Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Ten protokół enkapsulacji oocytów świń umożliwia utrzymanie sferycznej organizacji COC. Zapobiega to ich spłaszczeniu i w konsekwencji przerwaniu połączeń szczelinowych między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi. Głównymi zaletami dwóch opisanych protokołów jest to, że są przyjazne dla użytkownika i pozwalają na skuteczną kontrolę przeżycia zarówno komórek jajowych, jak i chemiocytów.

Oba systemy hodowli są cennymi narzędziami do podstawowych badań w dziedzinie biologii rozrodu i mogą mieć znaczenie kliniczne dla poprawy leczenia niepłodności. Mogą być również stosowane do opracowywania nowatorskich metod biotechnologicznych i ulepszania zwierząt gospodarskich. Po wypłukaniu jajników przenieś je do zlewki wypełnionej pożywką HM i przechowuj w inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza podczas wszystkich kolejnych manipulacji.

Odessać płyn pęcherzykowy z dużych pęcherzyków wieprzowych i odwirować go w temperaturze 100 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltruj supernatant za pomocą sterylnej strzykawki podłączonej do filtra porowego z membraną o średnicy 0,2 mikrometra i zamroź go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wyizolować COC ze średniej wielkości pęcherzyków, przenieś dwa do trzech jajników na sterylną 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną HM. Delikatnie przeciąć powierzchnię wystających pęcherzyków jajnikowych sterylnym ostrzem chirurgicznym numer 15, co spowoduje, że płyn pęcherzykowy i COC wypłyną na szalkę Petriego.

Odessać zawartość pęcherzyków za pomocą igły o rozmiarze 28 dołączonej do jednorazowej strzykawki i przenieść ją na inną szalkę Petriego. Aby przygotować szalki Petriego do zapłodnienia in vitro, dodaj jeden mililitr HM do centralnych studzienek i umieść trzy do czterech kropli HM w zewnętrznych pierścieniach. Następnie za pomocą mikropipety z poliwęglanu przenieś nieuszkodzone COC do kropli HM w pierścieniach zewnętrznych i krótko je przepłucz trzy do czterech razy.

Po zakończeniu przenieś je indywidualnie do centralnej studni. Przechowywać płytki IVF w inkubatorze. Przygotować roztwory trombiny i fibrynogenu zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.

W dniu zabiegu roztwór fibrynogenu należy powoli rozmrozić na lodzie, a tuż przed użyciem doprowadzić go do temperatury pokojowej. Wymieszaj 0,5% roztwór alginianu i roztwór fibrynogenu w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów i delikatnie wymieszaj mieszaninę. Naprawa komór inkubacyjnych poprzez nakładanie cienkich pasków filmu parafinowego na szklane szkiełka mikroskopowe.

Odpipetować 7,5 mikrolitra kropli mieszaniny FA na szkiełko pokryte parafiną za pomocą przekładek rozdzielających, umieszczając od ośmiu do 10 kropli ułożonych w dwóch rzędach. Za pomocą mikropipety przenieś od trzech do pięciu COC do środka kropli FA, wraz z minimalną objętością pożywki do dojrzewania. Dodaj 7,5 mikrolitra roztworu trombiny na wierzch każdej kropli FA, aby ją przykryć.

Nie ma potrzeby ich mieszania, ponieważ żel tworzy się niemal natychmiast. Przykryj komorę inkubacyjną wcześniej przygotowanym szkiełkiem podstawowym, następnie odwróć komorę do góry nogami i umieść ją na 100-milimetrowej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 38 stopni Celsjusza na pięć do siedmiu minut.

Po inkubacji przenieść każdą kapsułkę FA do studzienki z 96-dołkową płytką zawierającą 100 mikrolitrów pożywki do dojrzewania. Co dwa dni zastępować połowę pożywki świeżą, wstępnie zrównoważoną pożywką dojrzewającą. Obraz COC wykorzystuje mikroskop światła odwróconego przy 10-krotnym powiększeniu.

Po hodowli COC przez cztery dni, usunąć pożywkę dojrzewającą ze studzienek i dodać 100 mikrolitrów 10 jednostek międzynarodowych na mililitr lizatu algenianowego w DMEM. Pozostaw płytkę hodowlaną w inkubatorze na 25 do 30 minut. Usunąć COC z rozpuszczonych kapsułek.

Umyj je kilka razy w DMEM, a następnie przenieś do wewnętrznego pierścienia naczynia do zapłodnienia in vitro zawierającego PBS. Przygotuj podłoże z pięciu gramów proszku FEP na 30-milimetrowej szalce Petriego. Rozprowadzić pojedynczą kroplę pożywki dojrzewającej zawierającej od trzech do pięciu COC na proszek FEP.

Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząstki całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą płynne kulki lub LM. Przygotuj kilka 60-milimetrowych szalek Petriego IVF i dodaj trzy do czterech mililitrów sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby utworzyć komorę wilgotności. Podnieś uformowany LM za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść go w studzience centralnej.

Inkubuj kulki przez cztery dni w temperaturze 38 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Aby zmienić pożywkę, nałóż 30 mikrolitrów pożywki dojrzewającej na każdy LM, co spowoduje jego rozprzestrzenianie się. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżej pożywki dojrzewającej na szalce Petriego.

Po trzech do czterech myciach w pożywce dojrzewającej przenieś COC wraz z 30 mikrolitrami świeżej pożywki na złoże proszkowe FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą nowy LM. Następnie przenieś LM na szalkę Petriego IVF. Oba systemy dojrzewania in vitro wytworzyły COC z komórkami ziarnistości, które były ściśle przylegające do siebie i nienaruszonymi warstwami komórek wzgórka.

Analiza żywotności COC potwierdziła, że w obu systemach enkapsulacji osiągnięto optymalne warunki wzrostu. W obu grupach zaobserwowano jedynie miejsca oocytów o wysokiej żywotności. Oocyty zobrazowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Mitochondria były równomiernie rozmieszczone i miały kształt przypominający muszlę. Tylko kilka z nich było wydłużonych, a ich grupowanie obserwowano sporadycznie. Retikulum endoplazmatyczne było albo związane z mitochondriami, albo wolne w cytoplazmie oocytów.

Kropelki cieczy pojawiły się w postaci małych, ciemnych, okrągłych struktur, a aparat Golgiego wyłonił się z rozszerzonymi cysternami. Ważne jest, aby zachować precyzję i ostrożność podczas przenoszenia kapsułek FA z komory inkubacyjnej do płytek hodowlanych oraz podczas pobierania i przenoszenia formatu LM na szalkę Petriego do IVF.