Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

Protokół ten może być stosowany do badania zmian w środowisku płucnym po udarze niedokrwiennym. Metoda ta pozwala na identyfikację 13 typów komórek odpornościowych płuc oraz 13 różnych cytokin i chemokin u tej samej myszy za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Metoda ta została wykorzystana do oceny zmian w środowisku płucnym po udarze niedokrwiennym.

Może jednak również służyć do badania zmian zachodzących podczas reakcji alergicznej lub infekcji. Aby wykonać perfuzję przezsercową całego ciała, potwierdź brak reakcji na odbicie pedału u znieczulonej myszy i przymocuj mysz do platformy chirurgicznej. Zwilż futro 70% etanolem, aby zmniejszyć rozprowadzanie sierści do jamy ciała i wykonaj pionowe nacięcie skóry w linii środkowej, aby odsłonić nienaruszoną otrzewną, zatrzymując nacięcie, gdy tylko dojdziesz do jamy piersiowej.

Użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby wykonać nacięcie w linii środkowej otrzewnej, zatrzymując się wcześniej w jamie klatki piersiowej i użyj kleszczy, aby chwycić dystalny koniec mostka. Użyj nożyczek, aby przeciąć przeponę, nie uszkadzając serca, płuc ani naczyń krwionośnych. Gdy leżące poniżej tkanki są widoczne, wykonaj nacięcie przez klatkę piersiową i zabezpiecz boki żeber tak, aby serce i płuca były całkowicie odsłonięte.

Ostrożnie wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku w pobliżu łuku aorty, aby służyło jako odpływ do perfuzji i szybko, ale delikatnie włóż igłę o rozmiarze 25 do dystalnej górnej powierzchni lewej komory. Gdy igła znajdzie się na miejscu, delikatnie spłucz 10 mililitrów zimnego PBS do serca. Tkanka powinna zacząć oczyszczać się z krwi.

Po dostarczeniu całej objętości należy wykonać drugą 10-mililitrową porcję zimnego PBS, aż wątroba wykaże jasnobrązowy wygląd, a płuca zmienią kolor z czerwonawo-różowego na przeważnie biały. Za pomocą kleszczy i drobnych nożyczek preparacyjnych ostrożnie usuń wszystkie otaczające tkanki przed oddzieleniem płatów płuc i umieszczeniem ich na szalce Petriego zawierającej od jednego do dwóch mililitrów zimnej komórki płucnej, pożywki na lodzie. Aby przygotować tkankę płucną do matryc kulek multipleksowych, dodaj 200 mikrolitrów zimnego buforu homogenizacyjnego do dwumililitrowej probówki zawierającej trzy sterylne kulki cyrkonu / krzemionki o pojemności 2,3 mililitra i zważ płat płuc, który Cię

Przenieść od 50 do 100 miligramów tkanki płucnej do wstępnie schłodzonej probówki z kulkami i buforem homogenizacyjnym i homogenizować płat za pomocą homogenizatora na bazie kulek z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez co najmniej dwie minuty. Gdy tkanka zostanie całkowicie zhomogenizowana, odwiruj probówkę w celu osadzenia tkanki i przenieś super natant do wstępnie schłodzonej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. W celu dysocjacji tkanki płucnej ostrożnie zdekantować pożywkę z komórek płuc z pozostałego płata płuca i wprowadzić igłę o rozmiarze 25 do tkanki.

Wstrzyknąć od 200 do 250 mikrolitrów objętości buforu dysocjacyjnego do każdego płata płuc, aby napompować płuca, aż każdy z płatów zostanie wstrzyknięty dwa do trzech razy. Po dwuminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej użyj drobnych nożyczek do rozwarstwiania, aby zmielić płuca na małe kawałki i przenieś roztwór tkankowy do 15-mililitrowej probówki kronikowej. Dodać sześć mililitrów dodatkowego buforu dysocjacyjnego do próbki i energicznie wirować przez jedną minutę.

Następnie inkubuj kawałki tkanki przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wirując co siedem do ośmiu minut. Pod koniec inkubacji energicznie wirować próbkę przez jedną minutę i przepuścić próbkę przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów, aby usunąć wszelkie pozostałości niepożądanej tkanki łącznej i śródmiąższowej. Zebrać tkankę przez odwirowanie i ponownie zawiesić na osad z pięcioma mililitrami zimnego podłoża płucnego.

Ponownie odwirować próbkę i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnej pożywki płucnej z delikatnym wirowaniem. Następnie przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 mikronów przed zliczeniem. Aby ocenić populacje komórek odpornościowych w izolowanej tkance płucnej, wysiewaj przeciwciała od 1 do dwóch razy od 10 do szóstych komórek mocy umieść w odpowiedniej liczbie dołków z 96-dołkową okrągłą płytką dolną i umieść komórki na dnie płytki przez odwirowanie.

Dodaj 25 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał w zimnym buforze FACS do każdej studzienki i wymieszaj z delikatnym głaszczeniem fajki. Po 20 minutach ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach zimnego buforu FACS na studzienkę i przenieść próbki do indywidualnych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem z polistyrenu zawierających 150 mikrolitrów dodatkowego buforu FACS na probówkę. Następnie należy natychmiast przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej.

W tej reprezentatywnej analizie zidentyfikowano 13 różnych populacji komórek odpornościowych w płucach przy użyciu trzech zestawów od pięciu do siedmiu kombinacji przeciwciał. Martwe komórki wykluczono za pomocą żywej martwej plamy, a różne typy komórek odpornościowych rozróżniono za pomocą przeciwciał i markerów wymienionych w tabeli. W zestawie pierwszym zidentyfikowano makrofagi pęcherzykowe i śródmiąższowe, komórki dendrytyczne CD103 dodatnie i CD11B dodatnie oraz eozynofile.

Prozapalne monocyty i neutrofile zidentyfikowano w zestawie drugim, a limfocyty T CD4-dodatnie i CD8-dodatnie, limfocyty B, plazmocytoidalne komórki dendrytyczne, komórki NK i komórki NKT zidentyfikowano w zestawie trzecim. Całkowita liczba żywotnych komórek, procent komórek CD45 dodatnich i całkowita liczba uzyskanych komórek CD45 dodatnich były podobne między populacjami komórek, które zostały wyizolowane, jak wykazano, a populacjami komórek, które zostały wyizolowane przy użyciu dostępnego na rynku dysocjatora tkankowego. Ponadto odsetek śmierci komórek wśród komórek CD45 dodatnich wynosił mniej niż 10% dla obu protokołów, co sugeruje, że zademonstrowany protokół ułatwia odzyskanie wysokiej wydajności i jakości komórek bez pomocy automatycznego dysocjatora tkanek.

Co więcej, zastosowanie dostępnego na rynku testu multipleksowego w połączeniu z analizą cytometryczną przepływową pozwala na określenie stężenia chemokiny w każdej próbce na miligram tkanki. Stężenie kolagenazy D, czas inkubacji i temperatura stosowane podczas izolacji pojedynczej komórki mają krytyczny wpływ na regenerację komórek odpornościowych.