Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej

Ten protokół określa kroki niezbędne do dostarczenia genu poprzez skoncentrowanie ultradźwięków na otwarciu bariery krew-mózg (BBB), ocenę wynikowej ekspresji genu oraz pomiar aktywności neuromodulacyjnej receptorów chemogenetycznych za pomocą testów histologicznych.

Nasz protokół umożliwia submilimetrowe precyzyjne celowanie w skoncentrowane ultradźwięki u myszy. Pozwala nam to na celowanie w ultradźwięki za pomocą niedrogich części drukowanych 3D bez konieczności korzystania z chirurgii lub sprzętu ultrasonograficznego kompatybilnego z MRI. Zogniskowane ultradźwięki otwierające barierę krew-mózg mogą być na początku dość trudne.

Bardzo ważne jest, aby przetwornik był prawidłowo połączony ze zwierzęciem za pomocą odgazowanego żelu lub wody oraz aby mikropęcherzyki nie zapadały się podczas wstrzykiwania. Procedurę zademonstruje Richard Li, doktorant z Caltech. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej myszy, użyj 10 jednostek na mililitr heparynizowanej soli fizjologicznej do umycia czystego cewnika o rozmiarze od 25 do 35 i użyj wkładki etanolowej do dezynfekcji ogona zwierzęcia.

Włóż cewnik do bocznej żyły ogonowej i użyj kleju tkankowego, aby zabezpieczyć cewnik na miejscu. Jeśli igła została prawidłowo umieszczona, w cewniku zaobserwuje się cofanie się krwi. Gdy klej wyschnie, usuń włosy z głowy zwierzęcia za pomocą kremu do depilacji i umieść mysz w wydrukowanym w 3D wózku MRI, montując przednie zęby na belce do gryzienia z głową wewnątrz stożka nosowego.

Przymocuj pręty do czaszki z bezpiecznym naciskiem i obserwuj oddech przez 30 sekund, aby potwierdzić, że zwierzę oddycha swobodnie z szybkością jednego oddechu na sekundę. Podłącz prowadnicę celowania do nauszników i ponownie sprawdź oddech. Umieść wózek MRI w uchwycie MRI i umieść uchwyt w otworze magnesu.

Następnie uzyskaj sekwencję MRI, aby zlokalizować mysz w skanerze, używając szybkiej sekwencji ujęć 3D pod niskim kątem, aby zobrazować cały mózg. Aby wykonać celowanie pod kontrolą rezonansu magnetycznego, umieść wózek w przyrządzie stereotaktycznym i użyj metalowego bloku z taśmą dwustronną, aby przymocować blok na miejscu do dwóch słupków wsporczych instrumentu stereotaktycznego. Prześlij obrazy MRI do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do kierowania ultrasonografią i otwórz obrazy.

Po załadowaniu wszystkich obrazów kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij ponownie formatuj, aby ponownie sformatować obraz do trzech osi. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zlokalizować przetwornik w prowadnicy celowania kołowego. W widoku strzałkowym dostosuj pionowe położenie wirtualnego przetwornika, aby uwzględnić grubość łaźni wodnej i obudowy przetwornika.

Wskaż obszary, które mają być docelowe w planerze trajektorii i zanotuj współrzędne w arkuszu kalkulacyjnym. Wybierz żądaną głębokość kierowania i zanotuj współrzędne, jak pokazano wcześniej. Następnie kliknij wyślij trajektorię i wykonaj, aby wycelować w każdy z punktów.

Aby skorelować współrzędne rezonansu magnetycznego z ramką stereotaktyczną, umieść niestandardowo zamontowany przetwornik nad prowadnicą celowniczą i przesuwaj, aż każda z trzech celowniczych będzie mogła przejść zarówno przez uchwyt przetwornika, jak i prowadnicę celowniczą. Upewnij się, że nie są naprężone ani przechylone i przesuń przetwornik o 10.56 milimetra do przodu w kierunku przednim-tylnym, aż przetwornik znajdzie się w punkcie, w którym środek prowadnicy celowniczej pojawi się na rezonansie magnetycznym. Następnie określ odległość od środka wirtualnego przetwornika do docelowego obszaru i użyj ramki, aby przesunąć przetwornik do tych współrzędnych.

Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, należy załadować 800 mikrolitrów soli fizjologicznej i 100 mikrolitrów środka kontrastowego MRI do 1,5 mililitrowej probówki z mieszaniem. Następnie doprowadź nieaktywowany roztwór mikropęcherzyków do temperatury pokojowej, a następnie aktywuj mikropęcherzyki na 45 sekund w urządzeniu do aktywacji mikropęcherzyków. Po aktywacji powoli załadować 100 mikrolitrów mikropęcherzyków ze środka roztworu do jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 21 i dodać 80 mikrolitrów mikropęcherzyków do roztworu środka kontrastowego.

Wymieszaj przygotowany roztwór, delikatnie odwracając rurkę o pojemności 1,5 mililitra przez 15 sekund, aby uniknąć flotacji. Pod koniec mieszania załadować 200 mikrolitrów roztworu mikropęcherzyków do strzykawki bez igły i odwrócić strzykawkę. Wcisnąć i wycofać tłok, aby wymieszać i przymocować igłę o rozmiarze 30 do strzykawki, gdy jest ona nadal odwrócona.

Następnie powoli wypchnij roztwór mikropęcherzyków, aż na końcu igły pojawią się kropelki. Gdy tylko mikropęcherzyki będą gotowe, ustaw czas trwania impulsu dla insonacji na 10 milisekund, ze 120 powtórzeniami co sekundę, z naciskiem od 0,3 do 0,45 megapaskali na czaszkę. Zdejmij prowadnicę celowniczą i nałóż odgazowany żel ultradźwiękowy na głowę myszy, uważając, aby nie powstały bąbelki.

Opuść przetwornik, aż zostanie umieszczony bezpośrednio na płaskiej części uchwytu paska na uszy i wybierz współrzędne w instrumentach stereotaktycznych. Rozcieńczyć interesującego wirusa związanego z adenowirusem w stężeniu od 0,5 do 2 razy 10 do 10 na gram masy ciała i załadować cząsteczki wirusa do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30. Wstrzyknąć roztwór do cewnika do żyły ogonowej i wstrzyknąć 80 mikrolitrów roztworu mikropęcherzyków do myszy.

Aby ocenić otwarcie bariery krew-mózg za pomocą rezonansu magnetycznego, należy nagrać szybką sekwencję ujęć pod niskim kątem, jak pokazano. W celu stymulacji DREADD należy rozpuścić N-tlenek klozapiny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w stężeniu jednego miligrama na mililitr i wstrzyknąć go dootrzewnowo. 15 do 45 minut po porodzie zacznij rejestrować aktywność behawioralną zwierzęcia.

Do analizy aktywacji neuronów użyj tkanki mózgowej. Zgodnie z protokołem, jak pokazano, wzmocnienie sygnału T1 można osiągnąć w regionie hipokampa i innych częściach mózgu. Jak zaobserwowano, barwienie immunologiczne przeciwko mCherry prowadzi do bardziej wiarygodnego wykrywania ekspresji DREADD W tej procedurze należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z mikropęcherzykami i upewnieniu się, że zwierzę jest stabilne podczas obrazowania MRI i insonacji.