Name: Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metody enkapsulacji oocytów świń w hydrożelach alginianowych i mikrobioreaktorach hydrofobowych. Techniki te zachowują strukturę kompleksów COC i zwiększają ich przeżywalność w badaniach biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni: dr Wacławowi Tworzydło (Zakład Biologii Rozwoju i Morfologii Bezkręgowców, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego) za zaplecze techniczne w TEM; Pani Beacie Snakowskiej (Zakład Endokrynologii, Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego) za pomoc techniczną; Zarządowi Biologii Komórki i Obrazowania, Instytutowi Zoologii i Badań Biomedycznych, Uniwersytet Jagielloński, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japonia). Praca została sfinansowana z grantu 2018/29/N/NZ9/00983 Narodowego Centrum Nauki.

Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Instytucie Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego.
1. Izolacja kompleksów cumulus-oocyty świń
<ol>
	<li>Aby pobrać materiał do izolacji pęcherzyków jajnikowych, należy wyciąć jajniki świń od loszek przed okresem dojrzewania (w wieku około 6-7 miesięcy, o wadze od 70 do 80 kg) w lokalnej rzeźni. Wybierz około 20 jajników świni z 10 zwierząt do izolacji COC w każdym doświadczeniu. 
	UWAGA: Zakładając, że każdy jajnik daje 3–5 pęcherzyków, całkowita liczba pęcherzyków waha się od 60 do 100.</li>
	<li>Umieść jajniki w termosie ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; pH 7,4; 38 °C) zawierającym 1% AAS. Zapewnić, że materiał doświadczalny zostanie przetransportowany do laboratorium w ciągu 1 godziny, gdzie zostanie dwukrotnie przepłukany sterylnym PBS zawierającym antybiotyki.</li>
	<li>Po wypłukaniu jajników przenieść je do zlewki wypełnionej pożywką HM i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 38 °C na czas wszystkich manipulacji. 
	UWAGA: W celu uzyskania optymalnych wyników podczas obchodzenia się z oocytami, wszystkie procedury należy przeprowadzić w pożywce DMEM/F12 (pożywce manipulacyjnej, HM) z dodatkiem 2,5% roztworu antybiotyku/antybiotyku (AAS) i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kontrolować pH na poziomie CO2 w otoczeniu, na stole grzewczym z regulacją temperatury (38 °C) i pod okapem z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne.</li>
	<li>Z dużych pęcherzyków wieprzowych (o średnicy 6-8 mm) zebrać płyn pęcherzykowy (FF) przez aspirację i odwirowanie w dawce 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltrować supernatant za pomocą sterylnej strzykawki podłączonej do filtrów membranowych 0,2 μm i zamknąć w temperaturze -80 ° C. 
	UWAGA: Użyj strzykawki insulinowej (u-40) do aspiracji płynu pęcherzykowego.</li>
	<li>Upewnij się, że tylko zdrowe, średniej wielkości pęcherzyki (o średnicy 4-6 mm) są wybrane do izolacji COCs42. 
	UWAGA: COC stopnia I, posiadające nienaruszony i okrągły oocyt z jednorodnym ooplazmą i wielowarstwowymi (co najmniej 3-4) zwartymi wzgórkami są uważane za odpowiednie do dalszej procedury 3D IVM43.</li>
	<li>Aby wyizolować COC, przenieś 2-3 jajniki na sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm wypełnioną HM. Wyizoluj COC ze średniej wielkości pęcherzyków, postępując zgodnie z jedną z poniższych procedur.
	<ol>
		<li>Delikatnie przeciąć powierzchnię wystających pęcherzyków jajnikowych sterylnym ostrzem chirurgicznym 15C. Spowoduje to, że płyn pęcherzykowy wraz z COC wypłynie na szalkę Petriego.</li>
		<li>Odessać zawartość pęcherzyków za pomocą igły 28 G o rozmiarze 5/8" dołączonej do jednorazowej strzykawki i przenieść ją na szalkę Petriego. 
		UWAGA: Wyrzuć resztki tkanki jajnikowej. Kolejne etapy izolacji przeprowadzane są pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 3–5 szalek Petriego IVF o średnicy 60 mm.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml HM do studzienek centralnych i umieść 3-4 krople HM (50 μl na kroplę) w ich zewnętrznych pierścieniach.</li>
		<li>Następnie, za pomocą mikropipety poliwęglanowej, przenieś nieuszkodzone COC do kropli HM w pierścieniach zewnętrznych, aby krótko je przepłukać 3-4 razy.</li>
		<li>Na koniec pojedynczo przenieś je do centralnej studni. Przechowuj te płytki IVF w inkubatorze do dalszych zabiegów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zebraniu COC wykonaj ostatni krok selekcji, przypisując je losowo do dwóch różnych protokołów enkapsulacji IVM wymienionych poniżej.</li>
</ol>
2. Enkapsulacja w kulkach hydrożelowych fibrynowo-alginianowych
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml 50 j.m./ml trombiny w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS; pH 7,4) ze 100 mM CaCl2 w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy fibrynogenu (50 mg/ml w TBS) i przechowywać w stanie zamrożonym. 
	UWAGA: Aby uniknąć zbrylania się podczas rozpuszczania fibrynogenu w TBS, podgrzej TBS do 37 °C.
	<ol>
		<li>W dniu zabiegu rozmrażać go powoli na lodzie i tuż przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tuż przed użyciem wymieszać w stosunku 1:1 0,5% roztwór alginianu i 50 mg/ml roztworu fibrynogenu, aby uzyskać ostatecznie 2 ml (FA). W sterylnej probówce do mikrowirówek delikatnie wymieszaj mieszaninę. Unikaj robienia bąbelków.</li>
	<li>Aby przygotować "komory inkubacyjne", nałóż cienkie paski folii parafinowej na szklane szkiełka mikroskopowe. 
	UWAGA: Przed użyciem przetrzeć szkiełka 70% EtOH. Jedna komora inkubacyjna składa się z dwóch szkiełek. Aby je rozdzielić, umieść dystanse 3 mm na jednym z nich.</li>
	<li>Odpipetować 7,5 μl kropli mieszaniny FA na to szkiełko pokryte folią parafinową, które posiada również przekładki rozdzielające. Na jednej zjeżdżalni umieść 8-10 kropli ułożonych w dwóch rzędach.</li>
	<li>Przenieś, za pomocą mikropipety, 3-5 COC wraz z minimalną objętością (do 5 μl) pożywki dojrzewającej (MM) i umieść je dokładnie w środku kropli FA. Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji. 
	UWAGA: Pożywka dojrzewająca (MM) składa się z DMEM/F12, uzupełnionego 10 j.m./ml PMSG, 10 j.m./ml hCG, 10% FBS i 50% płynu pęcherzykowego świń (FF) pobranych w kroku 1.4.</li>
	<li>Dodaj 7,5 μl roztworu trombiny/Ca2+ na każdą kroplę FA, tylko po to, aby je przykryć. Nie ma potrzeby ich mieszania, ponieważ żel tworzy się niemal natychmiast.</li>
	<li>Przykryć komorę inkubacyjną poprzez nałożenie na kapsułki FA drugiego, wcześniej przygotowanego szkiełka podstawowego. Bardzo ostrożnym, ale zdecydowanym ruchem odwróć komorę do góry nogami i umieść ją na 100-milimetrowej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Następnie przenieść szalkę Petriego do inkubatora z 5% CO2 (38 °C) na około 5-7 minut. Po tym czasie kapsułki FA staną się mętne z powodu jednoczesnego żelowania fibryny i alginianu.</li>
	<li>Przenieść kapsułki FA do 96 płytek dołkowych (jedna kapsułka na studzienkę) zawierających 100 μl MM na studzienkę. 
	UWAGA: Aby nie uszkodzić uformowanych kapsułek FA, należy wykonać ten krok ostrożnie przy użyciu kleszczy chirurgicznych.</li>
	<li>Co 2 dni wymieniaj połowę MM (50 μL) na świeżą, wstępnie zrównoważoną. Obrazuj COC za pomocą mikroskopu światła odwróconego (przy 10-krotnym powiększeniu). 
	UWAGA: Warunki hodowli dla COC FA hodowla: 38 °C, w atmosferze 5% CO2 i wilgotności względnej 95%. Po 4 dniach IVM hydrożele wydają się prawie przezroczyste z powodu postępującej degradacji składnika fibryny. Pozostały alginian powinien zostać rozłożony enzymatycznie - przez liazę alginianową, enzym pochodzenia roślinnego, który specyficznie rozkłada alginian i nie wpływa na komórki zwierzęce.
	<ol>
		<li>Usunąć MM z dołków zawierających kapsułki i dodać 100 μl 10 j.m./ml liazy alginianowej w DMEM. Pozostaw płytkę hodowlaną w inkubatorze na 25-30 minut.</li>
		<li>Usunąć COC z rozpuszczonych kapsułek. 
		UWAGA: Można to zrobić za pomocą wyciętej końcówki pipety.</li>
		<li>Po kilku myciach w świeżym DMEM, przenieś COC do wewnętrznego pierścienia naczynia IVF (5-10 COC na naczynie) zawierającego PBS. Teraz użyj ich do dalszej analizy morfologicznej lub biochemicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Enkapsulacja w superhydrofobowych mikrobioreaktorach z fluorowanym etylenem propylenem (FEP).
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury IVM są przeprowadzane na stole kontrolowanym termostatycznie, a COC są utrzymywane na poziomie 38 °C przez cały czas ich obsługi.
<ol>
	<li>Przygotować szalkę Petriego o średnicy 30 mm zawierającą 5 g proszku FEP o średniej wielkości cząstek 1 μm. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać świeżego proszku FEP. Ponownie wykorzystany FEP ma tendencję do agregacji i tworzenia grudek.</li>
	<li>Rozprowadzić pojedynczą kroplę MM (~ 30 μl objętości) zawierającą 3-5 COC wyizolowanych w kroku 1.6 na łożu proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząstki te całkowicie pokryły powierzchnię kropli cieczy i utworzyły się płynne kulki (LM).</li>
	<li>Uformowany LM pobrać za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl. 
	UWAGA: Przyciąć końcówkę pipety na krawędzi, aby dopasować ją do średnicy LM (4-5 mm). Przybliżona średnica tak przygotowanej końcówki powinna być nieco większa niż średnica LM.</li>
	<li>Przygotuj kilka 60-milimetrowych szalek Petriego do zapłodnienia in vitro. Dodaj 3-4 ml sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby przygotować komorę wilgotności. Następnie umieść jeden LM w centralnej studzience. 
	UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji - jeśli kulka zostanie ułożona nieostrożnie lub spadnie nawet z niewielkiej wysokości, zostanie zniszczona.</li>
	<li>Inkubować kulki przez 4 dni w temperaturze 38 °C w inkubatorze o stężeniu 5 % CO2 .
	<ol>
		<li>Codziennie po zabiegu należy zmieniać pożywkę: nanieść 30 μl MM na każdy LM, co spowoduje ich rozprowadzenie, ponieważ bezpośredni kontakt z cieczą zaburza hydrofobowość powlekanych proszków FEP. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżego MM na szalce Petriego. 
		UWAGA: Aby precyzyjnie przenieść uwolnione COC, należy użyć mikropipety z poliwęglanu.</li>
		<li>Po kilku płukaniach w MM (3-4 razy) w celu usunięcia cząstek FEP, przenieś je wraz z 30 μl świeżego MM na złoże proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokryły powierzchnię kropli cieczy i utworzyły nowy LM.</li>
		<li>Następnie postępuj zgodnie z procedurą z kroków 3.3-3.4. 
		UWAGA: Przezroczysta powłoka proszku FEP pozwala na monitorowanie zawartości LM za pomocą mikroskopu świetlnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka COC po 96-godzinnej procedurze IVM przy użyciu dwóch systemów 3D
UWAGA: Aby określić skuteczność stosowanych systemów IVM, należy ocenić morfologicznie COC pod mikroskopem świetlnym. Dodatkowo użyj podwójnego znakowania fluorescencyjnego barwnikami kalceiny AM i homodimerem etydyny (EthD-1) do analizy żywotności COCs44.
<ol>
	<li>Badanie morfologiczne oocytów po IVM za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej.
	<ol>
		<li>Umyć COC (zarówno te pochodzące z hodowli przy użyciu FAB, jak i te z LM) w temperaturze 38 °C 1x PBS. 
		UWAGA: Aby ułatwić obchodzenie się z COC i nie uszkodzić ich podczas procedury barwienia, należy użyć płytki 96 lub 48-dołkowej i wykonać każdy etap barwienia, przenosząc COC do kolejnych dołków.</li>
		<li>Inkubować je w 100 μl 1,6 mM kalceiny AM i 5,5 mM EthD-1 przez 30–45 minut w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć obie substancje w 1x PBS. 
		UWAGA: Ponieważ jest to dwukolorowy test fluorescencyjny, wykonaj ten krok w ciemności.</li>
		<li>Po inkubacji umyj COC dwukrotnie w PBS, a następnie zanurz go w pożywce zapobiegającej blaknięciu, zaprojektowanej tak, aby zapobiec szybkiemu fotowybielaniu białek fluorescencyjnych i barwników fluorescencyjnych (tabela materiałów). 
		UWAGA: Zabezpiecz krawędzie szkła nakrywkowego przed wyschnięciem dowolnym lakierem do paznokci.</li>
		<li>Wizualizacja barwionych próbek pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym. 
		UWAGA: Aby wzbudzić fluorescencję obu sond (tj. kalceiny i homodimeru etydyny-1, EthD-1), należy dostroić laser argonowy do 488 nm. Emitowana fluorescencja jest oddzielana przez potrójny filtr dichroiczny 488/561/633, a następnie mierzona przy 505−570 nm dla zielonej (kalceina) i przy 630−750 nm dla czerwonej (EthD-1).</li>
		<li>Klasyfikuj COC na cztery kategorie, używając zmodyfikowanej klasyfikacji, która jest stosowana do pęcherzyków jajnikowych w hodowli w oparciu o konfokalne obrazowanie fluorescencyjne w zależności od procentu martwych komórek ziarnistych35. V1: COC z szacowanymi 100% żywotnymi CC; V2: COC z 10% martwych CC; V3: COC z 10–50% martwych CC; V4: COC z 50% martwymi CCs. 
		UWAGA: Z technicznego punktu widzenia trudno jest ocenić żywotność oocytu za pomocą testu żywego zgonu; W związku z tym należy ją oszacować np. poprzez analizę ultrastruktury lub aktywności mitochondriów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie ultrastruktury oocytów po IVM metodą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
	<ol>
		<li>Utrwal COC w 100 μl 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2, temperatura pokojowa) przez 2 godziny.</li>
		<li>Zanurzyć COC w 100 μl 0,1 M buforu kakodylanu sodu (na noc w temperaturze 4 °C) i wypłukać w tym samym buforze.</li>
		<li>Postfix COC z 1% tetratlenkiem osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (temperatura pokojowa) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po zabarwieniu octanem uranylu (1%), COC należy odwodnić w rosnącej serii rozcieńczeń etanolu (50%, 60%, 70%, 90% i 100%), naciekać je przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie dwie krótkie wymiany żywicy i na koniec zatopić je w LR White.</li>
		<li>Następnie, w celu orientacji i oceny próbek, wybarwić półcienkie skrawki (1 μm) błękitem metylenowo-lazurowym II.</li>
		<li>Na koniec zbadaj ultracienkie, podwójnie wybarwione skrawki na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą TEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność do utrzymania wzrostu in vitro nie tylko oocytu, ale także otaczających go komórek wzgórka i jednocześnie wspomagających jego dojrzewanie jest niezwykle istotna dla skutecznych technologii wspomaganego rozrodu oraz dla lepszego zrozumienia interakcji między komórką somatyczną a oocytami, zwłaszcza u gatunków poddawanych wydłużonemu wzrostowi pęcherzyków, takich jak ludzie lub świnie. Stale ulepszane techniki IVM stają się użytecznym narzędziem do zachowania opcji reprodukcyjnych w przypadkach zespołu policystycz...

Rozwój różnych systemów hodowli, w tym trójwymiarowych (3D), ma na celu zapewnienie optymalnych warunków do wzrostu i dojrzewania oocytów wyizolowanych z pęcherzyków nawet na najwcześniejszych etapach rozwoju. Ma to ogromne znaczenie dla technik wspomaganego rozrodu (ART), zwłaszcza w obliczu rosnącej liczby kobiet, które zmagają się z niepłodnością po leczeniu onkologicznym1. Dojrzewanie oocytów w warunkach in vitro (IVM) jest już dobrze znaną techniką stosowaną głównie do wytwarzania zarodków in vitro w celu reprodukcji zwierząt gospodarskich2. Jednak u większości gatunków ssaków, nawet jeśli uda się osiągnąć wysokie tempo dojrzewania kompleksów wzgórek-oocyty (COC) (zakres od 60 do 90 %)3, ich kompetencje rozwojowe są nadal nieadekwatne do potrzeb. Dzieje się tak dlatego, że rozwój tak uzyskanych zygot nawet do stadium blastocysty jest niski, a po przeniesieniu do zwierząt zastępczych ich zdolność do donoszenia terminu jest zmniejszona. W związku z tym istnieje potrzeba zwiększenia kompetencji rozwojowych zarodków pozyskanych z oocytów, które zostały poddane procedurze IVM4. W związku z tym opracowywane są nowe podłoża do dojrzewania5 i testowane są różne okresy hodowli in vitro6,7 wraz z suplementacją pożywek hodowlanych różnymi czynnikami wzrostu i cząsteczkami8,9.
Pierwszym krokiem każdego kompletnego systemu IVM jest stworzenie optymalnych warunków dla zrównoważonego wzrostu oocytów podczas hodowli in vitro. Wzrost oocytów jest jednym ze specyficznych wskaźników zdolności oocytu do wznowienia mejozy10,11. Ponadto odpowiedni system hodowli komórek jajowych in vitro musi być w stanie wspierać ich dojrzewanie jądrowe i różnicowanie cytoplazmatyczne12. Morfologia kompleksu wzgórek-oocyt jest kolejnym ważnym wskaźnikiem wykorzystywanym w klinikach ART do wyboru najlepszego oocytu do kolejnych etapów procedury zapłodnienia in vitro (IVF) u ludzi i zwierząt gospodarskich12,13. Wśród cech morfologicznych COC branych pod uwagę są: średnica oocytu, jego granulacja cytoplazmy i pierwsza integralność ciała polarnego14,15. Poza tym potencjał rozwojowy oocytów jest skorelowany z pojawieniem się i zagęszczeniem komórek wzgórka oraz liczbą ich warstw otaczających oocyt. Bardzo ważne dla prawidłowego systemu hodowli oocytów in vitro jest również utrzymanie prawidłowych interakcji między komórkami oocyt-wzgórek oraz stabilności cytoszkieletu16,17,18,19. Do tej pory wykazano wzrost oocytów in vitro w ludzkich COC20. Stosowanie COC krów skutkowało również żywymi porodami. Zostały one wyizolowane z niedojrzałych pęcherzyków jajnikowych, a następnie hodowane przez 14 dni, aż oocyt będzie wystarczająco duży, aby przejść procedurę IVF21. Podobnie, COC wyizolowane z pęcherzyków antralnych pawiana, poddane IVM po hodowli in vitro, dały oocyty zdolne do ponownego zainicjowania mejozy do etapu metafazy II z normalnie wyglądającą strukturą wrzeciona22. Jednak w tym badaniu autorzy nie próbowali ich nawozić. Wyniki te wskazują jednak, że podobną procedurę można zastosować nie tylko w odniesieniu do tych konkretnych gatunków ssaków, ale także do ludzkich kompleksów wzgórko-oocytów pozyskiwanych z pęcherzyków, co powinno pozwolić na uzyskanie oocytów dobrej jakości, odpowiednich do udanej techniki zapłodnienia in vitro.
Wyżej opisane wyniki uzyskano przy użyciu konwencjonalnych protokołów IVM, podczas których oocyty były hodowane w systemach dwuwymiarowych (2D). Rutynową procedurą w systemach hodowli 2D jest pokrywanie oocytów, zanurzonych w kropli odpowiedniej pożywki hodowlanej, olejem mineralnym23,24. Zakłada się, że nakładka olejowa podczas hodowli oocytów in vitro służy zapobieganiu parowaniu cieczy, zapewniając tym samym utrzymanie odpowiedniego pH i ciśnienia osmotycznego w hodowli. Mimo, że taki system hodowli 2D pozwala na uzyskanie nawet do 87% dojrzałych oocytów świńskich25, udowodniono, że nakładka oleju mineralnego powoduje znaczną dyfuzję substancji rozpuszczalnych w tłuszczach, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju oocytów26. Dodatkowo, ze względu na dyfuzję steroidów (progesteronu i estrogenów) do oleju mineralnego podczas hodowli oocytów, zaobserwowano opóźnienie dojrzewania jądrowego i obniżenie osiągania kompetencji rozwojowych przez oocyty świń. Może to skutkować uzyskaniem niewielkiej liczby zygot, które dodatkowo charakteryzują się niską zdolnością rozwojową do stadium blastocysty oraz słabą żywotnością po przeniesieniu do zwierząt biorców27. W związku z tym podejmowane są próby zwiększenia kompetencji rozwojowych zarodków pochodzących z oocytów otrzymanych po zabiegu IVM, poprzez stworzenie optymalnych warunków do osiągnięcia zarówno cytoplazmatycznej, jak i jądrowej dojrzałości oocytów hodowanych razem z CC jako kompleksami, zwłaszcza z wykorzystaniem układów trójwymiarowych (3D). W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano różne innowacyjne systemy hodowli 3D in vitro28,29. Zostały one zaprojektowane w celu utrzymania naturalnej organizacji przestrzennej komórek i uniknięcia ich spłaszczenia w szalkach hodowlanych, czego nie można osiągnąć w tradycyjnych kulturach 2D. Strukturalna i funkcjonalna aktywność hodowanych COC może być zapewniona poprzez utrzymanie ich właściwej architektury i niezakłóconą komunikację poprzez połączenia szczelinowe między różnymi przedziałami30. Przydatność biorusztowań do hodowli 3D in vitro kompleksów wzgórek–oocyty została oceniona przy użyciu naturalnych biomateriałów, takich jak różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM; kolagen i kwas hialuronowy)31 lub polimery obojętne (alginian)32. Próby te, przetestowane na kilku gatunkach, przyniosły obiecujące wyniki w zakresie wznowienia mejozy oocytów i osiągnięcia pełnej ich kompetencji33,34,35. Jednak do tej pory nie opracowano systemu 3D odpowiedniego do dojrzewania COC wyizolowanego od dużych zwierząt domowych, w tym świń.
Ta praca opisuje dwa protokoły, które mogą być użyte do hodowli 3D świń COC. Pierwszy protokół opisuje enkapsulację w kulkach fibrynowo-alginianowych (FAB). FAB może być tworzony przez jednoczesne mieszanie roztworu alginianu i fibryny, które poddawane są synchronicznemu procesowi żelowania. Ta kombinacja zapewnia dynamiczne środowisko mechaniczne, ponieważ oba komponenty przyczyniają się do sztywności matrycy. Podobne rozwiązanie zostało wcześniej użyte do hodowli pęcherzyków jajnikowych myszy i dojrzewania36. W przypadku przedstawionego protokołu, w celu uniknięcia przedwczesnej degradacji sieci alginian-fibryna, stosuje się odpowiednio wyższe stężenia roztworu chlorku wapnia, zapewniające szybki i stabilny proces żelowania. Dynamiczne środowisko mechaniczne stwarza warunki podobne do tych w naturalnym środowisku wewnątrzpęcherzykowym, w którym COC znajdują się i zwiększają swoje rozmiary. Ponadto w pracy przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad systemami hodowli COC 3D, w których są one zawieszone w kropli pożywki i otoczone cząstkami proszku fluorowanego etylenu propylenu (FEP; kopolimer heksafluoropropylenu i tetrafluoroetylenu), tworząc mikrobioreaktory (Liquid Marbles, LM). LM to forma bioreaktora 3D, w przypadku których, jak wykazano wcześniej, wspiera m.in. wzrost żywych mikroorganizmów37, sferoidy nowotworowe38 oraz embrionalne komórki macierzyste39. LM są również z powodzeniem stosowane do hodowli oocytów owiec40. W większości eksperymentów z użyciem LM bioreaktory przygotowano przy użyciu złoża proszkowego z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wielkości cząstek 1 μm41. W prezentowanym protokole zastosowano FEP, który jest bardzo podobny pod względem składu i właściwości do fluoropolimerów PTFE. Ale FEP jest łatwiejszy w formowaniu i bardziej miękki niż PTFE i, co szczególnie ważne, jest wysoce przezroczysty.
Oba systemy 3D utrzymują gazowe środowisko hodowli in vitro. Utrzymują również organizację COC 3D, zapobiegając ich spłaszczeniu i w konsekwencji przerwaniu połączeń szczelinowych, zachowując ich funkcjonalny związek między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi.

<table><tbody><tr><td>General</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Antybiotyk Grzybiczy (100x) 100ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td>2,5% stężenie końcowe do podłoża manipulacyjnego. 1% w PBS (krok 1.2)</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (500ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td>Podłoże do obsługi i dojrzewania</td></tr><tr><td>DPBS (bez Ca, Mg), 1x, 500ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS (100 ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16140063</td><td>10% stężenie końcowe zarówno dla podłoża manipulacyjnego, jak i podłoża do dojrzewania. (kroki: 1.5. 2.6.)</td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4) 500ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TBS roztwór podstawowy (10x, pH 7,4) 500 ml</td><td>Cayman Chemicals</td><td>600232</td><td>1x stężenie końcowe. Inna marka może być stosowana</td></tr><tr><td>Maturation Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (1 fiolka 10 000 U)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>BioVendor</td><td>RP1782721000</td><td></td></tr><tr><td>Fibrin-alginate beads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alginate Lyase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td> <td>(krok 2.11.1)</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9326-150UN</td> <td>(Krok 2.1)</td></tr> <tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td> <td>(Krok 2.1)</td></tr> <tr><td>Fibrynogen (250 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F3879</td> <td>(Krok 2.2)</td></tr> <tr><td>Alginian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W201502</td> <td>(Krok 2.3) Użyj do roztworu alginianu</td></tr> <tr><td>< mocny > Płynny marmur < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP</td><td>Dyneon GmbH 3M AdMD</td><td>A-66670</td><td></td></tr><tr><td>Badanie morfologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, dla komórek ssaków</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td>(Krok 4.1.) Emitowana fluorescencja: 494 nm dla kalceiny, 528 nm dla EthD-1; miara: 517 nm dla kalceiny, 617 nm - EthD-1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>medium montażowe</td></tr><tr><td><mocne>Badanie ultrastrukturalne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>2,5% końcowe zagęszczenie (Krok 4.2.1.)</td></tr><tr><td>LR Biała żywica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9774</td> <td>(krok 4.2.4.)</td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td> <td>(krok 4.2.5.)</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O5500</td> <td>(krok 4.2.3.)</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Służy do przygotowania 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,2)</td></tr> <tr><td>Octan uranylu</td><td>POCH</td><td>868540111</td> <td>(Krok 4.2.4.)</td></tr><tr><td>Specjalistyczne narzędzia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm Szalka Pteri</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>60 mm IVF Szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Grid Premium Pipeta do obsługi komórek</td><td>RI Life Sciences</td><td>8-72-288</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Tip</td><td>RI Life Sciences</td><td>8-72-4155/20</td><td></td></tr><tr><td>Stół grzewczy</td><td>SEMIC</td><td></td><td>Można używać innych marek</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AIC-PE</td><td>Można używać innych marek</td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego (10 cm)</td><td>NEST Biotechnology</td><td>704002</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe z 0,2 i mikro; m</td><td>GOOGLAB SCIENTIFIC</td><td>GB-30-022PES</td><td></td></tr><tr><td>Termos</td><td>Quechua</td><td>5602589</td><td>Można stosować inne marki</td></tr></tbody></table>

hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

W biologii rozrodu, rewolucja biotechnologiczna, która rozpoczęła się od technologii sztucznego zapłodnienia i transferu zarodków, doprowadziła do rozwoju technik wspomaganego rozrodu, takich jak dojrzewanie komórek jajowych in vitro (IVM), zapłodnienie in vitro (IVF) i klonowanie zwierząt domowych poprzez transfer jądrowy z komórki somatycznej. IVM jest metodą o szczególnym znaczeniu. Jest to technologia platformowa do dostarczania dojrzałych, dobrej jakości oocytów do zastosowań takich jak skrócenie odstępu pokoleniowego u gatunków ważnych komercyjnie lub zagrożonych, badania nad rozrodem człowieka in vitro oraz produkcja zwierząt transgenicznych do terapii komórkowych. Termin jakość oocytów obejmuje jego zdolność do pełnego dojrzewania, zapłodnienia, co skutkuje zdrowym potomstwem. Oznacza to, że dobrej jakości oocyty mają kluczowe znaczenie dla udanego zapłodnienia, w tym procedur IVF. Stwarza to wiele trudności w opracowaniu niezawodnej metody hodowli, która wspierałaby wzrost nie tylko ludzkich oocytów, ale także innych dużych gatunków ssaków. Pierwszym krokiem w IVM jest hodowla komórek jajowych in vitro. W pracy opisano dwa protokoły hodowli 3D oocytów świń. W pierwszym, modelowym 3D kompleksy wzgórko-oocytów (COC) są zamknięte w przenikającej się sieci kulek fibrynowo-alginianowych, w której mieszanina fibryny i alginianu jest żelowana jednocześnie. W drugim COC są zawieszane w kropli pożywki i otaczane cząstkami proszku fluorowanego etylenu propylenu (FEP; kopolimer heksafluoropropylenu i tetrafluoroetylenu) w celu utworzenia mikrobioreaktorów zdefiniowanych jako płynne kulki (LM). Oba systemy 3D utrzymują gazowe środowisko hodowli in vitro. Utrzymują również organizację COC 3D, zapobiegając ich spłaszczeniu i wynikającemu z tego przerwaniu połączeń szczelinowych, zachowując w ten sposób funkcjonalny związek między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi.

W kompleksach cumulus-oocyt (COC) w obu systemach IVM komórki granulosa przylegały ściśle do siebie, a większość odzyskanych COC posiadała nienaruszone warstwy komórek cumulus (Rysunek 1A,B). Dodatkowo zachowano znaczną proporcję komórek cumulus.
Wyniki uzyskane z analizy żywotności kompleksów cumulus-oocyt (COC) potwierdziły, że oba systemy zastosowane do enkapsulacji oocytów świńskich w warunkach 3D in vitro zapewniły optymalne warunki wzrostu (...

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Ten protokół enkapsulacji oocytów świń umożliwia utrzymanie sferycznej organizacji COC. Zapobiega to ich spłaszczeniu i w konsekwencji przerwaniu połączeń szczelinowych między oocytem a otaczającymi komórkami pęcherzykowymi. Głównymi zaletami dwóch opisanych protokołów jest to, że są przyjazne dla użytkownika i pozwalają na skuteczną kontrolę przeżycia zarówno komórek jajowych, jak i chemiocytów.Oba systemy hodowli są cennymi narzędziami do podstawowych badań w dziedzinie biologii rozrodu i mogą mieć znaczenie kliniczne dla poprawy leczenia niepłodności. Mogą być również stosowane do opracowywania nowatorskich metod biotechnologicznych i ulepszania zwierząt gospodarskich. Po wypłukaniu jajników przenieś je do zlewki wypełnionej pożywką HM i przechowuj w inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza podczas wszystkich kolejnych manipulacji.Odessać płyn pęcherzykowy z dużych pęcherzyków wieprzowych i odwirować go w temperaturze 100 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltruj supernatant za pomocą sterylnej strzykawki podłączonej do filtra porowego z membraną o średnicy 0,2 mikrometra i zamroź go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wyizolować COC ze średniej wielkości pęcherzyków, przenieś dwa do trzech jajników na sterylną 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną HM. Delikatnie przeciąć powierzchnię wystających pęcherzyków jajnikowych sterylnym ostrzem chirurgicznym numer 15, co spowoduje, że płyn pęcherzykowy i COC wypłyną na szalkę Petriego.Odessać zawartość pęcherzyków za pomocą igły o rozmiarze 28 dołączonej do jednorazowej strzykawki i przenieść ją na inną szalkę Petriego. Aby przygotować szalki Petriego do zapłodnienia in vitro, dodaj jeden mililitr HM do centralnych studzienek i umieść trzy do czterech kropli HM w zewnętrznych pierścieniach. Następnie za pomocą mikropipety z poliwęglanu przenieś nieuszkodzone COC do kropli HM w pierścieniach zewnętrznych i krótko je przepłucz trzy do czterech razy.Po zakończeniu przenieś je indywidualnie do centralnej studni. Przechowywać płytki IVF w inkubatorze. Przygotować roztwory trombiny i fibrynogenu zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu.W dniu zabiegu roztwór fibrynogenu należy powoli rozmrozić na lodzie, a tuż przed użyciem doprowadzić go do temperatury pokojowej. Wymieszaj 0,5% roztwór alginianu i roztwór fibrynogenu w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów i delikatnie wymieszaj mieszaninę. Naprawa komór inkubacyjnych poprzez nakładanie cienkich pasków filmu parafinowego na szklane szkiełka mikroskopowe.Odpipetować 7,5 mikrolitra kropli mieszaniny FA na szkiełko pokryte parafiną za pomocą przekładek rozdzielających, umieszczając od ośmiu do 10 kropli ułożonych w dwóch rzędach. Za pomocą mikropipety przenieś od trzech do pięciu COC do środka kropli FA, wraz z minimalną objętością pożywki do dojrzewania. Dodaj 7,5 mikrolitra roztworu trombiny na wierzch każdej kropli FA, aby ją przykryć.Nie ma potrzeby ich mieszania, ponieważ żel tworzy się niemal natychmiast. Przykryj komorę inkubacyjną wcześniej przygotowanym szkiełkiem podstawowym, następnie odwróć komorę do góry nogami i umieść ją na 100-milimetrowej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 38 stopni Celsjusza na pięć do siedmiu minut.Po inkubacji przenieść każdą kapsułkę FA do studzienki z 96-dołkową płytką zawierającą 100 mikrolitrów pożywki do dojrzewania. Co dwa dni zastępować połowę pożywki świeżą, wstępnie zrównoważoną pożywką dojrzewającą. Obraz COC wykorzystuje mikroskop światła odwróconego przy 10-krotnym powiększeniu.Po hodowli COC przez cztery dni, usunąć pożywkę dojrzewającą ze studzienek i dodać 100 mikrolitrów 10 jednostek międzynarodowych na mililitr lizatu algenianowego w DMEM. Pozostaw płytkę hodowlaną w inkubatorze na 25 do 30 minut. Usunąć COC z rozpuszczonych kapsułek.Umyj je kilka razy w DMEM, a następnie przenieś do wewnętrznego pierścienia naczynia do zapłodnienia in vitro zawierającego PBS. Przygotuj podłoże z pięciu gramów proszku FEP na 30-milimetrowej szalce Petriego. Rozprowadzić pojedynczą kroplę pożywki dojrzewającej zawierającej od trzech do pięciu COC na proszek FEP.Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząstki całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą płynne kulki lub LM. Przygotuj kilka 60-milimetrowych szalek Petriego IVF i dodaj trzy do czterech mililitrów sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby utworzyć komorę wilgotności. Podnieś uformowany LM za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i umieść go w studzience centralnej.Inkubuj kulki przez cztery dni w temperaturze 38 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Aby zmienić pożywkę, nałóż 30 mikrolitrów pożywki dojrzewającej na każdy LM, co spowoduje jego rozprzestrzenianie się. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżej pożywki dojrzewającej na szalce Petriego.Po trzech do czterech myciach w pożywce dojrzewającej przenieś COC wraz z 30 mikrolitrami świeżej pożywki na złoże proszkowe FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą nowy LM. Następnie przenieś LM na szalkę Petriego IVF. Oba systemy dojrzewania in vitro wytworzyły COC z komórkami ziarnistości, które były ściśle przylegające do siebie i nienaruszonymi warstwami komórek wzgórka.Analiza żywotności COC potwierdziła, że w obu systemach enkapsulacji osiągnięto optymalne warunki wzrostu. W obu grupach zaobserwowano jedynie miejsca oocytów o wysokiej żywotności. Oocyty zobrazowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.Mitochondria były równomiernie rozmieszczone i miały kształt przypominający muszlę. Tylko kilka z nich było wydłużonych, a ich grupowanie obserwowano sporadycznie. Retikulum endoplazmatyczne było albo związane z mitochondriami, albo wolne w cytoplazmie oocytów.Kropelki cieczy pojawiły się w postaci małych, ciemnych, okrągłych struktur, a aparat Golgiego wyłonił się z rozszerzonymi cysternami. Ważne jest, aby zachować precyzję i ostrożność podczas przenoszenia kapsułek FA z komory inkubacyjnej do płytek hodowlanych oraz podczas pobierania i przenoszenia formatu LM na szalkę Petriego do IVF.

proteolytically-degraded-alginate-hydrogels-hydrophobic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Ten film opisuje protokoły hermetyzacji kompleksów wzgórko-oocytów świń (COC) w kulkach fibrynowo-alginianowych w celu stworzenia hodowli 3D. Ten system dojrzewania in vitro utrzymuje normalną komunikację między komórkami, zapewniając dojrzewanie oocytów i zachowując ich żywotność.

Hodowla 3D COC świń: procedura kapsułkowania kompleksów oocytów cumulusa w kulkach hydrożelowych z polimeru fibrynowo-alginianowego

W tym filmie opisujemy protokół enkapsulacji oocytów świń w hydrofobowych mikrobioreaktorach.

System mikrobioreaktora z płynnego marmuru: protokół hodowli 3D do enkapsulacji oocytów świń

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Przedstawiono protokół komobilizacji biokatalizatorów całych komórek w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego wykorzystania, na przykładzie produkcji L-ksylulozy. Regenerację kofaktora uzyskuje się poprzez sprzężenie dwóch szczepów Escherichia coli wykazujących ekspresję funkcjonalnie uzupełniających się enzymów; Immobilizacja biokatalizatora całej komórki odbywa się poprzez enkapsulację komórek w kulkach alginianu wapnia.

Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

Ten film i rękopis opisują metodę opartą na emulsji do kapsułkowania komórek ssaków w kulkach alginianowych od 0,5% do 10%, które mogą być produkowane w dużych partiach za pomocą prostego mieszanego naczynia. Zamknięte w kapsułkach komórki mogą być hodowane in vitro lub przeszczepiane do zastosowań w terapii komórkowej.

Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem

Obecny protokół opisuje wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) na bazie poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) za pomocą opartej na pojedynczej emulsji technologii mikroprzepływowej. Mikrosfery te mają potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej i badaniach przesiewowych leków.

Wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) za pomocą technologii mikroprzepływowej

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Poznaj metody enkapsulacji oocytów świń w hydrożelach alginianowych i mikrobioreaktorach hydrofobowych. Techniki te zachowują strukturę kompleksów COC i zwiększają ich przeżywalność w badaniach biologii rozrodu.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Przeglądaj więcej filmów