Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych

Ten nowatorski protokół opisuje wykorzystanie wielu odrębnych sekwencji syntetycznego kwasu nukleinowego naśladującego gamma PNA do tworzenia nanostruktur w określonych mieszaninach rozpuszczalników organicznych. Opisane tutaj testy wskazują na potrzebę dostosowania istniejących protokołów nanotechnologii kwasów nukleinowych do rozpuszczalników organicznych, w przypadku których opublikowano niewiele protokołów lub nie opublikowano ich wcale. Praktycy, którzy nie mają doświadczenia w tej technice, mogą mieć trudności z dostosowaniem istniejących protokołów opracowanych dla środowisk bogatych w wodę do środowisk bogatych w rozpuszczalniki organiczne ze względu na skłonność nanomateriału PNA do agregacji.

Zacznij od przygotowania zapasów gamma PNA. Po uzyskaniu oczyszczonych nici gamma PNA klasy HPLC od komercyjnego producenta, ponownie zasymij każdą nić w wodzie dejonizowanej do stężeń 300 mikromolowych. Przechowuj PANA gamma w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do kilku miesięcy.

Gdy są gotowe do samodzielnego montażu, przygotuj próbki wsadowe do wyżarzania w 75% DMSO, 75% DMF i 40%1, 4-dioksanu. Najpierw przygotuj 20 mikromolowych podzbiorów każdego oligomeru, dzieląc 0,67 mikrolitra z głównego zapasu i dodając wodę dejonizowaną do końcowej objętości 10 mikrolitrów. Dodaj jeden mikrolitr każdego oligomeru z 20 mikromolowych podzbiorów do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów, co uzyska łączną objętość dziewięciu mikrolitrów na dziewięć oligomerów.

Dodaj 30 mikrolitrów bezwodnego DMSO lub DMF z dodatkowym jednym mikrolitrem wody dejonizowanej, aby uzyskać końcową objętość 40 mikrolitrów. Aby przygotować partię 40%1, 4-dioksanu, dodaj 16 mikrolitrów 1,4-dioksanu i doprowadź objętość do 40 mikrolitrów wodą dejonizowaną. Wyżarzaj próbki przez 22,5 godziny w termocyklerze, schładzając od 90 do 20 stopni Celsjusza.

Zazwyczaj temperatury topnienia uzyskiwane dla dwóch oligomerów i trzech oligomerowych podzbiorów gamma PNA mieszczą się w zakresie od 40 do 70 stopni Celsjusza dla różnych warunków rozpuszczalnika. Zaprogramuj termocykler zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Po zakończeniu wyżarzania próbki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin przed charakteryzacją.

Przygotuj komorę wilgotnościową z pustego pudełka po końcówkach do pipet, napełniając pudełko około pięcioma mililitrami wody. Przygotować 20-krotne rozcieńczenie dostępnego w handlu 2% kolodionu w octanie amylu z rozpuszczalnikiem octanu izoamylu, aby uzyskać roztwór nitrocelulozy. Za pomocą pęsety zanurz szkiełko nakrywkowe w roztworze nitrocelulozy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, a następnie wykonaj komorę przepływową ze szkiełka mikroskopowego, dwóch dwustronnych pasków taśmy i szkiełka nakrywkowego pokrytego nitrocelulozą.

Przygotować roztwór BSA biotyny, ważąc jeden miligram biotyny BSA i rozpuszczając go w jednym mililitrze PBS. Odpipetować 15 mikrolitrów biotyny BSA do kanału przepływowego pod kątem i inkubować przez dwie do czterech minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Wdmuchnąć 15 mikrolitrów buforu do mycia, który składa się z jednego miligrama BSA w jednym mililitrze PBS, do kanału, aby zmyć nadmiar biotyny BSA, a następnie pasywować powierzchnię poprzez inkubację kanału przepływowego przez dwie do czterech minut w wilgotnej komorze.

Odmierz 0,5 miligrama streptawidyny i jeden miligram BSA, a następnie rozpuść oba w jednym mililitrze PBS. Odpipetować 15 mikrolitrów roztworu streptawidyny do kanału przepływowego i umieścić go w wilgotnej komorze na dwie do czterech minut, a następnie przemyć kanał, przepływając 15 mikrolitrów buforu do mycia. Następnie przelej 15 mikrolitrów wyżarzonej partii oligomerów gamma PNA w wilgotnej komorze, a następnie umyj niezwiązane nanostruktury, przepływając 15 mikrolitrów jednego milimolowego Troloxa w tym samym składzie rozpuszczalnika, co nanostruktury.

Przenieś kanał przepływu do uchwytu szkiełka i zobrazuj go za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obrazowanie TIRF, 60-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju i 1,5-krotną lupę. Skanuj kanał przepływu w powiększeniu 60 lub 90x, jednocześnie monitorując kanał Cy3. Przygotuj 20 i 6% SDS zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie wyżarz oligomery gamma PNA, dodając jeden mikrolitr każdego 20 mikromolowego oligomeru do 200 mikrolitrowej probówki PCR.

Dodaj 30 mikrolitrów bezwodnego DMSO i jeden mikrolitr 6% lub 20% SDS do probówek PCR, aby uzyskać końcową objętość 40 mikrolitrów, co da końcowe stężenie SDS odpowiednio 5,25 lub 17,5 milimola. Wyżarzać PNA gamma w termocyklerze, jak opisano wcześniej. Scharakteryzować nanostruktury gamma PNA w obecności SDS za pomocą protokołu TIRF lub TEM.

Obrazowanie TIRF oligomerów gamma PNA wyżarzonych w 75% DMSO wykazało dobrze zorganizowaną architekturę, podczas gdy wyżarzanie w 75% DMF skutkowało nanostrukturami w kształcie igły lub igieł. Warunek 40%1, 4-dioksan wytworzył rzadką dekorację nitkowatych nanostruktur. Ponadto próbki nanorurek gamma PNA utworzonych w 75% DMSO wykazały wiązanie nanowłókien w dużych powiększeniach lub rozdzielczościach nanoskopowych podczas obrazowania TEM.

Analiza ilościowa szerokości nanostruktur wykazała medianę szerokości 16,3 nanometra przy maksymalnych wartościach powyżej 80 nanometrów. Izosekwencyjne oligomery DNA, które zastąpiły przyległe PNA gamma, utworzyły proste nitkowate struktury, podczas gdy zastąpienie krzyżujących się PNA gamma skutkuje strukturami gwiaździstymi. Nanostruktury, które zostały zastąpione ciągłymi oligomerami DNA, miały medianę szerokości około 19 nanometrów.

Przy wysokich stężeniach SDS nanowłókna gamma PNA przyjmują również wysoce usieciowioną morfologię w porównaniu z krytycznymi stężeniami miceli podczas obrazowania TIRF. Obrazowanie TEM wskazuje, że montaż gamma PNA w SDS o średnicy 5,25 milimola powoduje najbardziej znaczące zmniejszenie wiązki strukturalnej. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać o zachowaniu wspomnianych kompozycji rozpuszczalników ze względu na skłonność nanostruktur do agregacji.

Metody te zachęcają praktyków do poszukiwania innych, niezbadanych ścieżek różnych kompozycji rozpuszczalników, środków powierzchniowo czynnych i innych nanostruktur DNA PNA.