Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego
4 czerwca 2020
Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.
Ten protokół jest istotny, ponieważ dowiadujemy się, że komórki glejowe są niejednorodne regionalnie, morfologicznie, funkcjonalnie i genetycznie. Główną zaletą tej techniki jest to, że można badać trzy oddzielne podzbiory gleju z czterech różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego. Zademonstruję tę procedurę ja i Rachel Tinky, doktorantka w moim laboratorium.
Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć warstwę skórną wzdłuż linii środkowej głowy szczeniaka, zaczynając doogonowo i poruszając się rostralnie, aż dotrze do pyska. Unikaj głębokiego wrzynania się w czaszkę, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek. Pochylając głowę w dół, pociągnij warstwę skórną z każdej strony czaszki i za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, zaczynając od otworu wielkiego.
Rozsuń połówki czaszki za pomocą kleszczy z cienką końcówką, odsłaniając korę, móżdżek i pień mózgu. Po wystawieniu delikatnie wyjmij mózg z czaszki i umieść go na 10-centymetrowej szalce Petriego z 10 mililitrami PBS i roztworem antybiotyku. Upewnij się, że mózg pozostaje nieuszkodzony z przyczepioną tylną częścią mózgu.
Uszczypnij móżdżek za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy. Umieść w wyznaczonej stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów na lodzie. Oddziel śródmózgowie od kory mózgowej.
Usuń opony korowe i umieść je w przeznaczonej do tego stożkowej rurce. Tkanka musi być dokładnie zbadana, aby zapewnić całkowite usunięcie opon mózgowych. Jeśli komórki opon mózgowo-rdzeniowych pozostaną w hodowli, mogą być szkodliwe dla wzrostu komórek glejowych.
Aby wypreparować rdzeń kręgowy, umieść go brzuszną stroną do góry i użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby przeciąć kręgi, naprzemiennie po lewej i prawej stronie, aż tkanka rdzenia kręgowego zostanie odsłonięta. Delikatnie usuń rdzeń kręgowy i opony mózgowe i umieść je w przeznaczonej do tego stożkowej rurce na lodzie. Dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny z 0,53 milimolowym EDTA do każdej probówki z tkanką.
Rozetrzeć mieszaninę za pomocą 10-mililitrowej pipety około 20 razy. Następnie przenieś zawiesinę komórek do pustej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Inkubować roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 15 minut.
Delikatne mieszanie lizatów po ośmiu minutach. Po inkubacji dodać pięć mililitrów MGM i 200 mikrolitrów DNazy I po jednym do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr. Potaryj każdy lizat 10 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety.
Następnie pozostaw zawiesinę komórek na trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby niezdysocjowana tkanka mogła osiąść na dnie probówki. Przenieś zawiesiny komórek do nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek, pozostawiając niezdysocjowaną tkankę. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w pięciu mililitrach MGM i rozetrzyj go 20 razy Umieść zawiesiny komórek na powlekanych kolbach T25 i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Zmień nośnik po 24 godzinach, aby usunąć resztki komórek. Aby przeprowadzić izolację komórek prekursorowych oligodendrocytów, należy wstrząsać komórkami przez 15 godzin, a następnie wyjąć supernatant z kolby i umieścić go na sterylnej szalce Petriego. Inkubować supernatant w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.
Miesza się po 15 minutach, aby usunąć pozostały mikroglej. Usunąć nieprzylegający supernatant komórek, policzyć komórki i pokryć je powierzchnią pokrytą poli-D-lizyną w żądanym stężeniu. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na co najmniej jedną godzinę.
Następnie delikatnie zassać 95% pożywki i powoli dodawać ciepłą pożywkę OPC, pipetując ją do ścianki studzienki, aby zminimalizować zakłócenia OPC. Metodę tę wykorzystano do wykazania, że sygnalizacja interferonu gamma wpływa na różnicowanie i dojrzewanie OPC. Bez receptora interferonu gamma korowe OPC nie różnicują się w dojrzałe mielinizujące oligodendrocyty łatwo, o czym świadczy brak barwienia MBP.
Analizowano również ekspresję GFAP. Komórki z niedoborem interferonu gamma silnie eksprymują GFAP, co sugeruje, że mogą przyjmować fenotyp astrocytów. O regionalnej heterogeniczności komórek OUN świadczy zróżnicowana morfologia astrocytów w korze mózgowej, móżdżku, pniu mózgu i rdzeniu kręgowym.
Astrocyty z tego samego regionu mogą również wykazywać niejednorodność morfologiczną, co potwierdza pogląd, że ten podtyp glejowy jest wysoce dynamiczny. Zbadano również regionalne odpowiedzi OPC na różnicową stymulację cytokin. Sygnalizacja cytokin znacząco wpływa na zachowanie komórek macierzystych i odpornościowych oraz może wpływać na sposób, w jaki OPC różnicują się w dojrzałe oligodendrocyty mieliniczne.
Po regionalnej izolacji komórek glejowych komórki mogą być używane w różnych warunkach eksperymentalnych i kwasowych przy użyciu kilku technik, w tym immunohistochemii, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i Western blot.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół do izolacji in vitro wielu populacji komórek glialnych z centralnego układu nerwowego myszy (OUN), w tym regionalnej mikroglii, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów. Metodologia umożliwia badanie odrębnych fenotypów każdego rodzaju komórek glialnych w różnych systemach hodowli, podkreślając ich regionalną niejednorodność.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia komórek glialnych
Tło
- Komórki gleju wykazują regionalną niejednorodność w morfologii, funkcji i genetyce.
- Rozumienie odrębnych populacji komórek glialnych jest kluczowe dla badania ich ról w OUN.
- Ten protokół pozwala badaczom na zbadanie współdziałania różnych rodzajów komórek glialnych.
- Izolacja odrębnych populacji może dostarczyć wglądu w ich konkretny wkład w funkcjonowanie OUN.
Cel badania
- Opracowanie metody do izolacji określonych populacji komórek glialnych z różnych regionów OUN.
- Badanie fenotypowych cech izolowanych populacji komórek glialnych.
- Zbadanie regionalnych reakcji komórek prekursorowych oligodendrocytów na stymulację cytokinami.
Zastosowane metody
- Do izolacji komórek glialnych zastosowano metodologię hodowli komórkowej in vitro.
- Model biologiczny obejmuje komórki gleju pochodzące z fragmentów OUN myszy.
- Nie wymieniono przepływów multiomics.
- Kluczowe kroki obejmują sekcję, trypsynizację i techniki zawiesiny komórkowej.
- Określono czasy inkubacji i sadzenia komórek dla optymalnych wyników.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem izolował odrębne populacje komórek glialnych z różnych regionów OUN.
- Studium zauważyło, że sygnalizacja interferonu gamma wpływa na różnicowanie komórek prekursorowych oligodendrocytów.
- Astrocyty wykazywały heterogeniczność morfologiczną w zależności od regionu OUN, z którego pochodzą.
- Podkreślono potencjalne implikacje dla zrozumienia, jak sygnalizacja cytokin wpływa na zachowanie komórek glialnych.
Wnioski
- To badanie pokazuje wartościową metodę do analizy roli komórek glialnych w funkcji OUN.
- Umożliwiając izolację określonych podzbiorów glialnych, badacze mogą lepiej zrozumieć ich unikalny wkład.
- Ten protokół wspiera przyszłe badania dotyczące dynamiki komórek glialnych i ich reakcji na sygnały środowiskowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Regional heterogeneity of glial cells impacts target validation and mechanistic de-risking in CNS drug discovery. This protocol enables isolation of microglia, oligodendrocyte progenitor cells, and astrocytes from four murine CNS regions to support phenotypic screening and assay development. By providing disease-relevant systems with defined cellular composition, it improves predictive confidence in preclinical models and informs lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial subset phenotypes across cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord regions to clarify target biology and de-risk mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Provides reproducible isolation of microglia, OPCs, and astrocytes for consistent target engagement and pathway modulation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates regionally defined glial cultures for compound screening and assessment of cytokine-mediated effects on OPC differentiation and maturation.
- Operational Value: Standardizes glial preparation via mechanical dissociation and defined matrix plating to ensure assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports evaluation of regional glial responses to interferon gamma and other cytokines, informing biomarker alignment and pathophysiological relevance.
- Operational Value: Enables co-culture and single-cell-type systems to model glial-neuronal interactions and assess target-mediated outcomes in preclinical workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying validated glial populations for target validation, assay development, and mechanistic de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on regional glial heterogeneity and cytokine signaling pathways in CNS target modulation.
- Screening: Delivers standardized glial suspensions with defined cellular composition for reproducible compound screening and phenotypic readouts.
- Analytics: Enables quantitative measurements of glial differentiation, marker expression (e.g., MBP, GFAP), and functional responses to cytokine stimulation.
- Translational Research: Connects regional glial phenotypes to disease-relevant systems, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable glial isolation platform applicable across multiple CNS regions and experimental conditions for sustained R&D use.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in glial target validation through reduction of mechanistic ambiguity and region-specific functional insights.
- Operational Value: Standardized dissociation, plating, and cell separation workflows ensure reproducibility and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying glial target engagement and reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on regional glial phenotype data and cytokine response profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in neuroanatomy and sterile tissue dissection is required to isolate CNS regions and remove meninges without contamination.
- Access to centrifuges, pipettes, CO2 incubators, and coated culture flasks is necessary for glial dissociation, plating, and expansion.
- Standardization of trypsinization, DNase treatment, and trituration protocols across teams ensures consistent glial yield and viability.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., human iPSC-derived glia) requires validation of regional markers and dissociation efficiency.
- Limitations include the need for rapid tissue processing to maintain glial integrity and avoid meningeal cell overgrowth in culture.
