Ciągły elektroencefalogram wideo podczas niedotlenienia-niedokrwienia u nowonarodzonych myszy
11 czerwca 2020
Ten manuskrypt opisuje metodę ciągłych zapisów wideo EEG przy użyciu wielu elektrod głębokościowych u noworodków myszy poddawanych niedotlenieniu-niedokrwieniu.
Encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna jest najczęstszą przyczyną napadów padaczkowych u noworodków. Ten mysi model napadów niedotlenieniowo-niedokrwiennych i ciągła elektroencefalografia wideo lub EEG mogą pomóc w lepszym zrozumieniu i scharakteryzowaniu napadów u noworodków. Technika ta ułatwia pozyskiwanie wysokiej jakości nagrań wideo elektroencefalografii w modelu urazu noworodka i może pomóc w przyszłych badaniach nad mechanizmami napadów u noworodków, wynikami i testami terapeutycznymi.
Procedurę zademonstruje Pravin Wagley. Laborant z mojego laboratorium. Do zabiegu wszczepienia elektrody.
Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch bólowy u znieczulonej myszy po urodzeniu w dziewiątym dniu, umieść mysz w stadium stereotaktycznym ze stożkiem nosowym i użyj odwrotnej strony paska słuchowego, aby utrzymać głowę stabilnie. Wysterylizuj obszar nacięcia na czaszce za pomocą trzech naprzemiennych peelingów z betainą i 70% etanolem i użyj zasłony z fenestracją, aby przykryć mysz, zachowując widoczny obszar nacięcia. Otwórz skórę głowy z przodu z tyłu od nieco powyżej oczu i cofnij około pół centymetra skóry.
Ustaw głowę na etapie stereotaktycznym tak, aby skóra wyciągnęła się na zewnątrz, aby odsłonić czaszkę, i użyj bawełnianego wacika, aby nałożyć nadtlenek wodoru. Użyj ostrza skalpela, aby ostrożnie zeskrobać czaszkę do czysta. I nałóż około 50 mikrolitrów kropli kleju na kość.
Za pomocą aplikatora rozprowadź klej na czaszce i umieść klej w świetle ultrafioletowym na 40 sekund. Po związaniu kleju zmierz współrzędne, używając odsłoniętej bregmy jako odniesienia. I użyj igły o rozmiarze 32, aby utworzyć otwory elektrod obustronnie w obszarze CA1 hipokampa, obustronnie w korze ciemieniowej i móżdżku.
Oczyść krew z powierzchni czaszki i użyj ramienia stereotaktycznego, aby opuścić elektrody przymocowane do żeńskiego łącznika gniazda do mózgu. Wszczep każdą elektrodę do mózgu i zamocuj elektrody za pomocą akrylu dentystycznego. Przyklej zestaw słuchawkowy do czaszki za pomocą dodatkowego akrylu dentystycznego.
Podskórnie wstrzyknąć pięć miligramów na kilogram ketoprofenu każdemu szczeniakowi. Gdy wszystkie elektrody zostaną zabezpieczone w co najmniej połowie miotu, zwróć młode do matki. 24 godziny po implantacji elektrody umieść każde zwierzę w specjalnie wykonanej komorze z pleksiglasu o temperaturze 37 stopni Celsjusza do rejestracji EEG i użyj elastycznego, specjalnie wykonanego wzmacniacza operacyjnego, aby podłączyć szczenięta do systemu monitorowania wideo EEG.
Użyj wielokanałowego wzmacniacza różnicowego, aby zdigitalizować dane EEG z częstotliwością 1000 Hz z przyrostem jednego kilograma i przejrzeć sygnał EEG w odpowiednim oprogramowaniu do analizy. Następnie rejestruj podstawowe EEG przed urazem przez 30 minut, zanim odłączysz zwierzęta do procedury sądowej dotyczącej tętnicy szyjnej. Po zarejestrowaniu wyjściowych danych EEG wysterylizuj skórę między żuchwą a obojczykiem po lewej stronie szyi betainą i etanolem, jak pokazano.
I wykonaj około jednocentymetrowe nacięcie po lewej stronie szyi. Umieść szczenię pod mikroskopem preparacyjnym i ostrożnie cofnij tkankę podskórną i skórę, aby odsłonić tętnicę szyjną. Umieść pięciocentymetrowy kawałek sterylnego jedwabnego szwu pod tętnicą.
Zidentyfikuj nerw błędny i delikatnie oddziel i wycofaj nerw z tętnicy. Manewruj szwem tak, aby znajdował się tylko pod tętnicą. Po zidentyfikowaniu nerwu błędnego delikatnie oddziel i wycofaj nerw z tętnicy i za pomocą mikrokleszczyków przeciągnij pod tętnicą pięciocentymetrowy kawałek sterylnego jedwabnego szwu.
Zawiąż podwójnie zawiązany szew wokół tętnicy, aby zatkać przepływ i odciąć nadmiar szwu. Wymień tkankę podskórną i skórę nad odsłoniętą tętnicą i użyj Vetbond do uszczelnienia nacięcia. Następnie umieść zwierzę z powrotem w ciągłym monitorowaniu EEG w komorze o temperaturze pokojowej umieszczonej na ocieplającym materacu i wykonaj punktowe pomiary temperatury w podczerwieni temperatury rdzenia szczeniaka, aby uniknąć otwarcia komory.
Po pozostawieniu szczeniąt na regenerację przez godzinę z ciągłym monitorowaniem wdychanej frakcji tlenu, przepłucz komorę 60 litrami na minutę 100% azotu i 0,415 litra na minutę 100% tlenu. Gdy nasycenie tlenem w komorze osiągnie 12%, zmniejsz przepływ azotu do 10 litrów na minutę, utrzymując przepływ tlenu na niezmienionym poziomie. Dokonując niewielkich korekt w razie potrzeby, utrzymuj frakcję wdychanego tlenu na poziomie 8% przez 45 minut.
Po 45 minutach ekspozycji na hipoksję przywróć frakcję wdychanego tlenu do 21% i pozwól szczeniętom dojść do siebie w komorze z monitorowaniem EEG przez dwie godziny. Pod koniec okresu rejestracji odłącz myszy od systemu EEG i zwróć młode matce. Nagrania wideo EEG pozwalają na skorelowanie wyników elektrograficznych z zachowaniem na wideo.
Większość zdarzeń obserwowanych w tym modelu dotyczy zachowań ogniskowych, jednostronnych lub mieszanych. W okresie niedotlenienia podgrupa myszy zazwyczaj wykazuje niekompulsywną aktywność napadową, podczas której młode są nieruchome z utrzymującą się aktywnością napadową w EEG. W tej analizie wyjściowa aktywność była podobna do wcześniej opisanego tła u młodych myszy P 10.
Po postępowaniu sądowym i przed rozpoczęciem niedotlenienia podgrupa myszy wykazywała napady konwulsyjne. Po indukcji niedotlenienia amplituda tła w EEG uległa zmniejszeniu. Wykazano również sporadyczne wybuchy wyładowań fal kolców, po których następowało tłumienie.
Myszy wykazywały napady elektrograficzne, które wyłaniają się z tłumionego tła jako rytmiczne wyładowania fal kolców, które postępowały, stając się bardziej złożone i częstsze wraz z falami kolców polys. Podczas hipoksji analiza spektrogramu mocy zwraca uwagę na asymetrie między półkulą niedokrwienną i przeciwległą. Półkula niedokrwienna wykazuje wzorzec tłumienia impulsów, a półkula przeciwległa wykazuje stłumione tło.
Podczas ponownego natleniania i rekonwalescencji podgrupa myszy nadal ma napady przez pozostałą część okresu rejestracji. Tło EEG jest stłumione w porównaniu z wartością wyjściową po niedotlenieniu, ze stopniową regeneracją obserwowaną w okresie rejestracji po niedotlenieniu. Podczas pracy z nowonarodzonymi młodymi precyzja jest kluczowa.
Ponadto należy zwrócić szczególną uwagę na umieszczenie szczeniąt z powrotem z matką w grupach po zabiegach chirurgicznych. Wideoelektroencefalografia może być stosowana u noworodków w połączeniu z histopatologią, obrazowaniem i zachowaniem w celu zbadania wpływu napadów noworodkowych na operację urazu i wyniki behawioralne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę ciągłego rejestrowania wideo-EEG z wykorzystaniem wielu elektrod głębokich u noworodków myszy poddanych niedotlenieniu i niedokrwieniu. Technika ta wspomaga zrozumienie napadów drgawkowych u noworodków, umożliwiając korelację znalezisk elektrograficznych z zdarzeniami behawioralnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia noworodka
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Hipotersko-niedokrwienna encefalopatia jest główną przyczyną napadów drgawkowych u noworodków.
- Zrozumienie mechanizmów napadów drgawkowych u noworodków jest kluczowe dla opracowania metod terapeutycznych.
- Model mysi może dostarczyć informacji na temat charakterystyki napadów drgawkowych.
Cel badania
- Opracowanie techniki wideo-EEG do obserwacji napadów u noworodków myszy.
- Charakterystyka przejawów elektrograficznych i behawioralnych podczas niedotlenienia i niedokrwienia.
- Udoskonalenie przyszłych badań nad mechanizmami napadów u noworodków.
Zastosowane metody
- Ciągłe rejestracje wideo EEG w neonatalnym modelu uszkodzenia mózgu u myszy.
- Noworodki myszy zostają poddane niedotlenieniu niedokrwiennemu mózgu po implantacji elektrod.
- Wartości bazowe są rejestrowane przed wywołaniem hipoksji, a następnie prowadzony jest monitoring rekonwalescencji.
- Procedury obejmują chirurgiczną implantację elektrod oraz skrupulatny monitoring.
Główne wyniki
- Rejestracje EEG ujawniły istotne zmiany elektrograficzne podczas hipoksji.
- Napady noworodkowe charakteryzowały się ogniskowymi zachowaniami jednostronnymi oraz wyraźnymi wzorcami EEG.
- W półkulach niedokrwiennych wystąpiły wzorce tłumienia z rozbłyskami w porównaniu z półkulami przeciwległymi.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje wartościową metodę obserwacji drgawek noworodkowych w kontrolowanych warunkach.
- Wyniki pozwalają na głębsze zrozumienie mechanizmów neurorozwojowych leżących u podstaw drgawek.
- Zastosowane podejście stwarza potencjał do rozwoju strategii terapeutycznych w encefalopatiach noworodkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ciągły monitoring wideo-EEG u noworodków myszy stanowi platformę translacyjną służącą do ograniczania ryzyka w testowaniu hipotez terapeutycznych związanych z napadami w rozwoju przedklinicznym. Poprzez umożliwienie zsynchronizowanej analizy elektrograficznej i behawioralnej podczas niedotlenienia i niedokrwienia, metoda ta wspiera walidację mechanistyczną związków przeciwdrgawkowych oraz biomarkerów. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez modelowanie semiologii napadów noworodkowych i ewolucji EEG u ludzi w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie celów terapeutycznych poprzez korelację biomarkerów EEG z zachowaniami napadowymi w modelu uszkodzenia niedotleniająco-ischemicznego.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ocenę oddziaływania na cel za pomocą odczytów elektrograficznych w czasie rzeczywistym podczas ekspozycji na związek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przesiew fenotypowy poprzez wykrywanie napadów elektrograficznych i supresji tła jako funkcjonalnych odczytów dysfunkcji obwodów neuronalnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki EEG, w tym spektrogramy mocy, częstotliwość wyładowań iglica-fala oraz asymetrię międzyhemisferyczną w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia odtwarzalne śledzenie zmian w EEG od stanu bazowego do momentu urazu w obrębie miotów, co wspiera podłużny screening związków.
- Gotowość analizy: Zapewnia zwalidowany system EEG dla noworodków myszy do wysokiej wierności detekcji napadów i analizy trendów tła.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje ewolucję napadów drgawkowych u noworodków ludzi, w tym zachowania ogniskowe oraz wzorce supresji i powrotu w EEG, w celu dopasowania translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość badań przedklinicznych poprzez rejestrację poziomu bazowego przed urazem, dynamiki w fazie urazu oraz regeneracji po hipoksji w ramach jednego procesu roboczego.
- Minimalizacja ryzyka: Umożliwia redukcję ryzyka związanego z występowaniem napadów dzięki obiektywnemu fenotypowaniu EEG przed zaawansowanymi testami terapeutycznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta zostaje zintegrowana z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków poprzez opracowanie modeli napadów potwierdzonych za pomocą EEG przed fazami przesiewania związków i optymalizacji wiodących struktur.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów neuronalnych poprzez korelację EEG z zachowaniem podczas wyzwania niedotleniająco-ischemicznego.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, rozdzielczych w czasie metryk EEG (np. tłumienie z wybuchami, wybuchy iglica-fala) do porównania efektów działania związków.
- Analityka: Umożliwia analizę spektralną i śledzenie trendów tła EEG jako odczyt farmakodynamiczny dla modulacji celu.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z klinicznymi biomarkerami EEG noworodków (np. tłumienie z wybuchami, asymetria międzyhemisferyczna) w celu zapewnienia walidacji międzygatunkowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę monitorowania EEG, którą można zastosować w modelach napadów drgawkowych, neurodegeneracji i zaburzeń neurorozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie fenotypów elektrograficznych z behawioralną semiologią napadów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje akwizycję i analizę EEG w różnych badaniach, poprawiając odtwarzalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje go/no-go poprzez kwantyfikację obciążenia napadami oraz analogów rozprzestrzeniającej się depresji korowej w modelach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii OUN z uwzględnieniem ryzyka na podstawie obiektywnego profilowania podatności na napady.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przeprowadzaniu operacji na noworodkach gryzoni, stereotaktycznej implantacji elektrod oraz akwizycji sygnałów EEG.
- Metoda jest zależna od stabilnej regulacji temperatury, kontroli poziomu tlenu oraz zastosowania komór rejestracyjnych bez przewodów (tether-free) w celu prowadzenia długotrwałego monitorowania.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów montażu EEG, filtrowania oraz analizy widmowej w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Czas ciągłego monitorowania jest ograniczony do 4 godzin ze względu na ograniczenia związane z separacją noworodków od matki.
- Wymagana jest histologiczna weryfikacja położenia elektrod w celu zapewnienia dokładności celowania w hipokamp, korę mózgową oraz móżdżek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Electrode Implantation Surgery
3:08
Baseline Electroencephalogram (EEG) Setup and Recording
3:59
Left Carotid Artery Ligation
5:37
EEG and Hypoxia
6:47
Results: Representative Continuous EEG Analysis During Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice
8:50
Conclusion
