Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Protokół ten jest przeznaczony do trawienia całych oczu myszy do zawiesiny pojedynczej komórki w celu wieloparametrowej cytometrii przepływowej fagocytów jednojądrzastych, które obejmują makrofagi, monocyty, mikroglej i komórki dendrytyczne. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania analizy ilościowej z intensywnością fluoroforu do różnicowania blisko spokrewnionych typów komórek za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych komórek. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem analizy heterogeniczności makrofagów, obejmującej zarówno populacje rezydentne, jak i naciekające w indukowanym laserowo modelu neowaskularyzacji naczyniówki.

Jednak te koncepcje i techniki można równie dobrze zastosować do innych modeli, takich jak retinopatia cukrzycowa, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, a także objawy tocznia. Podczas próby korzystania z tego protokołu zrozumienie konfiguracji cytometru jest krytycznym punktem wyjścia, ponieważ nie wszystkie cytometry są skonfigurowane dokładnie w ten sam sposób. W związku z tym może być konieczne miareczkowanie objętości przeciwciał sprzężonych z fluorescencją i/lub dostosowanie fluoroforów w celu optymalizacji protokołu w oparciu o konfigurację cytometru.

Rozpocząć od przygotowania buforu do wytrawiania zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i 10-krotnego całkowitego powiększenia usuń pozostałą spojówkę i nerw wzrokowy z oczu. Przenieś czyste oczy do suchego naczynia preparacyjnego lub małej łódki do ważenia, a następnie wykonaj dwie rany perforujące pod kątem 90 stopni między nimi przez oś widzenia.

Za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30 wstrzyknąć od 0,15 do 0,2 mililitra buforu wytrawiającego do jamy ciała szklistego każdego oka. Zmiel oczy nożyczkami sprężynowymi i cienkimi kleszkami, a następnie oddziel tkankę soczewki mechanicznym rozerwaniem, aby zapobiec zatkaniu końcówek pipet w kolejnych krokach. Opłucz kleszcze i nożyczki 0,75 mililitra buforu do wytrawiania i wymień naczynie na każdą próbkę.

Za pomocą pipety P1000 przenieś zawartość naczynia do probówki dysocjacyjnej na lodzie, uważając, aby nie stracić żadnego materiału. Opłucz naczynie dodatkowymi 1,5 mililitra buforu wytrawiającego i dodaj go do rurki dysocjującej, zwiększając całkowitą objętość do 3,25 do 3,5 mililitra. Zdysocjuj tkankę na dysocjatorze elektronicznym zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, upewniając się, że cała tkanka znajduje się na dnie odwróconej rurki dysocjacyjnej i styka się z buforem trawiennym.

Następnie inkubować probówkę dysocjacyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez 30 minut. Powtórzyć dysocjację tkanek jeszcze dwa razy, inkubując próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez 30 minut pomiędzy dysocjacjami. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 10 mililitrów zimnego buforu przepływowego i umieść probówki z próbkami na lodzie.

Aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową, przecedź zatrzymaną reakcję trawienia oka przez 40-mikrometrowy filtr umieszczony na górze 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Użyj tłoka z 2,5-mililitrowej strzykawki, aby przepchnąć pozostałe kawałki niestrawionej tkanki oka przez filtr. Umyj rurkę dysocjacyjną 10 mililitrami buforu przepływowego i wypłucz filtr.

Następnie użyj tego samego tłoka, aby ponownie przepuścić niestrawione kawałki tkanki oka przez filtr. Powtórz ten proces z pięcioma mililitrami buforu przepływu. Następnie umyj rurkę dysocjacyjną i przefiltruj ostatnimi 10 mililitrami buforu przepływowego.

Odwirować stożkową probówkę o temperaturze 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Rozbij granulkę, przesuwając rurkę o inną rurkę. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu lizującego i obracaj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, aby zlizować czerwone krwinki.

Zatrzymać reakcję za pomocą 20 mililitrów buforu przepływowego i odwirować stożkową probówkę o temperaturze 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Przesuń rurkę o inną rurkę.

Następnie dodaj pięć mililitrów zimnego HBSS. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Dodaj 0,5 mililitra żywej martwej plamy do każdej próbki za pomocą pipety P1000, upewniając się, że pelety całkowicie dysocjują.

Przenieś próbki do 1,2 mililitrowych probówek mikromiareczkowych i inkubuj je przez 15 minut w ciemności. W międzyczasie policz 10-mikrolitrową porcję próbki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Po inkubacji przemyć każdą próbkę, dodając 400 mikrolitrów buforu o zimnym przepływie.

Odwirować probówki w stojaku na probówki do mikromiareczkowania o ciśnieniu 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Całkowicie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach bufora przepływu zimna. Następnie powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.

Zablokuj do pięciu milionów żywych komórek w 50 mikrolitrach bloku FC. Całkowicie zdysocjuj osad komórkowy i inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu barwiącego przeciwciała do każdej próbki.

Całkowicie wymieszaj i inkubuj przez kolejne 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Właściwości obszaru rozproszenia do przodu i obszaru rozproszenia bocznego dla wszystkich analizowanych zdarzeń z dwojga oczu jednej myszy są pokazane tutaj. Liczbę kulek oczyszczono i potwierdzono przez wykreślenie PE na APC-Cy7, tworząc ciasny klaster zdarzeń dodatnich PE i ujemnych APC-Cy7.

Następnie zidentyfikowano pojedyncze punkty w żywych komórkach ze wszystkich zdarzeń. Pojedyncze komórki były dodatnio skorelowane pod względem wysokości rozproszenia do przodu w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu, podczas gdy komórki dubletowe i trypletowe miały większy obszar rozproszenia do przodu niż wysokość rozproszenia do przodu. Żywe komórki są dodatnie w obszarze rozproszenia do przodu i ujemne pod względem żywej martwej plamy.

Przedstawiono tutaj początkową strategię bramkowania w celu wyznaczenia fagocytów jednojądrzastych z żywych komórek singletowych. Żywe singlety zostały zwizualizowane za pomocą wykresu CD45 kontra CD11b. Brak komórek CD45 dodatnich w FMO CD45 potwierdził wybór bramki.

Następnie neutrofile, eozynofile, limfocyty B i limfocyty K oraz limfocyty T wykluczono poprzez wykreślenie żywych singletów CD45 dodatnich z bramką linii w porównaniu z CD11b. Komórki CD45-dim różnicowano z komórek o wysokiej wysokości CD45. Zidentyfikowano również podzbiory makrofagów.

Mikroglej wyznaczono w komórkach dim CD45 z niskim zabarwieniem MHC2 CD64 dodatnim. Makrofagi MHC2 ujemne zidentyfikowano jako CD64 dodatnie MHC2 ujemne. Makrofagi CD11c ujemne i CD11c dodatnie wykazano jako CD64 dodatnie CD11c ujemne.

i CD64 dodatni CD11c dodatni w komórkach MHC2 dodatnich. Stwierdzono, że leczenie laserowe zwiększyło ilość makrofagów MHC2 ujemnych, CD11c ujemnych i CD11c dodatnich. Liczba komórek dendrytycznych została również zwiększona przez leczenie laserowe, podczas gdy liczba mikrogleju i monocytów nie uległa zmianie.

Perfuzja ogólnoustrojowa nie miała wpływu na liczbę makrofagów. Zgodnie z tą procedurą, sortowanie komórek aktywowane florescencją, a nie sama analiza, pozwala na scharakteryzowanie heterogeniczności makrofagów i jej wpływu na funkcję za pomocą badań transkryptomicznych lub proteomicznych.