Name: Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę trawienia całych oczu myszy do analizy cytometrycznej fagocytów jednojądrzastych. Technika umożliwia identyfikację makrofagów, mikrogleju i komórek dendrytycznych w chorobach oczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JAL był wspierany przez K08EY030923 grantów NIH; CMC było wspierane przez grant K01 (5K01AR060169) z NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases oraz Novel Research Grant (637405) z Lupus Research Alliance.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern. Myszy C57BL/6 umieszczono w grupie w ośrodku barierowym w Centrum Medycyny Porównawczej na Uniwersytecie Northwestern (Chicago, IL). Wszystkie zwierzęta były trzymane w 12/12 godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.
1. Pobranie tkanki oka
<ol>
	<li>Poświęć 10-12-tygodniowe myszy C57BL/6J dowolnej płci, stosując regulowane podawanie dwutlenku węgla, aż mysz przestanie reagować i przestanie wdychać. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy lub inną zatwierdzoną metodę wtórną, aby zapewnić eutanazję. 
	UWAGA: Perfuzję przezsercową można wykonać w celu usunięcia krążących leukocytów, których nie ma w tkankach oka. W tym eksperfuzji ogólnoustrojowej nie zmniejsza liczby mikrogleju, monocytów, makrofagów lub komórek dendrytycznych wykrywanych w całych oczach nieleczonych lub leczonych laserowo. Dlatego większość tych typów komórek znajduje się w tkankach ocznych i ten krok jest opcjonalny.</li>
	<li>Aby wyłuszczyć oczy, dociśnij w pobliżu oczodołu, delikatnie umieszczając parę zakrzywionych kleszczyków pod okiem, gdy wystaje z oczodołu. Szczypce zaciskają się pod okiem, nie ściskając właściwego oka. Usuń oko z otaczającej spojówki (patrz wcześniejsza publikacja)23.</li>
	<li>Pociągnij oko na boki, aż nerw wzrokowy będzie jedynym pozostałym połączeniem, aby odłączyć oko. Nerw wzrokowy często przecina się pod wpływem napięcia, ale czasami potrzebne są małe nożyczki, aby przeciąć nerw wzrokowy. Umieść oko w zimnym 1x buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) z wapniem i magnezem w 1,7 ml probówce do mikrowirówki.</li>
</ol>
2. Trawienie tkanki oka
<ol>
	<li>Przygotować bufor wytrawiający zawierający 0,1 mg/ml enzymu wytrawiającego i 0,2 mg/ml DNazy w zimnym HBSS. Początkowo rozpuścić 5 mg enzymu trawiącego w 2 ml jałowej wody. Przygotować początkowe rozcieńczenie 10 mg/ml DNazy w HBSS. Na każde 10 ml buforu wytrawiającego (wystarczającego dla 3 zwierząt) należy zmieszać 9,4 ml zimnego HBSS z 0,4 ml odtworzonego enzymu wytrawiającego i 0,2 ml rozcieńczonej DNazy I. 
	UWAGA: Stężenia te zostały empirycznie określone w wielu eksperymentach, aby zapewnić optymalne poziomy barwienia przeciwciał pojedynczych komórek, przy jednoczesnym zmniejszeniu śmierci komórek. Kolagenaza D została wypróbowana jako alternatywa dla enzymu trawiącego ze zmniejszoną żywotnością komórek i zmniejszoną liczbą komórek CD45 +. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na temat iteracyjnego procesu optymalizacji trawienia.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu całkowitym usuń pozostałą spojówkę i nerw wzrokowy za pomocą cienkich kleszczyków i nożyczek sprężynowych w zimnym HBSS.</li>
	<li>Przenieś czyste oczy do suchego naczynia preparacyjnego lub małej łódki do ważenia. Wstrzyknąć 0,15-0,20 ml buforu wytrawiającego na oko za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 30 G do jamy ciała szklistego po wykonaniu dwóch ran perforujących w oku przez oś widzenia i w odległości 90° od tej pierwszej rany w celu wyjścia buforu trawiennego.</li>
	<li>Zmiel całe oczy za pomocą nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczyków ze wszystkimi kawałkami mniejszymi niż 0,5 mm x 0,5 mm. Zdysocjuj tkankę soczewki za pomocą uszkodzeń mechanicznych za pomocą kleszczy, aby zapobiec zatykaniu końcówek pipet w kolejnych krokach. Dla każdej próbki przepłucz kleszcze i nożyczki z 0,75 ml buforu do wytrawiania do małego naczynia. Użyj nowego naczynia dla każdej próbki.</li>
	<li>Przenieść zawartość naczynia do probówki dysocjacyjnej na lodzie za pomocą pipety P1000, uważając, aby nie stracić żadnego materiału podczas przenoszenia pipety. Opłucz naczynie dodatkowymi 1,5 ml buforu do wytrawiania, zwiększając całkowitą objętość w probówce dysocjacyjnej do 3,25-3,50 ml.</li>
	<li>Umieścić rurkę dysocjacyjną odwróconą na dysocjatorze elektronicznym i uruchomić cykl "m_brain_03_01", składający się z 1-minutowego jednokierunkowego obrotu przy 200 obr./min w temperaturze pokojowej, który jest wstępnie załadowanym programem. Upewnij się, że cała tkanka znajduje się na dnie rurki dysocjacyjnej w kontakcie z buforem wytrawiającym i rotorem dla tego i wszystkich pozostałych etapów.</li>
	<li>Umieścić probówkę dysocjacyjną w inkubatorze z wytrząsaniem na 30 minut przy 200 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.6 i 2.7 jeszcze jeden raz. Po drugiej 30-minutowej inkubacji przeprowadzić ostatnie mechaniczne wytrawianie przy użyciu dysocjatora elektronicznego, jak w kroku 2.6.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 10 ml zimnego buforu przepływowego i umieść probówki na lodzie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
<ol>
	<li>Aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową, należy przelać zatrzymaną reakcję trawienia oka przez filtr 40 μm umieszczony na górze stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 2,5 ml przepchnąć pozostałe kawałki niestrawionej tkanki oka przez filtr.</li>
	<li>Przemyć probówkę dysocjacyjną 10 ml buforu przepływowego i przepłukać filtr przed użyciem tego samego tłoka do ponownego przepuszczenia przez filtr niestrawionych kawałków tkanki oka.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2, używając 5 ml buforu przepływowego.</li>
	<li>Przemyć probówkę dysocjacyjną i filtr ostatnimi 10 ml buforu przepływowego. 
	UWAGA: Całkowita objętość bufora mineralizacyjnego i przepływowego wynosi około 38-40 ml na każdą próbkę.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Przygotuj 1x roztwór lizujący, dodając 10x roztwór lizujący do sterylnej wody. Rozbij granulkę, przesuwając rurkę o inną rurkę. Aby zejść czerwone krwinki, dodaj 1 ml 1x roztworu lizującego przez 30 sekund, mieszając w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zatrzymać reakcję za pomocą 20 ml buforu przepływowego.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Oddziel osad, przesuwając rurkę o inną rurkę. Dodaj 5 ml zimnego 1x HBSS na probówkę.</li>
	<li>Probówki wirówkowe o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant.</li>
</ol>
4. Barwienie zawiesiny komórkowej fagocytów jednojądrzastych
<ol>
	<li>Przygotuj 0,5 ml żywej/martwej plamy na próbkę, rozcieńczając żywy/martwy barwnik 1:5 000 w zimnym HBSS.</li>
	<li>Dodaj żywą/martwą plamę do każdej próbki za pomocą pipety P1000, upewniając się, że pelety całkowicie dysocjują. Przenieść próbki do mikroprobówek o pojemności 1,2 ml.</li>
	<li>Pobrać małą porcję (10 μl) do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz 4.4). Próbki inkubować z żywym/martwym barwnikiem przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić liczbę żywych komórek w próbce. 
	UWAGA: Zazwyczaj 2 oczu 10-12-tygodniowej myszy C57BL/6J zawiera mniej niż 2 x 106 żywych komórek.</li>
	<li>Przemyć próbki, dodając 400 μl zimnego buforu przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do mianowania o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Całkowicie zawieś komórki w 500 μl zimnego bufora przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do mianowania o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Zablokuj do 5 x 106 żywych komórek w 50 μl blokuFC (rozcieńczenie 1:50 w zimnym buforze przepływowym oczyszczonego szczurzego anty-mysiego CD16 / CD32). Jeśli więcej niż 5 x 106 żywych komórek, odpowiednio zwiększ objętość.</li>
	<li>Dodaj blok Fc do osadu, upewniając się, że próbka została całkowicie oddzielona. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu barwiącego przeciwciała (patrz tabela 1 w celu wyboru i ilości każdego przeciwciała zawartego w roztworze) na 5 x 106 żywych komórek bezpośrednio do komórek w bloku FC i całkowicie wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ilości przeciwciał zależą od konfiguracji cytometru przepływowego i powinny być miareczkowane niezależnie dla każdego laboratorium i urządzenia. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z konfiguracją filtrów i lusterek przyrządu. Aby miareczkować przeciwciała, zacznij od zalecenia producenta i oblicz wskaźnik barwienia. Wykonaj próbę różnych stężeń przeciwciał (zarówno powyżej, jak i poniżej zalecenia producenta) i wybierz najniższe stężenie przeciwciała, przy którym utrzymuje się wskaźnik barwienia. Upewnij się również, że barwienie dodatnie, które jest mniej jasne niż kontrola jednokolorowa. Użyj niebarwionych komórek, aby upewnić się, że ujemnie barwione komórki są na skali i mają szczyt na poziomie 1 x 102 lub mniejszym. Użyj fluorescencji minus jedna kontrolka, aby zdefiniować dodatnio zabarwione komórki.</li>
	<li>Przemyć próbki, dodając 700 μl zimnego buforu przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do mianowania o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Opcjonalnie, po wybarwieniu przeciwciałami, próbki można utrwalić za pomocą 500 μl 2% paraformaldehydu w buforze przepływowym. Utrwalać próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wykonaj jedno pranie zgodnie z opisem w 4.10. Utrwalone próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Kulki zliczające należy dodać w dniu zbierania danych z cytometrii przepływowej. Utrwalone próbki należy uruchomić na cytometrze przepływowym w ciągu 1-2 dni. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest substancją i stanowi zagrożenie dla zdrowia.</li>
	<li>Ponownie umyć próbki za pomocą 500 μl zimnego buforu przepływowego. Probówki wirówkowe w stojaku na mikroprobówki do miana o gramaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać połowę supernatantu bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki i przenieść do 96-dołkowej płytki testowej z dnem w kształcie litery U. Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aby zdekantować supernatant, odwróć płytkę i jednym silnym wstrząsem usuń płyn do miski zlewu, nie naruszając osadu.</li>
	<li>W nowej mikroprobówce do mianowania o pojemności 1,2 ml umieść 50 μl dobrze zawirowanych kulek do liczenia.</li>
	<li>Zawiesić granulki na płytce 96-dołkowej w 200 μl zimnego bufora przepływowego. Dodaj mieszaninę komórek na wierzchu koralików z poprzedniego kroku. Uruchomić na cytometrze przepływowym o całkowitej objętości 250 μl / mikroprobówkę.</li>
</ol>
5. Zbieranie danych cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Włącz i przygotuj cytometr przepływowy. Podane tutaj instrukcje dotyczą zmodyfikowanego cytometru czterolaserowego (tabela 2).</li>
	<li>Uruchom próbkę testową, która zawiera małą porcję z każdej próbki, aby upewnić się, że wszystkie komórki są zgodne z skalą dla każdego detektora. Dostosuj napięcia tak, aby wszystkie ogniwa znajdowały się na skali.</li>
	<li>Uruchom pojedyncze kontrole koloru (SCC) dla każdego fluoroforu używanego w koktajlu barwiącym (Tabela 3). Umieść mikroprobówkę z mikromianem w większej probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml w celu umieszczenia na stoliku cytometru przepływowego. 
	UWAGA: Fluorofory korzeniowe, takie jak BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) i Alexa700, nie wymagają tego samego przeciwciała co koktajl (tj. CD19 PE dla CD64 PE). Jednak fluorofory tandemowe, takie jak PE-CF594, PE-Cy7 lub APC-Cy7, wymagają tego samego przeciwciała dla SCC co koktajl ze względu na potencjalną dysocjację sprzężonych fluoroforów.
	<ol>
		<li>Utwórz SCC dla BV421, dodając 2 krople koralików kompensacyjnych do probówki z mianem o pojemności 1,2 ml wraz z 1 μl chomika anty-mysiego CD11c BV421. Kulki kompensacyjne są używane, ponieważ CD11c BV421 jest podtypem IgG lambda, a nie kappa, jak opisano w 5.3.3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 0,2 ml buforu przepływowego.</li>
		<li>Utwórz SCC dla barwnika Alive/Dead, dodając jedną kroplę dodatnich kulek barwiących (zielona nasadka) z kulek reaktywnych aminami, a następnie 1 μl barwnika Alive/Dead. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj jedną kroplę kulek ujemnych (biała nasadka) z kulek reaktywnych aminami. Dodać 0,2 ml buforu przepływowego.</li>
		<li>Utworzyć pozostałe SCC, dodając jedną kroplę dodatnich kulek barwiących (zielona nasadka) z zestawu kulek Ig kappa przeciwko szczurom i chomikom, a następnie podaną ilość przeciwciał (Tabela 3) w probówce z mianem o pojemności 1,2 ml. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać jedną kroplę kulek ujemnych (biała nakrętka) z zestawu kulek Ig kappa przeciwko szczurom i chomikom. Dodać 0,2 ml buforu przepływowego.</li>
		<li>Całkowicie odwiruj wszystkie mieszanki kulek. Przechowywać SCC w temperaturze 4 °C do 3 dni. 
		UWAGA: SCC dla fluorescencyjnych myszy reporterowych to niebarwione komórki.</li>
		<li>Podczas uruchamiania SCC należy ustawić napięcia tak, aby próbka SCC miała pik większy niż jakakolwiek fluorescencja dla próbki komórek w tym samym kanale detektora. Ponadto napięcia powinny być ustawione tak, aby każdy SCC miał co najmniej 0,5 logarytmu różnicy między pikiem histogramu w kanale zainteresowania a dowolnym innym kanałem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom próbki na "Niskim", utrzymując zdarzenia na sekundę poniżej 4000. Jeżeli nie można odpowiednio obniżyć natężenia przepływu, należy rozcieńczyć próbki dodatkowym buforem o przepływie zimnym. Należy zapisać dodaną objętość, ponieważ będzie to niezbędne do obliczenia liczby (patrz reprezentatywne wyniki).</li>
	<li>Zbierz co najmniej 3 x 106 zdarzeń na próbkę. Może to być wyższe niż liczba komórek ze względu na to, że granulki pigmentu i zanieczyszczenia liczą się jako zdarzenia na cytometrze.</li>
	<li>Zapisać fluorescencję minus jeden (FMO) dla każdego fluoroforu innego niż żywy/martwy dla właściwej strategii bramkowania w sekcji 6.4. FMO to próbka, która została wybarwiona wszystkimi fluoroforami z wyjątkiem jednego.</li>
	<li>Wyczyść i wyłącz cytometr przepływowy zgodnie z instrukcjami producenta lub zakładu.</li>
</ol>
6. Adnotacja danych cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Otwórz nowy arkusz za pomocą oprogramowania do analizy. Importuj pliki FCS z cytometru dla wszystkich próbek i jednokolorowych kontrolek.</li>
	<li>Użyj SCC, aby utworzyć macierz wynagrodzeń.</li>
	<li>Zastosuj matrycę kompensacyjną do barwionych próbek i FMO.</li>
	<li>Użyj FMO, aby określić dodatnie barwienie w celu narysowania bramek.</li>
</ol>

<ol><li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+physiology+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li>
<li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li>
<li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li>
<li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099(2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935(2013).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li>
<li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313(2014).</li>
<li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636(2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia%2C+and+not+peripheral+macrophages%2C+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li>
<li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li>
<li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li>
<li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+CD11b+%2BMonocytes+and+Anti%E2%80%93Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22AJOPHT%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li>
<li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).</li>
<li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li>
<li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wieloparametrowa cytometria przepływowa pozwala na ilościową analizę wielu typów komórek w złożonej tkance. W tym raporcie opisujemy wykrywanie metodą cytometrii przepływowej populacji fagocytów jednojądrzastych, w tym monocytów, komórek dendrytycznych i podzbiorów makrofagów, po uszkodzeniu laserowym w oku myszy. Liyanage i inni niedawno poinformowali o podobnej strategii bramkowania w celu wykrywania neutrofili, eozynofili, limfocytów, DC, makrofagów, makrofagów naciekających i monocytów27. Nasz...

Wrodzony układ odpornościowy obejmuje wiele typów komórek, które stymulują aktywację dopełniacza i stan zapalny. Wrodzone komórki odpornościowe obejmują komórki NK (natural killer), komórki tuczne, bazofile, eozynofile, neutrofile i fagocyty jednojądrzaste. Fagocyty jednojądrzaste, które składają się z monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych, są zaangażowane w patofizjologię wielu schorzeń okulistycznych, w tym zapalenia błony naczyniowej oka, retinopatii cukrzycowej i zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD)1. W tym protokole skupimy się na identyfikacji fagocytów jednojądrzastych za pomocą wieloparametrowej analizy cytometrii przepływowej w mysim modelu neowaskularnego AMD2. Protokół ten można dostosować do mysich modeli retinopatii cukrzycowej i/lub zapalenia błony naczyniowej oka, ale ze względu na ogólnoustrojowy charakter tych chorób zaleca się bardziej rozległą dyssekcję oka.
Fagocyty jednojądrzaste wyrażają nakładające się na siebie markery powierzchni komórek. Długotrwałe makrofagi i mikroglej rezydujące w tkankach pochodzą z erytromieloidu progenitor3, podczas gdy makrofagi recyklingowe i komórki dendrytyczne różnicują się od progenitora komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego4. Markery powierzchni komórek myszy wspólne dla monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych obejmują CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17 oraz marker wewnątrzkomórkowy Iba18. Aby sprostać temu wyzwaniu, analiza transkryptomiczna makrofagów, monocytów i komórek dendrytycznych z wielu tkanek definiuje CD64 jako specyficzny dla makrofagów marker powierzchni komórek6. Makrofagi zostały opisane w tęczówce, naczyniówce, ciele rzęskowym i nerwie wzrokowym w zdrowych oczach3. Alternatywnie, identyfikacja komórek dendrytycznych jest trudniejsza; najbardziej specyficzna metoda identyfikacji komórek dendrytycznych wymaga mapowania losu za pomocą reportera Zbtb46-GFP mouse9. Niezależnie od tej linii reporterowej, ekspresja CD11c i MHCII w połączeniu z brakiem CD64 może zidentyfikować potencjalne komórki dendrytyczne6,10. Komórki dendrytyczne zostały zidentyfikowane w rogówce, spojówce, tęczówce i naczyniówce w zdrowych oczach11. Mikroglej to wyspecjalizowane makrofagi zlokalizowane w siatkówce, chronione przez barierę krew-siatkówka i pochodzące z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego12. W rezultacie, mikroglej siatkówki można odróżnić od makrofagów pochodzących z monocytów na podstawie ich słabych poziomów ekspresji CD45 13 i wysokich poziomów Tmem119, który jest dostępny jako przeciwciało cytometrii przepływowej14. Jednak po aktywacji mikrogleju, CD45 może być regulowany w górę15, a Tmem119 może być regulowany w dół3, co pokazuje złożoność biologii mikrogleju i jest to prawdopodobnie istotne zarówno w przypadku AMD, jak i jego modelu mysiego. Wreszcie monocyty można podzielić na co najmniej dwa podtypy, w tym klasyczne i nieklasyczne. Klasyczne monocyty wykazująCCR2+Ly6C wysoki poziom CX3CR1, niską ekspresję, a nieklasyczne monocyty wykazują niskie markery CCR2-Ly6Co niskimpoziomie CX3CR15.
Ze względu na konieczność ilościowej analizy ekspresji markerów, tj. wysokie i niskie/ciemne poziomy, wieloparametrowa cytometria przepływowa jest idealną metodą do rozróżniania monocytów, makrofagów, mikrogleju i komórek dendrytycznych w oku i innych tkankach. Dodatkowe zalety obejmują identyfikację subpopulacji, możliwość wykorzystania sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) do sortowania populacji komórek do analizy transkryptomicznej lub proteomicznej oraz mapowanie losów. Główną wadą wieloparametrowej cytometrii przepływowej jest brak architektury tkankowej. Można to przezwyciężyć poprzez rozwarstwienie okulistyczne na różne podprzedziały oka: rogówkę, spojówkę, tęczówkę, soczewkę, siatkówkę i kompleks naczyniówka-twardówka. Dodatkowo można wykonać potwierdzające obrazowanie immunofluorescencyjne, ale jest ono ograniczone ze względu na liczbę markerów i brak solidnej oceny ilościowej.
Badania asocjacyjne całego genomu powiązały wiele genów dopełniacza z AMD16. Aktywacja dopełniacza prowadzi do produkcji anafilatoksyny, rekrutacji leukocytów i wynikającego z tego stanu zapalnego. U myszy z niedoborem receptora dopełniacza uszkodzenie laserowe zmniejsza rekrutację fagocytów jednojądrzastych i obszar neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem (CNV)17. Podobnie, mysz z nokautem receptora chemokiny 2 z motywem C-C (CCR2), która ma niedobór rekrutacji monocytów do tkanki, wykazuje zarówno zmniejszoną rekrutację fagocytów jednojądrzastych, jak i indukowany laserem obszar CNV18. Te dane łączą fagocyty dopełniacza i jednojądrzaste z eksperymentalnym CNV i prawdopodobnie neowaskularnym AMD. Na poparcie tego związku receptory dopełniacza są rozregulowane na monocytach krwi obwodowej u pacjentów z neowaskularnym AMD19,20. Dane te wskazują na silny związek między AMD a fagocytami jednojądrzastymi.
W tym manuskrypcie użyjemy eksperymentalnego modelu CNV indukowanego laserem, aby scharakteryzować populacje fagocytów jednojądrzastych w oku myszy za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. Indukowany laserowo CNV jest standardowym mysim modelem neowaskularnego AMD, który wykazał skuteczność obecnej terapii neowaskularnej AMD pierwszego rzutu21. Protokół ten będzie opisywał enukleację oczu myszy, rozwarstwienie oka, trawienie do zawiesiny pojedynczej komórki, barwienie przeciwciał, oznaczanie napięć laserowych przy użyciu kontroli pojedynczego koloru oraz strategię bramkowania przy użyciu kontroli fluorescencji minus jeden (FMO). Szczegółowy opis modelu CNV indukowanego laserem można znaleźć w poprzedniej publikacji22. Korzystając z tego protokołu, zdefiniujemy mikroglej, monocyty, komórki dendrytyczne i populacje makrofagów. Ponadto użyjemy MHCII i CD11c do dalszego zdefiniowania podzbiorów makrofagów w modelu CNV indukowanym laserem.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>Costar</td><td>3620</td> Pipety 10 ml Fisher Scientific 431031 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 2,5 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 G</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr> 3ml <tr><td>Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polistyrenowy szalik wagowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa, dolna płytka testowa w kształcie litery U bez pokrywki</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Kulki reaktywne aminy</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koralików Ig kappa przeciw szczurom i chomikom</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka licznika komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Policz koraliki</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Enzym trawiący</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Rurki dysocjacyjne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny dysocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok FC, anty-mysz dla szczurów CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Bufor przepływowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki przepływowe</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Chomik anty-mysz CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy barwnik</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy, 10x roztwór</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Rurka i stojak z mikromianem</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-mysia CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-mysia NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet P1000</td> Końcówki do pipet <td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td></td><td>Końcówki</td> do pipet Gilson FA10006M <td></td></tr><tr><td>P2</td> Pipeta <td>do pipet eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2</td><td>Pipeta Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td></td><td></td> Końcówki do pipet Gilson FA10003M <td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor P200</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>561085</tr><tr><td>Szczur anty-mysz Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-mysz Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wstrząsający</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek, siatka nylonowa 40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z wiadrem wahadłowym</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski, roztwór 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Wrodzony układ odpornościowy odgrywa ważną rolę w patofizjologii oka, w tym w zapaleniu błony naczyniowej oka, retinopatii cukrzycowej i zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności fagocyty jednojądrzaste, wyrażają nakładające się na siebie markery powierzchniowe komórek, co sprawia, że identyfikacja tych populacji jest wyzwaniem. Wieloparametrowa cytometria przepływowa pozwala na jednoczesną, ilościową analizę wielu markerów powierzchni komórek w celu różnicowania monocytów, makrofagów, mikrogleju i komórek dendrytycznych w oczach myszy. Protokół ten opisuje wyłuszczenie całych oczu myszy, rozwarstwienie oka, trawienie do zawiesiny pojedynczej komórki i barwienie zawiesiny pojedynczej komórki pod kątem markerów komórek szpikowych. Dodatkowo wyjaśniamy właściwe metody określania napięć za pomocą jednokolorowych kontrolek oraz wyznaczania bramek dodatnich za pomocą kontrolek fluorescencyjnych minus jeden. Głównym ograniczeniem wieloparametrowej cytometrii przepływowej jest brak architektury tkankowej. Ograniczenie to można przezwyciężyć za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej poszczególnych przedziałów gałki ocznej lub uzupełniającego barwienia immunofluorescencyjnego. Jednak immunofluorescencja jest ograniczona przez brak analizy ilościowej i zmniejszoną liczbę fluoroforów w większości mikroskopów. Opisujemy zastosowanie wieloparametrycznej cytometrii przepływowej w celu zapewnienia wysoce ilościowej analizy fagocytów jednojądrzastych w indukowanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej. Ponadto wieloparametrowa cytometria przepływowa może być wykorzystywana do identyfikacji podzbiorów makrofagów, mapowania losu i sortowania komórek w badaniach transkryptomicznych lub proteomicznych.

Rysunek 1 przedstawia niekompensowane histogramy częstotliwości dla SCC i komórek dla lasera czerwonego: Alexa647, Alexa700 oraz APC-Cy7. Na Rysunku 1A magenta linia obrazuje szczyt SCC dla Alexa647, podczas gdy linia cyjanowa wskazuje zamierzoną różnicę 0,5 Log. Zauważmy, że szczyty dla Alexa700 i APC-Cy7 znajdowały się na lewo (były mniej jasne) od linii cyjanowej. Należy również zwrócić uwagę, że wszystkie komórki znajdowały się na lewo od linii magenta. Wsze...

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Protokół ten jest przeznaczony do trawienia całych oczu myszy do zawiesiny pojedynczej komórki w celu wieloparametrowej cytometrii przepływowej fagocytów jednojądrzastych, które obejmują makrofagi, monocyty, mikroglej i komórki dendrytyczne. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania analizy ilościowej z intensywnością fluoroforu do różnicowania blisko spokrewnionych typów komórek za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych komórek. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem analizy heterogeniczności makrofagów, obejmującej zarówno populacje rezydentne, jak i naciekające w indukowanym laserowo modelu neowaskularyzacji naczyniówki.Jednak te koncepcje i techniki można równie dobrze zastosować do innych modeli, takich jak retinopatia cukrzycowa, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, a także objawy tocznia. Podczas próby korzystania z tego protokołu zrozumienie konfiguracji cytometru jest krytycznym punktem wyjścia, ponieważ nie wszystkie cytometry są skonfigurowane dokładnie w ten sam sposób. W związku z tym może być konieczne miareczkowanie objętości przeciwciał sprzężonych z fluorescencją i/lub dostosowanie fluoroforów w celu optymalizacji protokołu w oparciu o konfigurację cytometru.Rozpocząć od przygotowania buforu do wytrawiania zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i 10-krotnego całkowitego powiększenia usuń pozostałą spojówkę i nerw wzrokowy z oczu. Przenieś czyste oczy do suchego naczynia preparacyjnego lub małej łódki do ważenia, a następnie wykonaj dwie rany perforujące pod kątem 90 stopni między nimi przez oś widzenia.Za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30 wstrzyknąć od 0,15 do 0,2 mililitra buforu wytrawiającego do jamy ciała szklistego każdego oka. Zmiel oczy nożyczkami sprężynowymi i cienkimi kleszkami, a następnie oddziel tkankę soczewki mechanicznym rozerwaniem, aby zapobiec zatkaniu końcówek pipet w kolejnych krokach. Opłucz kleszcze i nożyczki 0,75 mililitra buforu do wytrawiania i wymień naczynie na każdą próbkę.Za pomocą pipety P1000 przenieś zawartość naczynia do probówki dysocjacyjnej na lodzie, uważając, aby nie stracić żadnego materiału. Opłucz naczynie dodatkowymi 1,5 mililitra buforu wytrawiającego i dodaj go do rurki dysocjującej, zwiększając całkowitą objętość do 3,25 do 3,5 mililitra. Zdysocjuj tkankę na dysocjatorze elektronicznym zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, upewniając się, że cała tkanka znajduje się na dnie odwróconej rurki dysocjacyjnej i styka się z buforem trawiennym.Następnie inkubować probówkę dysocjacyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez 30 minut. Powtórzyć dysocjację tkanek jeszcze dwa razy, inkubując próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez 30 minut pomiędzy dysocjacjami. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 10 mililitrów zimnego buforu przepływowego i umieść probówki z próbkami na lodzie.Aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową, przecedź zatrzymaną reakcję trawienia oka przez 40-mikrometrowy filtr umieszczony na górze 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Użyj tłoka z 2,5-mililitrowej strzykawki, aby przepchnąć pozostałe kawałki niestrawionej tkanki oka przez filtr. Umyj rurkę dysocjacyjną 10 mililitrami buforu przepływowego i wypłucz filtr.Następnie użyj tego samego tłoka, aby ponownie przepuścić niestrawione kawałki tkanki oka przez filtr. Powtórz ten proces z pięcioma mililitrami buforu przepływu. Następnie umyj rurkę dysocjacyjną i przefiltruj ostatnimi 10 mililitrami buforu przepływowego.Odwirować stożkową probówkę o temperaturze 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Rozbij granulkę, przesuwając rurkę o inną rurkę. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu lizującego i obracaj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, aby zlizować czerwone krwinki.Zatrzymać reakcję za pomocą 20 mililitrów buforu przepływowego i odwirować stożkową probówkę o temperaturze 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Przesuń rurkę o inną rurkę.Następnie dodaj pięć mililitrów zimnego HBSS. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Dodaj 0,5 mililitra żywej martwej plamy do każdej próbki za pomocą pipety P1000, upewniając się, że pelety całkowicie dysocjują.Przenieś próbki do 1,2 mililitrowych probówek mikromiareczkowych i inkubuj je przez 15 minut w ciemności. W międzyczasie policz 10-mikrolitrową porcję próbki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Po inkubacji przemyć każdą próbkę, dodając 400 mikrolitrów buforu o zimnym przepływie.Odwirować probówki w stojaku na probówki do mikromiareczkowania o ciśnieniu 400 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Całkowicie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach bufora przepływu zimna. Następnie powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.Zablokuj do pięciu milionów żywych komórek w 50 mikrolitrach bloku FC. Całkowicie zdysocjuj osad komórkowy i inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu barwiącego przeciwciała do każdej próbki.Całkowicie wymieszaj i inkubuj przez kolejne 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Właściwości obszaru rozproszenia do przodu i obszaru rozproszenia bocznego dla wszystkich analizowanych zdarzeń z dwojga oczu jednej myszy są pokazane tutaj. Liczbę kulek oczyszczono i potwierdzono przez wykreślenie PE na APC-Cy7, tworząc ciasny klaster zdarzeń dodatnich PE i ujemnych APC-Cy7.Następnie zidentyfikowano pojedyncze punkty w żywych komórkach ze wszystkich zdarzeń. Pojedyncze komórki były dodatnio skorelowane pod względem wysokości rozproszenia do przodu w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu, podczas gdy komórki dubletowe i trypletowe miały większy obszar rozproszenia do przodu niż wysokość rozproszenia do przodu. Żywe komórki są dodatnie w obszarze rozproszenia do przodu i ujemne pod względem żywej martwej plamy.Przedstawiono tutaj początkową strategię bramkowania w celu wyznaczenia fagocytów jednojądrzastych z żywych komórek singletowych. Żywe singlety zostały zwizualizowane za pomocą wykresu CD45 kontra CD11b. Brak komórek CD45 dodatnich w FMO CD45 potwierdził wybór bramki.Następnie neutrofile, eozynofile, limfocyty B i limfocyty K oraz limfocyty T wykluczono poprzez wykreślenie żywych singletów CD45 dodatnich z bramką linii w porównaniu z CD11b. Komórki CD45-dim różnicowano z komórek o wysokiej wysokości CD45. Zidentyfikowano również podzbiory makrofagów.Mikroglej wyznaczono w komórkach dim CD45 z niskim zabarwieniem MHC2 CD64 dodatnim. Makrofagi MHC2 ujemne zidentyfikowano jako CD64 dodatnie MHC2 ujemne. Makrofagi CD11c ujemne i CD11c dodatnie wykazano jako CD64 dodatnie CD11c ujemne.i CD64 dodatni CD11c dodatni w komórkach MHC2 dodatnich. Stwierdzono, że leczenie laserowe zwiększyło ilość makrofagów MHC2 ujemnych, CD11c ujemnych i CD11c dodatnich. Liczba komórek dendrytycznych została również zwiększona przez leczenie laserowe, podczas gdy liczba mikrogleju i monocytów nie uległa zmianie.Perfuzja ogólnoustrojowa nie miała wpływu na liczbę makrofagów. Zgodnie z tą procedurą, sortowanie komórek aktywowane florescencją, a nie sama analiza, pozwala na scharakteryzowanie heterogeniczności makrofagów i jej wpływu na funkcję za pomocą badań transkryptomicznych lub proteomicznych.

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Obrazowanie żywych komórek krwi oznaczonych krwinek w krążeniu ocznym może dostarczyć informacji o stanie zapalnym i niedokrwieniu w retinopatii cukrzycowej oraz zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem. Opisano protokół oznaczania komórek krwi i obrazowania znakowanych komórek w krążeniu siatkówkowym.

Fluorescencyjne znakowanie barwnikami erytrocytów i leukocytów w celu badania dynamiki przepływu w krążeniu siatkówkowym myszy

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Poznaj metodę trawienia całych oczu myszy do analizy cytometrycznej fagocytów jednojądrzastych. Technika umożliwia identyfikację makrofagów, mikrogleju i komórek dendrytycznych w chorobach oczu.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Przeglądaj więcej filmów