Charakterystyka właściwości transportowych wewnątrz chrząstki kationowych nośników peptydowych

Scharakteryzowanie właściwości transportowych środków terapeutycznych i ich nośników ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia skutecznych odpowiedzi biologicznych. Metody te pomagają w projektowaniu optymalnie naładowanych nośników leków do celowania w ujemnie naładowane tkanki. Główną zaletą tych technik jest ich zdolność do lepszego przewidywania skuteczności terapeutycznej in vivo poprzez serię eksperymentów in vitro, które charakteryzują transport substancji rozpuszczonej przez tkankę.

Choroby chrząstek, takie jak choroba zwyrodnieniowa stawów, pozostają nieleczone ze względu na niezdolność leków do przenikania przez gęstą beznaczyniową macierz chrząstki, co wymaga nośników leków do prologu skuteczności terapeutycznej. Zacznij od użycia delikatnej chusteczki do delikatnego usuwania nadmiaru PBS z powierzchni eksplantatów chrząstki o średnicy trzech milimetrów i grubości jednego milimetra. Użyj wagi, aby szybko zarejestrować mokrą masę każdego eksplantatu i natychmiast umieść eksplantaty w kąpieli PBS, aby zapobiec odwodnieniu.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów świeżo przygotowanego, 30 mikromolowego, fluorescencyjnie znakowanego roztworu nośnika peptydów kationowych na studzienkę do wewnętrznych dołków 96-dołkowej płytki i użyj szpatułki, aby dodać jeden eksplant do każdej studzienki roztworu. Napełnij każdą z otaczających studzienek 300 mikrolitrami PBS i przykryj płytkę pokrywką. Uszczelnij krawędzie płytki elastyczną folią, aby zminimalizować parowanie i umieść płytkę na wytrząsarce w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny przy 50 obrotach na minutę, z orbitą 15 milimetrów.

Pod koniec inkubacji przenieść kąpiel równowagową z każdej studzienki do pojedynczych probówek polipropylenowych i wykonać seryjne rozcieńczenia z podstawowego 30-mikromolowego roztworu nośnika peptydów kationowych w celu wygenerowania krzywej wzorcowej. Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdego roztworu i wzorca do indywidualnych dołków czarnej 96-dołkowej płytki i uzyskaj odczyty fluorescencji każdej próbki i wzorca w oparciu o długości fal wzbudzenia i emisji znacznika fluorescencyjnego. Aby określić głębokość penetracji nośnika peptydów kationowych w eksplantacie chrząstki, użyj skalpela, aby przeciąć eksplantaty chrząstki o średnicy sześciu milimetrów i grubości jednego milimetra na pół i uwodnić powstałe kawałki półdysku PBS uzupełnionym inhibitorem proteusza.

Nałóż żywicę epoksydową na środek studzienki specjalnie zaprojektowanej jednowymiarowej komory transportowej i zabezpiecz jeden eksplant półdyskowy w studni powierzchniową stroną eksplantatu skierowaną w górę komory. Usuń nadmiar kleju ze studzienki, aby zapobiec kontaktowi z powierzchnią dyfuzyjną chrząstki i dodaj 80 mikrolitrów PBS uzupełnionego inhibitorem proteazy po obu stronach eksplantatu. Odpipetuj płyn w górę iw dół po jednej stronie eksplantatu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków na drugą stronę.

Jeśli nie ma wycieku, zastąp PBS uzupełniony inhibitorem proteazy od strony górnej 80 mikrolitrami 30 mikromolowego roztworu nośnika peptydów kationowych znakowanego fluorescencją i ostrożnie umieść komorę transportową w naczyniu do hodowli komórkowych. Przykryj dno naczynia PBS, aby uniknąć parowania roztworu nośnika peptydów kationowych. Zwracanie uwagi na to, aby nie było bezpośredniego kontaktu między roztworami z komory przed i za komorą.

Umieść przykryte naczynie na wytrząsarce, aby ograniczyć sedymentację cząstek przez cztery lub 24 godziny w temperaturze pokojowej i 50 obrotach na minutę, z orbitą 15 milimetrów. Pod koniec inkubacji wyjmij eksplantaty z komory i pokrój plastry o grubości około 100 mikronów ze środka każdego eksplantatu. Umieść każdy plasterek eksplantatu między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i nawodnij plastry świeżym PBS uzupełnionym inhibitorem proteazy.

Zamocuj szkiełko na stoliku mikroskopu konfokalnego i uzyskaj stos obrazów fluorescencyjnych Z na całej grubości wycinka przy 10-krotnym powiększeniu. Otwórz plik obrazu i obraz J, kliknij Obraz i wybierz Stosy i Projekt Z z menu rozwijanego. Następnie wprowadź numery wycinków od jednego do ostatniego wycinka i w obszarze Typ projekcji wybierz średnią intensywność i kliknij przycisk OK.

Aby ocenić szybkość dyfuzji chrząstki nośnej peptydu kationowego kationowego, należy zmontować każdą połowę komory transportowej, aby zawierała jedną dużą gumową uszczelkę, jedną wkładkę z polimetakrylanu metylu i jedną małą gumową uszczelkę. Zmierz grubość eksplantatu chrząstki, a następnie umieść eksplant w dołkach plastikowej wkładki powierzchnią skierowaną w stronę górnej komory i ułóż dwie połówki razem, aby zakończyć montaż. Użyj klucza, aby mocno skręcić połówki ze sobą przed napełnieniem górnej komory dwoma mililitrami PBS uzupełnionego inhibitorem proteazy.

Sprawdź komorę wylotową pod kątem wycieków z komory wylotowej. Jeśli nie zostanie wykryty żaden wyciek, napełnij dolną komorę dwoma mililitrami PBS uzupełnionego inhibitorem proteazy. Dodaj pojedynczą mini listwę mieszającą zarówno do górnej, jak i dolnej komory i umieść komorę na płytce mieszającej z komorą ustawioną w taki sposób, aby laser ze spektrofotometru był skupiony w kierunku środka dolnej komory.

Z częścią odbierającą sygnał spektrofotometru za komorą wylotową, zbieraj stabilne odczyty emisji fluorescencji w czasie rzeczywistym przez co najmniej pięć minut. Po uzyskaniu stabilnego odczytu dodać wstępnie obliczoną objętość znakowanego fluorescencyjnie roztworu podstawowego nośnika peptydów kationowych do komory wylotowej do końcowego stężenia kąpieli wynoszącego trzy mikromolowe i monitorować dalszy sygnał fluorescencyjny, pozwalając transportowi substancji rozpuszczonej osiągnąć stały wzrost nachylenia. Po osiągnięciu stanu ustalonego przenieś 20 mikrolitrów roztworu z komory wylotowej do komory wylotowej w celu przeprowadzenia testu skokowego i zbierz odczyty fluorescencji w czasie rzeczywistym.

Zbyt wysoki ładunek dodatni ograniczy penetrację substancji rozpuszczonej do strefy powierzchownej, ponieważ nośnik zbyt silnie wiąże się z ujemnie naładowanymi grupami agrekanów macierzy chrząstki. I odwrotnie, nośniki, które są w stanie wykorzystać słabe i odwracalne oddziaływania ładunku, przenikają przez głęboką strefę tkanki. Optymalnie naładowany nośnik leku nie tylko przenikałby do głębokich stref tkanki, ale wykazywałby również wysoki wychwyt wewnątrztkankowy, który można określić za pomocą pomiarów fluorescencyjnych kąpieli równowagowej i mokrej masy tkanki, jak pokazano.

Eksperymenty z transportem dyfuzji nierównowagowej skutkują uzyskaniem krzywej generowanej przez dane o stopniowo rosnącym nachyleniu. Początkowa część krzywej reprezentuje dyfuzję substancji rozpuszczonej przez chrząstkę, gdy zachodzą interakcje wiążące matrycę substancji rozpuszczonej. Gdy substancje rozpuszczone dotrą do dolnej komory, nachylenie krzywej zwiększa się wraz ze wzrostem odczytów fluorescencji w czasie.

Ta druga część krzywej osiąga następnie stałe nachylenie, reprezentujące dyfuzję w stanie ustalonym. Punkt przecięcia X linii stycznej narysowanej w części krzywej w stanie ustalonym wskazuje czas potrzebny do osiągnięcia dyfuzji w stanie ustalonym lub opóźnienia tau. Po przeniesieniu roztworu z komory przed do dolnej obserwuje się skok fluorescencji, w którym to momencie ustabilizowana intensywność fluorescencji może być wykorzystana do skorelowania fluorescencji ze stężeniem.

Następnie można obliczyć reprezentatywne wartości efektywnej dyfuzyjności i dyfuzji w stanie ustalonym, jak wskazano. Należy zauważyć, że dyfuzyjność w stanie ustalonym jest o dwa rzędy wielkości wyższa niż dyfuzyjność efektywna w wyniku zajęcia wszystkich miejsc wiązania opartych na ładunku. Tak więc w tym momencie dyfuzja opiera się na wielkości, a nie na ładunku, co skutkuje podobnymi wartościami dyfuzji w stanie ustalonym wśród CPC o tej samej wielkości.

Utrzymuj nawodnienie eksplantatów i minimalizuj parowanie roztworu przez cały czas trwania eksperymentu, aby zapobiec zmianom odpowiednio w morfologii chrząstki i stężeniu roztworu oraz zapewnić dokładne i powtarzalne pozyskiwanie danych. Po zaprojektowaniu optymalnie naładowanego nośnika leku, różne techniki koniugacji mogą być wykorzystywane do modyfikowania leków w celu lepszego ukierunkowania na tkanki i ułatwienia oceny ich skuteczności biologicznej.