Name: Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj obustronną elektroporację in utero do badania wpływu genów na zachowanie myszy. Ta metoda umożliwia szybką analizę ekspresji genów w neuronach kory czołowej bez konieczności tworzenia linii genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lisie Kretsge za krytyczne opinie i edycję manuskryptu. Dziękujemy wszystkim asystentom badawczym w laboratorium Cruz-Martín, którzy byli nieocenieni w pomocy w perfuzjach i liczeniu komórek w mózgach behawioralnych. Dziękujemy Andrzejowi Cwetschowi za wkład w projekt elektrody tripolarnej oraz Toddowi Blute'owi i Boston University Biology Imaging Core za użycie mikroskopu konfokalnego. Praca ta była wspierana przez NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), Brenton R. Lutz Award (ALC), I. Alden Macchi Award (ALC), NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) oraz Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+and+meta-analysis+of+a+schizophrenia+GWAS+variant+rs10489202+in+East+Asian+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations.</a> Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).</li>
<li>Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+insights+from+108+schizophrenia-associated+genetic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci.</a> Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).</li>
<li>Howard, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+meta-analysis+of+depression+identifies+102+independent+variants+and+highlights+the+importance+of+the+prefrontal+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).</li>
<li>Grove, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+genetic+risk+variants+for+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder.</a> Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).</li>
<li>Comer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+schizophrenia-associated+gene+C4+leads+to+hypoconnectivity+of+prefrontal+cortex+and+reduced+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction.</a> PLoS Biology. 18 (1), 3000604(2020).</li>
<li>Chini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+and+Rescuing+Developmental+Miswiring+in+a+Mouse+Model+of+Cognitive+Impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment.</a> Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).</li>
<li>Clifton, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+genes+associated+with+schizophrenia+and+bipolar+disorder+across+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development.</a> Translational Psychiatry. 9 (1), 74(2019).</li>
<li>Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dysfunction+of+prefrontal-hippocampal+networks+in+mouse+models+of+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness.</a> European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).</li>
<li>Batista-Brito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Dysfunction+of+VIP+Interneurons+Impairs+Cortical+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits.</a> Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Dissection+of+Neural+Circuits%3A+A+Decade+of+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress.</a> Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).</li>
<li>DeNardo, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+strategies+to+access+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genetic strategies to access activated neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Circuit+Tracing+with+Glycoprotein-Deleted+Rabies+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses.</a> Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).</li>
<li>Cruz-Martín, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+circuit+links+direction-selective+retinal+ganglion+cells+to+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex.</a> Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+genome+editing+through+CRISPR-Cas9+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering.</a> Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).</li>
<li>Strecker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+DNA+insertion+with+CRISPR-associated+transposases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases.</a> Science. 365 (6448), 48-53 (2019).</li>
<li>Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+the+elongation+of+early+dendritic+protrusions+via+mGluRs+in+wild+type+mice%2C+but+not+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice.</a> PLoS One. 7 (2), 32446(2012).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37(2011).</li>
<li>Szczurkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+genetic+manipulation+of+the+mouse+or+rat+brain+by+in+utero+electroporation+with+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe.</a> Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).</li>
<li>Mathis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeepLabCut%3A+markerless+pose+estimation+of+user-defined+body+parts+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning.</a> Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+30+new+susceptibility+loci+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).</li>
<li>Ripke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+13+new+risk+loci+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> Journal of Visualized Experiment. (90), e51518(2014).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Soma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+mouse+amygdala+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W niniejszym artykule opisano proces, który łączy manipulację nowymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania w dużych populacjach neuronów kory czołowej z testami behawioralnymi u myszy. Co więcej, proces ten pozwala na podłużne badanie zachowania tych samych myszy zarówno we wczesnym okresie rozwoju pourodzeniowego, jak i w wieku dorosłym. Technika ta pozwala uniknąć konieczności polegania na genetycznych modelach zwierzęcych, co może być kosztowne pod względem czasu i kosztów. Zaletą tego protokołu jest to, że możn...

Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) doprowadziły do odkrycia nowych genów kandydujących, które są związane z patologiami mózgu1,2,3,4. Badania te były szczególnie korzystne w zrozumieniu wyniszczających zaburzeń neuropsychiatrycznych, takich jak schizofrenia (SCZ), gdzie badanie nowych genów posłużyło jako punkt wyjścia dla nowych kierunków badań i interwencji terapeutycznych5,6. Geny niosące ryzyko SCZ wykazują stronniczą ekspresję w korze przedczołowej (PFC) podczas rozwoju prenatalnego i wczesnego rozwoju poporodowego, regionie związanym z patologią kilku zaburzeń neuropsychiatrycznych7. Dodatkowo, mysie modele zaburzeń psychicznych wykazują nieprawidłową aktywność w sieciach PFC6,8,9. Wyniki te sugerują, że geny związane z SZC mogą odgrywać rolę w okablowaniu rozwojowym tego regionu. Konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, aby zrozumieć wkład tych genów kandydujących do tworzenia połączeń w PFC i ustalić, czy geny te odgrywają sprawczą rolę w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych. Techniki manipulacji genetycznej u myszy, które pozwalają na badanie zmian ekspresji genów w określonych obwodach neuronalnych podczas rozwoju prenatalnego i wczesnego postnatalnego, są obiecującą metodą zrozumienia mechanizmów molekularnych, które łączą zmiany ekspresji genów z dysfunkcją PFC.
Genetyczne linie myszy oferują metodę badania wpływu poszczególnych genów na rozwój i funkcjonowanie mózgu. Jednak poleganie na myszach transgenicznych może być ograniczające, ponieważ nie zawsze istnieją komercyjnie dostępne linie do badania wpływu określonych genów na rozwój obwodów neuronalnych. Co więcej, opracowanie niestandardowych linii myszy może być niezwykle kosztowne i czasochłonne. Zastosowanie intersekcjonalnych strategii manipulacji genetycznej, które łączą transgeniczne myszy z podejściami wirusowymi, zrewolucjonizowało zrozumienie mózgu10,11,12. Pomimo znacznego postępu, strategie wirusowe mają pewne ograniczenia w zależności od typu wektora wirusowego, w tym ograniczenia w pojemności pakowania, które mogą ograniczać ekspresję wirusa13 i toksyczność komórek związaną z ekspresją wirusa14. Co więcej, w większości warunków eksperymentalnych, silna ekspresja genów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wymaga około 2 do 4 tygodni15, co sprawia, że rutynowe strategie wirusowe są niewykonalne w celu manipulowania genami we wczesnym okresie rozwoju pourodzeniowego.
Elektroporacja in utero (IUE) to alternatywne podejście, które pozwala na szybki i tani transfer genów16,17, które w połączeniu z etykietowaniem fluorescencyjnym i podejściem farmakogenetycznym lub optogenetycznym stanowi potężną platformę do analizy funkcji obwodów neuronalnych. Dodatkowo, wraz z rozwojem CRISPR-Cas9, geny edytujące genom mogą ulegać nadekspresji lub precyzyjnie zmieniane poprzez specyficzne dla typu komórki knock-down lub knock-out określonych genów lub poprzez modulację promotorów18,19. Metody manipulacji genami z wykorzystaniem IUE są szczególnie korzystne, gdy wpływ genów na obwody neuronalne musi być badany w wąskich oknach rozwojowych20. IUE jest wszechstronną techniką, a nadekspresję można łatwo osiągnąć poprzez wstawienie genu do wektora ekspresyjnego pod określonym promotorem. Dodatkową kontrolę ekspresji genów można osiągnąć poprzez sterowanie ekspresją za pomocą promotorów o różnej sile lub za pomocą indukowalnych promotorów zdolnych do czasowego kontrolowania ekspresji genów21,22. Dodatkowo, IUE pozwala na celowanie w komórki w określonych warstwach kory mózgowej, typach komórek i regionach mózgu, co nie zawsze jest możliwe przy użyciu innych podejść5,17. Ostatnie postępy w konfiguracji IUE opartej na użyciu trzech elektrod, która generuje bardziej wydajny rozkład pola elektrycznego, rozszerzyły funkcjonalny repertuar tej metody i pozwoliły naukowcom skupić się na nowych typach komórek oraz zwiększyć wydajność, dokładność i liczbę komórek, które mogą być celowane23,24. Technika ta została niedawno wykorzystana do określenia przyczynowej roli składnika dopełniacza 4A (C4A), genu związanego z SCZ, w funkcji PFC i wczesnym poznaniu5.
Prezentowany tutaj jest eksperymentalny potok, który łączy podejścia do transferu genów w celu celowania w duże populacje neuronów pobudzających w korze czołowej, w tym PFC, z paradygmatami behawioralnymi, które nie tylko umożliwiają badanie zmian na poziomie komórek i obwodów, ale także pozwalają na monitorowanie zachowania we wczesnym okresie rozwoju postnatalnym i dorosłości. Pierwszą opisaną metodą jest obustronna transfekcja dużych populacji neuronów piramidowych warstwy (L) 2/3 w obszarach kory czołowej. Następnie przedstawiono zadania mające na celu zbadanie zachowań społecznych u młodych i dorosłych myszy. Liczbę komórek można uzyskać po wykonaniu zadań behawioralnych w celu ilościowego określenia zakresu i lokalizacji transfekcji komórek. Co więcej, liczba transfekowanych komórek może być skorelowana z danymi behawioralnymi w celu określenia, czy większa liczba transfekowanych komórek prowadzi do większych zaburzeń w zachowaniu.

<table><tbody><tr><td>13mm Jedwabny pleciony szew</td><td>Hakla</td><td>SB77D</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do szwów Adson</td><td>F.S.T.</td><td>11006-12</td><td>IUE</td></tr><tr><td>C270 Webcam</td><td>Logitech</td><td>N/A</td><td>Rejestruj zachowanie</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Zbudowany na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>Patrz rysunek 1 i 2 oraz Bullmann i in., 2015</td></tr><tr><td>EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>BS466</td><td>Preparat Pladmid</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Barwnik do roztworu DNA</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - ostre</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki z gazy IUE Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>1376152</td><td>IUE</td></tr><tr><td>Gaymar Ogrzewanie/chłodzenie</td><td>Braintree</td><td>TP-700</td><td>Poduszka grzewcza</td></tr><tr><td>Szklany ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument,</td> <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td> IUE <td>Instrument Sutter,</td> <td>BF150-117-10</td><td></td></tr><tr><td>Balsam do depilacji</td> IUE <td>Nair</td><td>N/A</td><td>Depilacja</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>F.S.T.</td><td>13002-10</td><td>IUE</td></tr><tr><td>Labirynt na otwartym polu - domowa akrylowa arena</td><td>Zbudowany na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>50 &razy; 50 & razy; 30 cm długość-szerokość-wysokość</td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td>Wektor ekspresji ssaków do ekspresji GFP</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>N/A</td><td>Wtryskiwacz ciśnieniowy</td></tr><tr><td>Retraktor - 2 zęby</td><td>FST</td><td>17023-13</td><td>IUE</td></tr><tr><td>Kleszcze pierścieniowe</td><td>F.S.T.</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>IUE Sterylizator, suchy koralik</td><td>Sigma</td><td>Z378569</td><td>sterylizowane narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>SZEW, 3/0 PGA, FS-2, FIOLETOWY TYLKO DO UŻYTKU WETERYNARYJNEGO</td><td>Havel's</td><td>HJ398</td><td>Mięsień szwu</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12105-84</td><td>rozgrzewająca sterylna sól fizjologiczna</td></tr></tbody></table>

rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

Ponieważ badania asocjacyjne całego genomu rzucają światło na heterogeniczne genetyczne podstawy wielu chorób neurologicznych, wzrasta potrzeba zbadania wpływu określonych genów na rozwój i funkcjonowanie mózgu. Opieranie się na modelach mysich w celu zbadania roli określonych manipulacji genetycznych nie zawsze jest wykonalne, ponieważ transgeniczne linie myszy są dość kosztowne, a wiele nowych genów związanych z chorobą nie ma jeszcze komercyjnie dostępnych linii genetycznych. Ponadto stworzenie linii myszy może zająć lata rozwoju i walidacji. Elektroporacja in utero oferuje stosunkowo szybką i łatwą metodę manipulowania ekspresją genów w sposób specyficzny dla typu komórki in vivo, która wymaga jedynie opracowania plazmidu DNA w celu osiągnięcia określonej manipulacji genetycznej. Obustronna elektroporacja in utero może być stosowana do celowania w duże populacje neuronów piramidowych kory czołowej. Połączenie tej metody transferu genów z podejściami behawioralnymi pozwala na badanie wpływu manipulacji genetycznych na funkcję sieci kory przedczołowej i zachowania społeczne młodych i dorosłych myszy.

Pomyślne opracowanie i wdrożenie własnego elektroporatora oraz elektrody trójzębowej. 
Do przeprowadzenia IUE zbudowano niedrogi, własny elektroporator w oparciu o wcześniej opisany projekt27 (Rycina 1A i Rycina 2). Wykonano elektrodę trójzębową23,24, wykorzystując plastikową pincetę z dwiema elektrodami ujemnymi przymocowanymi do końcówek zębów, natomiast elek...

Rola niedawno odkrytych genów związanych z chorobą w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje niejasna. Zmodyfikowana technika obustronnej elektroporacji in utero pozwala na transfer genów w dużych populacjach neuronów i badanie przyczynowego wpływu zmian ekspresji genów na zachowania społeczne.

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

Zastosowanie tej metody może pozwolić na odkrycie, w jaki sposób pewne zmiany ekspresji genów mogą być przypisywane patologiom związanym z chorobami neurologicznymi. Zaletą tej techniki jest to, że omija ona konieczność tworzenia lub kupowania genetycznych linii zwierzęcych, których stworzenie i walidacja mogą zająć lata. Technika ta pozwala na badanie genów związanych z zaburzeniami neurologicznymi.Ustalenie, w jaki sposób określone geny przyczyniają się do patologii, jest ważnym krokiem w opracowywaniu nowych terapii. Zaletą tego protokołu jest nauczenie się manipulowania zarodkami w taki sposób, aby eksperymentator wykonał etap transferu genów bez zmniejszania wskaźników przeżycia. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ zarodki są bardzo delikatne, dlatego pomocna jest obserwacja, jak doświadczony eksperymentator manipuluje nimi podczas zabiegu.Ciężarne matki należy przyprowadzić na miejsce zabiegu co najmniej 30 minut przed zabiegiem. Wysterylizuj całe miejsce operacji za pomocą wysterylizowanych chusteczek bakteriobójczych, a następnie 70% etanolu. Następnie wysterylizuj narzędzia autoklawu w sterylizatorze z kulkami szklanymi.Przenieś sterylny PBS do 50-mililitrowych probówek stożkowych i umieść probówki w łaźni wodnej podgrzanej do 38 do 40 stopni Celsjusza. Sprawdź temperaturę sterylnej soli fizjologicznej za pomocą termometru. Włącz pompę obiegową podgrzewania wody tak, aby była rozgrzana do 37 stopni Celsjusza.Następnie włącz wtryskiwacz ciśnieniowy i elektroporator i zapewnij prawidłowe działanie. Krótko odwiruj roztwór DNA osocza na wirówce stołowej i umieść go na lodzie. Pociągnij szklane pipety za ściągacz do pipet tak, aby końcówka wyciągniętej szklanej pipety miała średnicę około 50 mikrometrów.Następnie napełnij pipetę 20 do 40 mikrolitrami roztworu DNA. Przygotuj wszystkie niezbędne przedmioty do operacji, w tym balsam do depilacji, jod, 70% etanol, waciki, krople do oczu, szwy i gazę. Przygotuj kartę zabiegową i wypełnij niezbędne informacje.Zważ mysz przed zabiegiem i zapisz wagę. Po znieczuleniu myszy podaj przedoperacyjne leki przeciwbólowe i usuń sierść z brzucha za pomocą kremu do depilacji lub maszynki do golenia. Wysterylizuj brzuch, trzykrotnie przecierając go jodonem powidonu i 70% etanolem.Stwórz sterylne pole wokół brzucha za pomocą sterylnej gazy i drapowania. Wykonaj nacięcie w linii środkowej w skórze brzucha, jednocześnie podnosząc skórę kleszczami, aby uniknąć przecięcia mięśnia. Następnie podnieś mięsień do góry i przetnij go, uważając, aby nie przeciąć ważnych narządów.Ostrożnie wyciągnij rogi macicy z matki za pomocą kleszczy z pierścieniami i delikatnie umieść je na sterylnym polu, upewniając się, że są podparte wyściółką i nie ciągną zbyt daleko od zapory. Utrzymuj róg macicy zwilżony przez resztę operacji za pomocą wstępnie podgrzanego, sterylnego PBS. Umieść zarodek za pomocą kleszczy lub palców, a następnie ostrożnie włóż wyciągniętą szklaną pipetę do bocznego pionu i wstrzyknij od dwóch do trzech mikrolitrów do każdej komory, wkładając pipetę do jednej, a następnie drugiej komory.Komora została skutecznie ukierunkowana, jeśli po wstrzyknięciu występuje kształt półksiężyca. Aby transfekować komórki obustronnie w korze czołowej, umieść dwie elektrody ujemne po bokach głowy zarodka tuż obok i lekko doogonowo do komór bocznych i umieść elektrodę dodatnią między oczami tuż przed rozwijającym się pyskiem. Upewnij się, że zarodek jest obficie nawilżony i zastosuj cztery impulsy kwadratowe.Wstrzyknij i naelektryzuj wszystkie zarodki, przechodząc jeden po drugim, tak aby każdy zarodek został poddany elektroporacji natychmiast po wstrzyknięciu roztworu DNA. Gdy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie włóż rogi macicy z powrotem do jamy brzusznej. Pokryj jamę brzuszną sterylnym PBS, aby ułatwić umieszczenie rogu macicy.Wypełnij jamę brzuszną sterylnym PBS, aby po zakończeniu szycia nie pozostały żadne kieszenie powietrzne. Zszyj mięsień szwami wchłanialnymi, a skórę jedwabnymi szwami niewchłanialnymi. Pozwól, aby zapora w pełni się zregenerowała w ogrzewanej komorze przez co najmniej jedną godzinę.Sprawdzaj stan zapór regularnie w ciągu najbliższych 48 godzin. Gdy tama dojdzie do siebie po znieczuleniu i odzyska przytomność, zacznie się poruszać i trzepać. Metodę tę zastosowano do transfekcji około 5 000 neuronów piramidowych warstwy 2/3 plazmidem pCAG-GFP.Większość tych komórek była zlokalizowana w obszarach kory czołowej. Reprezentatywny przykład pokazuje rostralny ogonowy rozkład transfekowanych neuronów u dorosłej myszy kontrolnej, potwierdzając zdolność obustronnych IUE do celowania i genetycznego znakowania dużych populacji neuronów piramidowych w korze czołowej. Pierwsza część zadania interakcji matczynej testuje zdolność myszy transfekowanych P18 z grupy kontrolnej do znalezienia ściółki w gnieździe.Myszy kontrolne spędzały więcej czasu na odkrywaniu swojego posłania w gnieździe niż na odkrywaniu świeżej ściółki, co sugeruje, że mają nienaruszone zdolności sensoryczno-motoryczne i zachowania eksploracyjne. Druga część zadania wykorzystuje tendencję myszy do motywowania się do interakcji z matką. W tym zadaniu szczenięta spędzały większość czasu w pobliżu matki, spędzając znacznie mniej czasu na odkrywaniu pustego kubka lub ściółki gniazda.Dorosłe myszy kontrolne spędzały około 35% czasu na odkrywaniu nowego obiektu. Kiedy przedstawiono im powieść i znajomy obiekt, dorosłe myszy spędzały więcej czasu na odkrywaniu nowego obiektu. W zadaniu towarzyskim dorosłe myszy z grupy kontrolnej spędzały podobną ilość czasu na odkrywaniu nowej myszy i pustego kubka.To zachowanie było automatycznie śledzone za pomocą oprogramowania DeepLabCut poprzez oznaczanie różnych punktów na myszy, w tym kończyn, środka ciężkości, głowy i uszu. Oprogramowanie zostało również wykorzystane do określenia, kiedy myszy się wychowują, badając długość ciała myszy, ponieważ odległość ta skraca się, gdy mysz się cofa. Po tej procedurze można uzyskać odpowiedzi na wiele komórkowych pytań molekularnych, badając tkankę i oznaczając różne miary, takie jak gęstość kręgosłupa lub poziomy ekspresji różnych białek.

a-pipeline-using-bilateral-utero-electroporation-to-interrogate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wewnątrzmaciczna iniekcja in vivo oraz elektroporacja nowokory embrionalnego szczura stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi...

Wewnątrzkomorowe wstrzykiwanie i elektroporacja in utero embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16)

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Geny mogą być manipulowane podczas rozwoju kory mózgowej lub hipokampa szczura za pomocą elektroporacji in utero (IUE) w E16, aby umożliwić szybkie i ukierunkowane modyfikacje połączeń neuronalnych do późniejszych badań zachowania lub neuropatologii u dorosłych zwierząt. Poporodowe obrazowanie in vivo w celu kontroli powodzenia IUE wykonuje się za pomocą bioluminescencji aktywacji kotransfekowanej lucyferazy.

Wytwarzanie miejscowo transgenicznych szczurów za pomocą elektroporacji in utero i badań przesiewowych bioluminescencji in vivo

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Poznaj obustronną elektroporację in utero do badania wpływu genów na zachowanie myszy. Ta metoda umożliwia szybką analizę ekspresji genów w neuronach kory czołowej bez konieczności tworzenia linii genetycznych.

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

Przeglądaj więcej filmów