Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

Zastosowanie tej metody może pozwolić na odkrycie, w jaki sposób pewne zmiany ekspresji genów mogą być przypisywane patologiom związanym z chorobami neurologicznymi. Zaletą tej techniki jest to, że omija ona konieczność tworzenia lub kupowania genetycznych linii zwierzęcych, których stworzenie i walidacja mogą zająć lata. Technika ta pozwala na badanie genów związanych z zaburzeniami neurologicznymi.

Ustalenie, w jaki sposób określone geny przyczyniają się do patologii, jest ważnym krokiem w opracowywaniu nowych terapii. Zaletą tego protokołu jest nauczenie się manipulowania zarodkami w taki sposób, aby eksperymentator wykonał etap transferu genów bez zmniejszania wskaźników przeżycia. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ zarodki są bardzo delikatne, dlatego pomocna jest obserwacja, jak doświadczony eksperymentator manipuluje nimi podczas zabiegu.

Ciężarne matki należy przyprowadzić na miejsce zabiegu co najmniej 30 minut przed zabiegiem. Wysterylizuj całe miejsce operacji za pomocą wysterylizowanych chusteczek bakteriobójczych, a następnie 70% etanolu. Następnie wysterylizuj narzędzia autoklawu w sterylizatorze z kulkami szklanymi.

Przenieś sterylny PBS do 50-mililitrowych probówek stożkowych i umieść probówki w łaźni wodnej podgrzanej do 38 do 40 stopni Celsjusza. Sprawdź temperaturę sterylnej soli fizjologicznej za pomocą termometru. Włącz pompę obiegową podgrzewania wody tak, aby była rozgrzana do 37 stopni Celsjusza.

Następnie włącz wtryskiwacz ciśnieniowy i elektroporator i zapewnij prawidłowe działanie. Krótko odwiruj roztwór DNA osocza na wirówce stołowej i umieść go na lodzie. Pociągnij szklane pipety za ściągacz do pipet tak, aby końcówka wyciągniętej szklanej pipety miała średnicę około 50 mikrometrów.

Następnie napełnij pipetę 20 do 40 mikrolitrami roztworu DNA. Przygotuj wszystkie niezbędne przedmioty do operacji, w tym balsam do depilacji, jod, 70% etanol, waciki, krople do oczu, szwy i gazę. Przygotuj kartę zabiegową i wypełnij niezbędne informacje.

Zważ mysz przed zabiegiem i zapisz wagę. Po znieczuleniu myszy podaj przedoperacyjne leki przeciwbólowe i usuń sierść z brzucha za pomocą kremu do depilacji lub maszynki do golenia. Wysterylizuj brzuch, trzykrotnie przecierając go jodonem powidonu i 70% etanolem.

Stwórz sterylne pole wokół brzucha za pomocą sterylnej gazy i drapowania. Wykonaj nacięcie w linii środkowej w skórze brzucha, jednocześnie podnosząc skórę kleszczami, aby uniknąć przecięcia mięśnia. Następnie podnieś mięsień do góry i przetnij go, uważając, aby nie przeciąć ważnych narządów.

Ostrożnie wyciągnij rogi macicy z matki za pomocą kleszczy z pierścieniami i delikatnie umieść je na sterylnym polu, upewniając się, że są podparte wyściółką i nie ciągną zbyt daleko od zapory. Utrzymuj róg macicy zwilżony przez resztę operacji za pomocą wstępnie podgrzanego, sterylnego PBS. Umieść zarodek za pomocą kleszczy lub palców, a następnie ostrożnie włóż wyciągniętą szklaną pipetę do bocznego pionu i wstrzyknij od dwóch do trzech mikrolitrów do każdej komory, wkładając pipetę do jednej, a następnie drugiej komory.

Komora została skutecznie ukierunkowana, jeśli po wstrzyknięciu występuje kształt półksiężyca. Aby transfekować komórki obustronnie w korze czołowej, umieść dwie elektrody ujemne po bokach głowy zarodka tuż obok i lekko doogonowo do komór bocznych i umieść elektrodę dodatnią między oczami tuż przed rozwijającym się pyskiem. Upewnij się, że zarodek jest obficie nawilżony i zastosuj cztery impulsy kwadratowe.

Wstrzyknij i naelektryzuj wszystkie zarodki, przechodząc jeden po drugim, tak aby każdy zarodek został poddany elektroporacji natychmiast po wstrzyknięciu roztworu DNA. Gdy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie włóż rogi macicy z powrotem do jamy brzusznej. Pokryj jamę brzuszną sterylnym PBS, aby ułatwić umieszczenie rogu macicy.

Wypełnij jamę brzuszną sterylnym PBS, aby po zakończeniu szycia nie pozostały żadne kieszenie powietrzne. Zszyj mięsień szwami wchłanialnymi, a skórę jedwabnymi szwami niewchłanialnymi. Pozwól, aby zapora w pełni się zregenerowała w ogrzewanej komorze przez co najmniej jedną godzinę.

Sprawdzaj stan zapór regularnie w ciągu najbliższych 48 godzin. Gdy tama dojdzie do siebie po znieczuleniu i odzyska przytomność, zacznie się poruszać i trzepać. Metodę tę zastosowano do transfekcji około 5 000 neuronów piramidowych warstwy 2/3 plazmidem pCAG-GFP.

Większość tych komórek była zlokalizowana w obszarach kory czołowej. Reprezentatywny przykład pokazuje rostralny ogonowy rozkład transfekowanych neuronów u dorosłej myszy kontrolnej, potwierdzając zdolność obustronnych IUE do celowania i genetycznego znakowania dużych populacji neuronów piramidowych w korze czołowej. Pierwsza część zadania interakcji matczynej testuje zdolność myszy transfekowanych P18 z grupy kontrolnej do znalezienia ściółki w gnieździe.

Myszy kontrolne spędzały więcej czasu na odkrywaniu swojego posłania w gnieździe niż na odkrywaniu świeżej ściółki, co sugeruje, że mają nienaruszone zdolności sensoryczno-motoryczne i zachowania eksploracyjne. Druga część zadania wykorzystuje tendencję myszy do motywowania się do interakcji z matką. W tym zadaniu szczenięta spędzały większość czasu w pobliżu matki, spędzając znacznie mniej czasu na odkrywaniu pustego kubka lub ściółki gniazda.

Dorosłe myszy kontrolne spędzały około 35% czasu na odkrywaniu nowego obiektu. Kiedy przedstawiono im powieść i znajomy obiekt, dorosłe myszy spędzały więcej czasu na odkrywaniu nowego obiektu. W zadaniu towarzyskim dorosłe myszy z grupy kontrolnej spędzały podobną ilość czasu na odkrywaniu nowej myszy i pustego kubka.

To zachowanie było automatycznie śledzone za pomocą oprogramowania DeepLabCut poprzez oznaczanie różnych punktów na myszy, w tym kończyn, środka ciężkości, głowy i uszu. Oprogramowanie zostało również wykorzystane do określenia, kiedy myszy się wychowują, badając długość ciała myszy, ponieważ odległość ta skraca się, gdy mysz się cofa. Po tej procedurze można uzyskać odpowiedzi na wiele komórkowych pytań molekularnych, badając tkankę i oznaczając różne miary, takie jak gęstość kręgosłupa lub poziomy ekspresji różnych białek.