzorcowe roztwory niebieskiego barwnika, seryjnie rozcieńczając go od jednego do dwóch w metanolu. Przenieś 100 mikrolitrów próbek eksperymentalnych, wzorców i ślepej próby do studzienek 96-dołkowej mikropłytki i zmierz absorbancję przy 600 nanometrach.
Protokół ten wykorzystano do ilościowego określenia względnych ilości makroskładników odżywczych spożywanych przez zwierzęta w ramach aktywacji termogenetycznej określonych populacji neuronów w larwalnym układzie nerwowym. Aktywacja różnych populacji neuronów znacząco wpłynęła na równowagę makroskładników odżywczych u larw w trzecim stadium rozwojowym. Wzorzec żywienia zaobserwowany dla linii kontrolnej, tutaj zaznaczony kolorem szarym, pokazuje oczekiwany spadek spożycia pokarmu w dietach o wyższym stosunku białka do węglowodanów, co świadczy o skuteczności metody.
Pięć klas fenotypowych, które zostały ustalone dla zwierząt doświadczalnych, to jedz dużo i kompensuj rozcieńczenie białka przez przejadanie się, jedz dużo, ale nie kompensuj, jedz mało, ale kompensuj, jedz mało i nie kompensuj oraz jedz nienormalnie. Dla każdej z tych klas fenotypowych i genotypów przedstawiono wzorce GFP w ośrodkowym układzie nerwowym larw w trzecim stadium rozwojowym. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby wygenerować zsynchronizowane rozwojowo wczesne larwy w trzecim stadium rozwojowym, aby zminimalizować zmienność związaną z zachowaniem zwierząt.
Zgodnie z tym protokołem, radiowe etykietowanie żywności pozwoliłoby na potwierdzenie i dalszą analizę trafień znalezionych przy użyciu tych metod.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie opisuje protokół kolorymetrycznej ilościowej analizy spożycia pokarmu u larw Drosophila melanogaster narażonych na różne diety makronutrientów. Badania koncentrują się na identyfikacji populacji neuronów larw, zaangażowanych w wybór pokarmowy i kontrolę spożycia pokarmu w warunkach różnych proporcji białka i węglowodanów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Genetyka
Tło
- Larwy Drosophila melanogaster służą jako model do badania zachowań pokarmowych.
- Wpływ jakości makronutrientów w diecie na wzorce żerowania jest kluczowy dla zrozumienia wyborów metabolicznych.
- Protokół umożliwia wysokowydajne badanie spożycia pokarmu w różnych genotypach.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowej analizy spożycia pokarmu na etapach larw Drosophila.
- Zrozumienie mechanizmów neuronowych leżących u podstaw podejmowania decyzji pokarmowych.
- Zbadanie wpływu różnych proporcji białka i węglowodanów na zachowanie żerujące.
Stosowane metody
- Protokół wykorzystuje testy behawioralne do ilościowej analizy aktywności żerowania w larwach trzeciego stadium.
- Larwy Drosophila są narażone na różne diety, podczas gdy populacje neuronów są termogenetycznie aktywowane.
- Ocena polega na poddaniu larw szokowi termicznemu, po którym następuje kolorymetryczne pomiar ilości barwnika pokarmowego wchłoniętego z ich diety.
- Dokładna synchronizacja rozwoju larw jest kluczowa dla uzyskania konsystencnych wyników behawioralnych.
- Standardowe krzywe do ilościowej analizy są ustawiane za pomocą szeregowo rozcieńczonych roztworów barwnika.
Główne wyniki
- Wyróżnione aktywacje neuronowe znacząco wpływają na równowagę makronutrientów w wzorach żerowania.
- Na podstawie odpowiedzi na zmiany w diecie zidentyfikowano pięć fenotypowych klas zachowań żerowania.
- Metoda okazała się skuteczna w ilościowej analizie związku między składem diety a spożyciem pokarmu.
Wnioski
- Ten protokół umożliwia badaczom zbadanie roli określonych populacji neuronowych w wyborach pokarmowych larw.
- Wyraźne pomiary spożycia pokarmu i fenotypów behawioralnych zwiększają zrozumienie decyzji metabolicznych.
- Wyniki przyczyniają się do wiedzy na temat fizjologii żywieniowej i jej neuronowych podstaw.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput quantification of macronutrient intake in a genetically tractable model, supporting target validation in metabolic and feeding behavior research. By linking specific neuronal populations to dietary choice phenotypes, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on obesity, diabetes, and nutrient-sensing pathways. The quantitative, dye-based readout offers predictive confidence in screening workflows where nutritional homeostasis is a key biomarker.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying larval neuronal populations that regulate protein and carbohydrate intake under controlled dietary conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through thermogenetic activation screens that link genotype to feeding behavior phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by classifying genotypes into phenotypic classes based on macronutrient compensation patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing food intake quantification across genotypes and diet conditions.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs via colorimetric measurement of dye uptake, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse through simple larval collection, feeding, and extraction steps compatible with 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neuronal hits to preclinical validation by establishing disease-relevant feeding phenotypes in a conserved model system.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through quantifiable macronutrient intake metrics that reflect nutritional homeostasis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether genetic perturbations normalize or exacerbate feeding imbalances across protein-to-carbohydrate ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neuronal mechanism elucidation before progressing to lead identification and preclinical validation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effect of specific neuronal activations on macronutrient balancing in larval feeding behavior.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized larval synchronization, diet exposure, and dye-based quantification that yields comparable data across conditions.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (food intake via absorbance at 600 nm) that allow comparison of conditions and statistical evaluation of genotype effects.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by identifying neuronal regulators of dietary choice that may inform target selection in mammalian models of metabolic disorder.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening capability for metabolic and behavioral phenotypes due to its simplicity, low cost, and compatibility with genetic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nutrient-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled larval staging, diet composition, and timed feeding assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early evidence of on-target metabolic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to restore balanced macronutrient intake in perturbed feeding phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, larval staging, and thermogenetic techniques.
- Dependent on incubation equipment, water baths for heat shock, and microplate readers for absorbance measurement.
- Necessitates cross-team standardization of larval density, diet labeling, and assay timing to minimize variability.
- Adaptation to other model systems would require modification of diet composition, dye compatibility, and larval recovery methods.
- Practical limitations include the need for dexterous larval handling and the assumption that dye uptake linearly correlates with food intake.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
