Name: Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę izolacji bakterii jelitowych z komarów i ich identyfikacji przez sekwencjonowanie 16S rRNA. Naucz się deplecji mikrobioty antybiotykami oraz doustnego wprowadzania szczepów w celu oceny wpływu na fizjologię gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81902094, 81600497) oraz Projekt Planu Nauki i Technologii prowincji Hunan (2019RS1036).

1. Sekcja jelita środkowego i izolacja bakterii hodowlanych 
<ol>
	<li>Przygotuj komara do sekcji.
	<ol>
		<li>Zbierz komary 7–9 dni po pojawieniu się za pomocą aspiratora. Znieczulenie zebranych komarów należy poddać działaniu temperatury 4 °C przez 3–5 minut i przechowywać znieczulone komary na lodowatej szalce Petriego do czasu sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysterylizuj instrumenty laboratoryjne i powierzchnię komara.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj stanowisko eksperymentalne, mikroskop preparacyjny, kleszcze i szkiełko podstawowe, rozpylając 75% etanolu, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami z otoczenia.</li>
		<li>Przygotuj sterylną szalkę Petriego zawierającą 75% etanolu i dwie szalki Petriego zawierające sterylną 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS).</li>
		<li>Wysterylizuj powierzchnię komara, zanurzając go i potrząsając nim w 75% etanolu przez 3 minuty, a następnie dwukrotnie spłucz buforem 1x PBS na wypadek, gdyby etanol wpłynął na wypreparowaną florę jelitową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj jelito środkowe komara.
	<ol>
		<li>Przenieś wysterylizowanego powierzchniowo komara na szklane szkiełko z kroplą sterylnego buforu 1x PBS. Przeprowadź sekcję pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Pod dolnym powiększeniem mikroskopu preparacyjnego ostrożnie usuń nogi, skrzydła i głowę komara, aby zapobiec ucieczce. Usuń ostatni somit komara, tnąc go bezpośrednio, a nie ciągnąc, aby zapobiec pęknięciu przewodu pokarmowego.</li>
		<li>Zaciśnij klatkę piersiową komara i koniec brzucha kleszczami. Delikatnie wyciągnij przewód pokarmowy komara. Nabyty przewód pokarmowy zwykle zawiera plon, jelito przednie, jelito środkowe, jelito tylne i rurki Malpighiana.</li>
		<li>Ustaw mikroskop preparacyjny na większe powiększenie. Usuń plon, jelito przednie, jelito tylne i rurki Malpighiana z wypreparowanego przewodu pokarmowego, aby uzyskać jelito środkowe komara.</li>
		<li>Zachowaj ostrożność podczas usuwania plonu, ponieważ plon nadyma się i przypomina jelito środkowe po spożyciu posiłku z cukrem. Rurki Malpighiego, grupa długich i cienkich rurek wydalniczych, znajdują się na granicy między jelitem środkowym a tylnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izoluj bakterie jelitowe.
	<ol>
		<li>Przenieś wypreparowane jelito środkowe do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml z 200 μl sterylnego buforu 1x PBS.</li>
		<li>Dokładnie zmiel jelito środkowe na sterylnej ławce sterylnym tłuczkiem, aby umożliwić całkowite uwolnienie bakterii jelitowych do buforu.</li>
		<li>Seryjnie rozcieńczyć homogenat do trzech 10-krotnych rozcieńczeń. Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia do płytki agarowej LB (bulion Luria), a następnie rozprowadzić na płytce. Jeśli jelito środkowe zawiera wysokie stężenie flory jelitowej, konieczne jest wykonanie większej liczby seryjnych rozcieńczeń, aby wybrać pojedyncze kolonie.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1–2 dni, aż pojawią się pojedyncze kolonie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja gatunku
	<ol>
		<li>Wybierz pojedyncze kolonie i zaszczep je odpowiednio w stożkowej kolbie o pojemności 150 ml zawierającej 50 ml pożywki bulionowej LB.</li>
		<li>Wstrząśnij bakteriami w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Ekstrakcja całkowitego DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego. Amplifikacja 16S rDNA metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). 
		UWAGA: W 16S rDNA istnieje wiele segmentów, które są konserwatywne. W oparciu o te konserwatywne regiony, uniwersalne startery dla bakterii mogą być zaprojektowane do amplifikacji fragmentów 16S rDNA wszystkich bakterii. Te startery są specyficzne dla bakterii, a różnica w zmiennym regionie 16S rDNA może być wykorzystana do rozróżnienia różnych bakterii. Dlatego 16S rDNA jest szeroko stosowany do identyfikacji bakterii.</li>
		<li>Odzyskaj i oczyść fragmenty DNA z produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i komercyjnego zestawu do odzyskiwania żelu.</li>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie DNA na oczyszczonych fragmentach DNA, aby uzyskać sekwencje genów bakteryjnych.</li>
		<li>Porównaj sekwencję genu 16S rRNA z sekwencją bakteryjną dostępną w GenBank. Wybierz bazę danych Bakterie i archeony. 
		UWAGA: Identyfikacja na poziomie gatunku została zdefiniowana jako ≥99% podobieństwo sekwencji 16S rDNA do najbliższego wpisu GenBank. Izolat przypisano do odpowiedniego rodzaju, gdy jego podobieństwo sekwencji 16S rDNA wynosiło <99% i ≥95%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Antybiotykoterapia i reintrodukcja bakterii
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór antybiotyku.
	<ol>
		<li>Zważyć wymaganą ilość sacharozy, penicyliny i streptomycyny, aby przygotować 10% roztwór sacharozy zawierający 20 jednostek penicyliny i 20 μg streptomycyny na ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakarm komary roztworem antybiotyku.
	<ol>
		<li>Znieczulać komary w temperaturze 4 °C przez 3–5 minut. Przenieść komary do papierowego kubka. Przykryj górę gazą i owiń gazę taśmą, aby zapobiec ucieczce komarów.</li>
		<li>Zanurz sterylne waciki w roztworze antybiotyku i ostrożnie umieść je na kubku na komary. Ściśnij waciki przed użyciem, aby komary nie utonęły w kapiących wacikach.</li>
		<li>Przykryj waciki 10-centymetrową szalką Petriego, aby zapobiec parowaniu wilgoci. Wymieniaj waciki dwa razy dziennie przez trzy kolejne dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź skuteczność antybiotykoterapii.
	<ol>
		<li>Zgodnie z powyższą metodą należy wyciąć jelito środkowe komarów leczonych antybiotykami.</li>
		<li>Przenieś wypreparowane jelita środkowe do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml z 200 μl sterylnego buforu 1x PBS.</li>
		<li>Dokładnie zmiel jelito środkowe w sterylnej ławce sterylnym tłuczkiem, aby umożliwić całkowite uwolnienie bakterii jelitowych do buforu.</li>
		<li>Wyodrębnij DNA drobnoustrojów jelitowych za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego.</li>
		<li>Przeprowadź ilościowe oznaczanie bakterii metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) na genomowym DNA przy użyciu uniwersalnych starterów eubacteria (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT i R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
	<ol>
		<li>Zmierzyć roztwór bakteryjny za pomocą spektrofotometru. Dodaj 1 zawiesinę bakteryjną OD (OD600) do probówki o pojemności 1 ml. Odwirować zawiesinę o sile 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml sterylnego buforu 1x PBS do probówki o pojemności 1,5 ml w celu wytrącenia zawiesiny.</li>
		<li>Wirować przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C; odrzucić supernatant.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.4.2 i 2.4.3.</li>
		<li>Dodać 200 μl sterylnego buforu 1x PBS do wytrącania bakteryjnego.</li>
		<li>Dodać 600 μl 10% roztworu sacharozy, 200 μl 10 mm ATP (który działa jako fagostymulant) i 200 μl zawiesiny bakteryjnej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Wymieszaj przez wirowanie. Alternatywnie, zawiesić bakterie granulowane we krwi inaktywowanej termicznie.</li>
		<li>Przygotowanie krwi inaktywowanej termicznie
		<ol>
			<li>Zbierz świeżą krew za pomocą probówki przeciwzakrzepowej.</li>
			<li>Weź 2-3 ml świeżej krwi. Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia komórek osocza i krwi. Należy pamiętać, że krew zostanie utracona podczas procesu wirowania i mycia; Istnieje konieczność wcześniejszego obliczenia zużycia.</li>
			<li>Zebrać osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i inaktywować termicznie w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę.</li>
			<li>Dodać 500 μl sterylnego buforu 1x PBS do probówki o pojemności 1,5 ml do zawiesiny krwinek. Odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.</li>
			<li>Powtórz krok 2.4.7.4 dwukrotnie.</li>
			<li>Ponownie zawiesić komórki krwi za pomocą osocza inaktywowanego termicznie, aby uzyskać krew inaktywowaną termicznie.</li>
			<li>Wykonaj kroki od 2.4.1 do 2.4.4, aby uzyskać granulowanie bakteryjne 1 OD.</li>
			<li>Ponownie zawiesić bakterie ogranulowane 1 ml krwi inaktywowanej termicznie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakarm komara zawiesiną bakteryjną.
	<ol>
		<li>Głodzić komary przez 24 godziny, pozwalając antybiotykom metabolizować się przed karmieniem bakterii.</li>
		<li>Zmontuj system podawania membrany.</li>
		<li>Uszczelnij wysterylizowany podajnik parafilmem, alternatywnie membraną kolagenową.</li>
		<li>Załóż plastikowy pierścień i przymocuj go parafilmem, aby uniknąć pękania z powodu tarcia podczas karmienia.</li>
		<li>Powoli dodawaj przygotowany roztwór bakteryjny do podajnika. Należy pamiętać, że tylko jedna studzienka z dwudołkowego podajnika może być napełniona roztworem i przykryć jednostkę podajnika tylko od strony upuszczania odczynnika.</li>
		<li>Podłącz podajnik do systemu karmienia podgrzanego do 37 °C, który symuluje temperaturę człowieka w celu przyciągnięcia komarów. Umieść urządzenie do karmienia na papierowym kubku wypełnionym komarami i karm przez 90 minut.</li>
		<li>Po karmieniu znieczulij komary, poddając je działaniu temperatury 4 °C przez 3–5 minut i utrzymuj komary w stanie znieczulonym na lodowatej szalce Petriego.</li>
		<li>Wybierz w pełni nabrzmiałe komary do dalszych badań.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Problems+in+Pediatric+and+Adolescent+Health+Care%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li>
<li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+lifecycle+in+mosquito%3A+acquisition%2C+propagation+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1(2019).</li>
<li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69(2018).</li>
<li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li>
<li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70(2013).</li>
<li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li>
<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li>
<li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641(2013).</li>
<li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020(2017).</li>
<li>Guégan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188(2018).</li>
<li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li>
<li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li>
<li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+%28diptera%3A+culicidae%29%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites & Vectors. 4 (1), 105(2011).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li>
<li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844(2017).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li>
<li>Möhlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li>
<li>Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li>
<li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%2C+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li>
<li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li>
<li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186(2018).</li>
<li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria%3A+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141(2019).</li>
<li>Gonçalves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174(2019).</li>
<li>Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuss%2C+SK+%22Science%22">Science</a>. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).</li>
<li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li>
<li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401(2012).</li>
<li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+microbiota+and+metagenomics%2C+and+its+relevance+to+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li>
<li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badania nad interakcjami gospodarz-mikroorganizmy wykazały, że różne drobnoustroje jelitowe wpływają na fizjologię gospodarza poprzez rozbieżne mechanizmy. W tym artykule przedstawiono metodę badania odpowiedniej roli mikroorganizmów jelitowych komarów, w tym preparację jelita środkowego komara, hodowlę hodowanych bakterii jelitowych, antybiotykoterapię i ponowne wprowadzenie badanych bakterii.
Aby leczenie antybiotykami było skuteczne, podczas przeprowadzania eksperymentu należy wziąć pod uwa...

Komary są uważane za najważniejsze wektory chorób chorobotwórczych u ludzi, przenosząc ponad sto patogenów, w tym wirusa Zika, wirusa dengi i pasożyty Plasmodium1. Kiedy komary spożywają posiłek z krwi, aby pozyskać składniki odżywcze do składania jaj, mogą przypadkowo połknąć patogeny od zakażonego gospodarza za pośrednictwem przewodu pokarmowego2. Co ważne, jelito środkowe komara, które odgrywa kluczową rolę zarówno w trawieniu mączki z krwi, jak i wnikaniu patogenów, jest siedliskiem wysoce dynamicznego mikrobiomu3.
Kilka badań scharakteryzowało mikrobiotę komarów hodowaną w laboratorium i zbieraną w terenie, używając metody zależnej od kultury lub testu sekwencjonowania bakterii4,5,6. Gatunki takie jak Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia i Enterococcus są powszechnie izolowane od komarów w różnych badaniach5,7,8,9. Co ciekawe, mikrobiota jelitowa komarów ulega dynamicznym wahaniom zarówno pod względem różnorodności zbiorowisk, jak i liczby gatunków bakterii, na co wpływ ma etap rozwoju, gatunek, pochodzenie geograficzne i zachowania żywieniowe4. Badania pokazują, że karmienie krwią znacznie zwiększa całkowite obciążenie bakteryjne wraz z szybką ekspansją gatunków z Enterobacteriaceae i zmniejszeniem ogólnej różnorodności10,11. Ponadto mikrobiota jelitowa komara w stadium larwalnym jest zwykle eliminowana, gdy owad przechodzi metamorfozę podczas przepoczwarzania i ekrosji; W związku z tym nowo pojawiające się dorosłe komary muszą ponownie zasiedlić swoją mikrobiotę4.
Mikrobiota jelitowa moduluje fizjologię owadów w różnych aspektach, w tym wchłanianiu składników odżywczych, odporności, rozwoju, reprodukcji i kompetencji wektorowej12. Larwy komarów aksenicznych nie rozwijają się poza pierwsze stadium rozwojowe, podczas gdy doustne podawanie bakterii ratuje rozwój, co wskazuje, że mikrob jelitowy komara jest niezbędny do rozwoju larw13,14. Poza tym zubożenie bakterii jelitowych opóźnia trawienie mączki z krwi i wchłanianie składników odżywczych, wpływa na dojrzewanie oocytów i zmniejsza składanie jaj15. Ponadto komary z mikroflorą jelitową wywołują wyższą odpowiedź immunologiczną w porównaniu z komarami leczonymi antybiotykami, przy stale podwyższonej ekspresji peptydów przeciwdrobnoustrojowych przeciwko innym patogenom, które infekują16. W tych badaniach antybiotyki są zwykle podawane doustnie w celu usunięcia bakterii jelitowych, a następnie przeprowadza się eksperymenty w celu porównania różnicy między komarami aksenicznymi a komarami z drobnoustrojami komensalnymi. Jednak jelito środkowe komara jest siedliskiem zróżnicowanej społeczności drobnoustrojów, a każdy gatunek bakterii może wywierać odrębny wpływ na fizjologię gospodarza.
Mikrobiota komarów reguluje kompetencje wektorów z rozbieżnymi efektami. Kolonizacja przez Proteusa wyizolowana z komarów pochodzących z terenu na obszarach endemicznych dengi nadaje zwiększoną ekspresję peptydów przeciwdrobnoustrojowych i odporność na zakażenie wirusem dengi16. Entomopatogeniczny grzyb Beauveria bassiana aktywuje szlak immunologiczny Toll i JAK-STAT przeciwko infekcji arbowirusem17. Natomiast grzyb Talaromyces wyizolowany z jelita środkowego Aedes aegypti ułatwia zakażenie wirusem dengi poprzez modulację aktywności trypsyny jelitowej18. Ponadto Serratia marcescens wspomaga przenoszenie arbowirusa poprzez białko wydzielnicze o nazwie SmEnhancin, które trawi warstwę mucyny na nabłonku jelitowym komarów19.
Ta procedura zapewnia systematyczną i intuicyjną metodę preparowania jelita środkowego komara, izolacji kolonii bakterii nadających się do hodowli, identyfikacji gatunków bakterii i reintrodukcji poprzez karmienie doustne. Zapewnia reprezentatywne wyniki nawożenia krwi bakterią komensalną, Chryseobacterium meningosepticum, na rozwój jajników komarów i składanie jaj.

<table><tbody><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno-5&-trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td>Hydrat soli disodowej 5&prime-trifosforanu adenozyny został użyty do przygotowania roztworów wzorcowych adenozynotrifosforanu (ATP)</td></tr><tr><td>Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Samice komarów</td></tr><tr><td>Rurka przeciwzakrzepowa</td><td>BD Vacutainer</td><td>363095</td><td>Zbierz świeżą krew</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td>Sangon Biotech</td><td>F601620-0010</td><td>1,5 ml, naturalny, z podziałką, sterylny</td></tr><tr><td>Waciki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy tłuczek do mielenia tkanek</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619072-0001</td><td>70 mm Długi, stożkowy, niebieski, sterylny</td></tr><tr><td>absolut etanolu</td><td>Paini</td><td></td><td>Rozcieńczyć go do 75% etanolu</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>RWD</td><td>F11029</td><td>Rozwarstwienie</td></tr><tr><td>Karmienie membraną Hemotek System</td><td>Hemotek</td><td></td><td>Elementy systemu żywienia, w tym&nbsp; Regulator temperatury Hemotek, zespół zasilacza-obudowy, metalowy podajnik zmontowany.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td> do inkubatora <td>ZQZY-78AN Pętle</td><td></td></tr><tr><td>do inokulacji</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619312-0001</td><td>10 &mu; l, Żółty</td></tr><tr><td>LB Agar w proszku</td><td>Sangon Biotech A507003</td><td></td><td>Trypton 10,0 g, Ekstrakt drożdżowy 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.</td></tr><tr><td>LB Rosół w proszku</td><td>Sangon Biotech A507002</td><td></td><td>Trypton 10,0 g, Ekstrakt drożdżowy 5,0 g, NaCl 10,0 g.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi508</td><td></td></tr><tr><td>Kubek</td><td></td><td></td> papierowy <td>Umieść komar</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sangon Biotech</td><td>F104002</td><td>4 inx 125 ft</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sangon Biotech</td><td>F611203</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G prokaina sól hydrat</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606248</td><td>Biały proszek. Rozpuszczalny w wodzie, rozpuszczalny w metanolu, słabo rozpuszczalny w wodzie, etanol</td></tr><tr><td>Pojedynczy pipetor Channal Gilson</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny Siarczan streptomycyny</td><td>A610494 Sangon Biotech</td><td></td><td>to antybiotyk glukozaminowy, który zakłóca syntezę białek prokariotycznych.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td>Rozpuszczalny w wodzie, etanolu i metanolu, słabo rozpuszczalny w glicerolu i pirydynie.</td></tr><tr><td>Zestaw DNA bakterii TIANamp Ekstrakt</td> DNA <td>TIANGEN</td><td>DP302</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tkanina użytkowa - moskitiera Biała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mieszalnik Vortex</td><td>Scintic Industries</td><td>S1-0246</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka EP</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10X bufor PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607016</td><td>Ten produkt jest rozwiązaniem 10X. Przed użyciem należy go rozcieńczyć 10 razy. Wartość pH wynosi 7,4.</td></tr></tbody></table>

bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Jelito środkowe komara posiada bardzo dynamiczny mikrobiom, który wpływa na metabolizm gospodarza, reprodukcję, kondycję i kompetencje wektorowe. Przeprowadzono badania w celu zbadania wpływu drobnoustrojów jelitowych jako całości; Jednak różne drobnoustroje mogą wywierać różne efekty w stosunku do gospodarza. W tym artykule przedstawiono metodologię badania wpływu każdego konkretnego mikrobu jelitowego komara i potencjalnego mechanizmu.
Ten protokół składa się z dwóch części. Pierwsza część przedstawia, jak przeprowadzić sekcję jelita środkowego komara, wyizolować kolonie bakterii hodowlanych i zidentyfikować gatunki bakterii. Druga część przedstawia procedurę generowania komarów leczonych antybiotykami i ponownego wprowadzenia jednego określonego gatunku bakterii.

Środkowe jelita komarów traktowanych antybiotykami oraz grupy bez antybiotyków zostały pobrane w celu ekstrakcji DNA, a następnie przeprowadzono qPCR z użyciem uniwersalnych starterów bakteryjnych. Rysunek 1 przedstawia ekspresję bakteryjnego 16S rRNA w grupie kontrolnej oraz grupie traktowanej antybiotykami. Wyniki wykazują, że usunięto około 98% bakterii jelitowych, co potwierdza skuteczność sterylizacji jelit za pomocą penicyliny i streptomycyny.
Zastosowano opisane metody ...

Ten artykuł przedstawia protokół do badania wpływu poszczególnych bakterii jelitowych komarów, w tym izolację i identyfikację mikrobów hodowlanych w jelicie środkowym komarów, antybiotykowe zubożenie bakterii jelitowych komarów i ponowne wprowadzenie jednego konkretnego gatunku bakterii.

Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Jelito środkowe komara jest siedliskiem złożonej społeczności drobnoustrojów, które wpływają na metabolizm gospodarza, reprodukcję, sprawność i kompetencje weterynarza. Z każdym mikrobem jelitowym występuje inny efekt. Ten film przedstawia procedurę badania odpowiedniej roli każdego szczepu bakterii lub fizjologii gospodarza.Aby uzyskać kulturę kolonii bakterii jelitowych, należy wyciąć jelito środkowe komara w sterylnych warunkach. Zmielić wypreparowane jelito środkowe, serotologować i rozprowadzić na płytce agarowej. Wybierz pojedyncze kolonie z płytki i zidentyfikuj gatunki bakterii na podstawie ich sekwencji 16 genów SRNA.Karm komary ChZT Emboss zawierającym antybiotyki przez kolejne trzy dni, aby usunąć mikrobiotę jelitową. Skuteczność antybiotykoterapii można potwierdzić poprzez wypreparowanie jelita środkowego aseptycznego komara w celu przeprowadzenia testu jednostkowego tworzącego kolonie przed kolejnymi ekstremistami. Następnie ponownie wprowadź określone gatunki bakterii, które wcześniej wyizolowano z jelit komarów za pomocą doustnego testu karmienia.Wpływ bakterii na fizjologię gospodarza można ocenić, porównując komary nieleczone, komary leczone antybiotykami i komary,

a-bacterial-oral-feeding-assay-with-antibiotic-treated-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Liu, X. i inni. Bakteryjny test żywienia ustnego z komarami leczonymi antybiotykami. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje rozwarstwienie jelita śródżałowego komara w celu wyizolowania bakterii jelitowych. Jelita środkowe jest pobierane z przewodu pokarmowego, homogenizowane, aby uwalniać bakterie, i nakładane na agarze odżywczym w celu hodowli kolonii bakterii.

Izolacja bakterii z jelita śródżałowego komarów

Źródło: Liu, X. i inni. Bakteryjny test żywienia ustnego z komarami leczonymi antybiotykami. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje wyczerpanie rodzimej mikrobioty jelitowej u komarów przy użyciu roztworu sacharozy zawierającej antybiotyki. Następnie następuje kontrolowana rekolonizacja z zawiesiną bakteryjną dostarczaną przez system odżywiania błonowego, aby ustanowić zdefiniowaną populację bakterii w jelicie komarów.

Ustanowienie określonej populacji bakterii jelitowych u dorosłych komarów

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.

Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Przedstawiono protokół tworzenia sztucznej diety bez krwi do karmienia komarów Anopheles w niewoli. Dieta ta ma podobną wydajność do krwi kręgowców i wyzwala oogenezę i dojrzewanie jaj oraz daje zdolne do życia dorosłe potomstwo.

Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Poznaj metodę izolacji bakterii jelitowych z komarów i ich identyfikacji przez sekwencjonowanie 16S rRNA. Naucz się deplecji mikrobioty antybiotykami oraz doustnego wprowadzania szczepów w celu oceny wpływu na fizjologię gospodarza.

Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami

Przeglądaj więcej filmów