Name: Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj protokół biofunkcjonalizacji nanodrutów żelaznych przeciwciałami do celowanego namierzania komórek nowotworowych. Metoda obejmuje powlekanie APTES, aktywację EDC/Sulfo-NHS i charakteryzację spektroskopiową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha (KAUST).

UWAGA: Zawsze sprawdzaj wszystkie istotne karty charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Stosuj wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami). Przeprowadzić wszystkie reakcje biologiczne w dygestoriach biologicznych.
UWAGA: Ten protokół ma na celu wyprodukowanie 2 x10 10 biofunkcjonalizowanych NWs/ml odpowiadających 0,36 mg żelaza/ml pokrytych przeciwciałami anty-CD44 o gęstości 3 x 104 przeciwciał/NW. NW żelazo-tlenek żelaza (rdzeń-powłoka) mają długość 2,5 μm i średnicę 41,5 nm.
1. Uwolnienie nanodrutów żelaznych
UWAGA: Proces wytwarzania żelaza/tlenku żelaza NW został szczegółowo opisany w poprzedniej publikacji59.
<ol>
	<li>Na macie do cięcia pokrój aluminiowe (Al) krążki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) na małe kawałki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) za pomocą pojedynczego ostrza krawędziowego i małego młotka, aby zmieściły się w probówce o pojemności 2 ml. Użyj pęsety, aby przenieść małe kawałki Al do tuby.</li>
	<li>Napełnij probówkę o pojemności 2 ml, zawierającą małe kawałki Al, 1 ml 1 M wodorotlenku sodu (NaOH). Upewnij się, że wszystkie kawałki Al są pokryte NaOH.</li>
	<li>Pozostaw roztwór działający przez 30 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz dygestorium chemicznego.</li>
	<li>Za pomocą pęsety usuń tylko kawałki Al i trzymaj uwolnione NW (czarne skupiska, <silna klasa="xfig">Rysunek 3A) w roztworze NaOH przez dodatkowe 30 minut. Nie zmieniaj roztworu NaOH.</li>
	<li>Zbierz NWs, umieszczając probówkę o pojemności 2 ml w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty przed wyjęciem starego roztworu 1 M NaOH. Zastąp go świeżym roztworem NaOH.</li>
	<li>Sondować 2 ml probówkę zawierającą NW przez 30 s i pozostawić ją na 1 godzinę w dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.5-1.6 co najmniej cztery razy.</li>
	<li>Umyj NWs, umieszczając probówkę o pojemności 2 ml w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty.</li>
	<li>Wyrzucić roztwór NaOH i zastąpić go 1 ml absolutnego etanolu.</li>
	<li>Sonikuj rurkę przez 30 sekund.</li>
	<li>Umieść probówkę o pojemności 2 ml w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty.</li>
	<li>Wyrzuć stary roztwór etanolu absolutnego i zastąp go 1 ml świeżego etanolu absolutnego i sonikuj przez 30 s.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.11 i 1.12 co najmniej cztery razy.</li>
	<li>Przechowuj NW w 1 ml bezwzględnego etanolu w temperaturze pokojowej, aż będą potrzebne.</li>
	<li>Zmierz stężenie żelaza, a tym samym NW, za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS). 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Jednak w przypadku długotrwałego przechowywania nie należy zwalniać NW z szablonu Al, dopóki nie będą potrzebne. Utrzymywanie uwolnionych NW wytrącających się w etanolu przez długi czas bez częstej sonikacji stworzy agregacje, które będą wymagały dłuższych czasów sonikacji, aby zostały oddzielone.</li>
</ol>
2. Powlekanie nanodrutów APTES
UWAGA: W tym protokole 100 μL roztworu APTES (gęstość 0,946 g/mL61) wystarcza do pokrycia 1,6 x 107 m2/g NWs. W przypadku zmiany proporcji lub masy nanomateriału należy odpowiednio dostosować objętość APTES.
<ol>
	<li>Przenieś NW z kroku 1.14 do szklanej probówki o pojemności 5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Aby zebrać resztki NW w probówce o pojemności 2 ml, należy dwukrotnie umyć pustą probówkę o pojemności 2 ml, dodając 1 ml bezwzględnego etanolu i przenieść ją do szklanej probówki o pojemności 5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Za pomocą pipety pobrać 100 μl APTES i dodać go bezpośrednio do roztworu NW.</li>
	<li>Wiruj szklaną probówkę o pojemności 5 ml przez 10 sekund.</li>
	<li>Wyreguluj szklaną probówkę o pojemności 5 ml na zacisku laboratoryjnego stojaka na retortę.</li>
	<li>Umieść połowę szklanej probówki o pojemności 5 ml w wodzie łaźni ultradźwiękowej i sonikuj przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjąć szklaną probówkę o pojemności 5 ml z łaźni ultradźwiękowej i dodać 400 μl wody dejonizowanej (DI), a następnie 20 μl 1 M NaOH (kataliza zasadowa). 
	UWAGA: Ważne jest, aby najpierw dodać wodę DI.</li>
	<li>Wyreguluj szklaną probówkę o pojemności 5 ml, jak wyjaśniono w krokach 2.5-2.6, i poddaj się sonikacji przez kolejną 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjmij szklaną probówkę o pojemności 5 ml z kąpieli ultradźwiękowej.</li>
	<li>Umieść magnes obok szklanej rurki na 5 minut, aby zebrać NW.</li>
	<li>Zastąp supernatant 1 ml świeżego absolutnego etanolu i poddaj sonikacji przez 10 s.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.10-2.11 cztery razy.</li>
	<li>Przenieś cały zawieszony etanol NW do nowej szklanej probówki o pojemności 5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: NW z powłoką APTES można przechowywać w szklanej probówce z etanolem, dopóki nie będą potrzebne. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
3. Biofunkcjonalizacja nanodrutów
<ol>
	<li>Aktywacja przeciwciał 
	UWAGA: Aby uzyskać około 3 x 104 części przeciwciała/NW, użyj 30 μl przeciwciała (1 mg/ml) na 0,1 mg żelaza.
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 2 ml rozpuścić 0,4 mg 3-3-dimetylo-aminopropylokarbodimidu (EDC) i 1,1 mg sulfo-N-hydroksysulfosukcynimidu (Sulfo-NHS) w 1 ml hydratu kwasu 2-N-morfolinoetanosulfonowego (MES) (pH 4,7). 
		UWAGA: Mieszanina EDC/sulfo-NHS powinna być świeża i przygotowana przed użyciem.</li>
		<li>Do nowej probówki o pojemności 2 ml dodać odpowiednio 30 μl przeciwciała anty-CD44 (1 mg/ml), 960 μl 0,1 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS, pH 7) i 10 μl mieszaniny EDC/sulfo-NHS (przygotowanej w kroku 3.1.1).</li>
		<li>Umieścić probówkę o pojemności 2 ml w wytrząsarce o pojemności 10 x g na 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie nanodrutów powlekanych APTES
	<ol>
		<li>Podczas 15-minutowej inkubacji w kroku 3.1.3 umyj NWs, umieszczając magnes obok rurki NWs pokrytej APTES (z kroku 2.13) na 2 minuty w celu zebrania NWs.</li>
		<li>Wyrzuć etanol i zastąp go 1 ml 0,1 M PBS (pH 7), a następnie poddaj sonikacji przez 10 s.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.1-3.2.2 cztery razy.</li>
		<li>Zbierz NWs, jak wyjaśniono w kroku 3.2.1, i wyrzuć 0,1 M PBS. Utrzymuj NW w tubie bez żadnego roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyłączenie przeciwciał
	<ol>
		<li>Przenieść cały aktywowany roztwór przeciwciała (przygotowany w kroku 3.1.3) do probówki NWs (przygotowanej w 3.2.4) i sonikować przez 10 s.</li>
		<li>Umieścić szklaną rurkę w rotatorze na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać NW za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodanie 1 ml 2% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zablokowania reakcji.</li>
		<li>Sprawdź antygenowość NW funkcjonalizowanych przeciwciałami, na przykład za pomocą testów immunoprecypitacji (IP) i western blot (WB). 
		UWAGA: Aby uzyskać lepsze wyniki, należy użyć biofunkcjonalizowanych NW w teście IP, WB lub teście biokompatybilności natychmiast po etapie blokowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test biokompatybilności
UWAGA: Do badania biokompatybilności NW można zastosować różne testy żywotności komórek i różne linie komórkowe. Stężenie NW użyte tutaj jest oparte na poprzedniej publikacji16. Wysiew komórek należy wykonać dzień przed biofunkcjonalizacją NW.
UWAGA: Wszystkie poniższe kroki powinny być wykonane pod szafką bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Na 96-dołkowej płytce wysiewaj dziewięć dołków z 4 x 104 komórek raka jelita grubego (linia komórkowa HCT116) zawieszonych w pożywce do hodowli komórkowych McCoya (100 μl / dołek) i umieść je w inkubatorze na noc w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2).</li>
	<li>Przemyć NW (z kroku 3.3.4) PBS, zbierając je za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i zastąpić stary roztwór 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Umyj NW (z kroku 4.2) podgrzaną pożywką McCoya, zbierając je za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i zastąp stary PBS 1 ml podgrzanej pożywki McCoya. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Zbieranie NW (z kroku 4.3) za pomocą magnesu, jak w kroku 3.2.1 i zastąp 1 ml podgrzanej pożywki McCoya 900 μl podgrzanej pożywki McCoya. Stężenie NW powinno wynosić 0,02 mg NW na ml.</li>
	<li>Przenieść 96-dołkową płytkę (z kroku 4.1) z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego wyrzuć stare pożywki z komórek i zastąp je 100 μl zawieszonych NW (przygotowanych w kroku 4.4).</li>
	<li>Wstrząsnąć płytką (przygotowaną w kroku 4.6) ręcznie, a następnie inkubować ją przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę (przygotowaną w kroku 4.7). Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego dodać 11 μl odczynnika do żywotności komórek (tabela materiałów) do każdej studzienki za pomocą pipety wielościennej.</li>
	<li>Potrząsać płytką wytrząsarką z prędkością 10 x g przez 10 s.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze.</li>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę (przygotowaną w kroku 4.10) z inkubatora. Odczytać płytkę w czytniku mikropłytek (tabela materiałów), mierząc absorbancję odczynnika żywotności komórek (wzbudzenie 540 nm, emisja 590 nm).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podobnie jak w przypadku każdej metody wytwarzania i powlekania nanomateriałów, wymagana jest wysoka jakość stosowanych rozwiązań. Roztwory uwalniające (1 M NaOH) i funkcjonalizujące (MES) mogą być wielokrotnie wykorzystywane. Jednak sprawdzenie ich wartości pH przed rozpoczęciem nowego procesu jest bardzo ważne. Na etapie uwalniania płukanie NW NaOH należy przeprowadzić co najmniej cztery razy. Im lepsze mycie, tym lepsza stabilność NW i tym mniej są one zagregowane. Warstwa tlenku zwiększa stabilność NW po zanurzeniu w etanolu lub wodzie63.
Średnica i długość NW uległy zmianie po pokryciu ich APTES i przeciwciałami. W tym przypadku średnica wzrosła z 41,5 nm do 70 nm, a długość zmniejszyła się z 2,5 μm do 1,6 μm, ze względu na etapy sonikacji, które łamią NW. Dlatego ważne jest, aby scharakteryzować morfologię NW po etapie biofunkcjonalizacji.
Przyłączenie przeciwciał do NW opiera się na oddziaływaniu kowalencyjnym między grupą aminową (na APTES) a grupą karboksylową (na przeciwciałie). Dlatego potwierdzenie obecności powłoki APTES jest ważnym krokiem, do którego zastosowaliśmy mapowanie EELS. Metoda powlekania jest bezpieczna i prosta. Nie potrzebuje wysokich temperatur ani długiego czasu inkubacji. Powłoka APTES działa również jako łącznik, aby umożliwić kowalencyjne przyłączanie innych przeciwciał lub białek, które mają grupę karboksylową.
W przypadku biofunkcjonalizacji NW za pomocą przeciwciała może to mieć wpływ na antygenowość miejsc wiązania przeciwciał po procesie biofunkcjonalizacji. Do zbadania tego problemu można użyć metody IP i WB. Zastosowanie metody biofunkcjonalizacji wymienionej w tym protokole pozwoli przeciwciałom związać się z NW o wysokiej antygenowości do określonego receptora komórkowego. Co więcej, biofunkcjonalizacja NW za pomocą przeciwciał dodała zdolność do celowania w komórki za pomocą interesującego receptora, CD44. Zostało to potwierdzone mikroskopią konfokalną. Chociaż biokompatybilność niepowlekanych NW była wysoka (>95%), dodanie powłoki APTES lub przeciwciał do NW zwiększyło ich biokompatybilność o 100%.
Co więcej, protokół powlekania i biofunkcjonalizacji jest wydajny, ekonomiczny i powtarzalny. Powinna ona mieć zastosowanie do każdego innego nanomateriału żelaza-tlenku żelaza, przy czym stężenie zarówno powłoki, jak i przyłączonych przeciwciał powinno być zoptymalizowane w oparciu o powierzchnię i masę nanomateriału. Protokół ten można bezpiecznie wykonać w warunkach otoczenia w laboratorium ogólnym. Biofunkcjonalizacja znacznie poprawiła biokompatybilność nanomateriałów i ich zdolność do celowania. Ogólnie rzecz biorąc, NW są niezwykle obiecującymi materiałami do zastosowań nanomedycznych (w tym zabiegów multimodalnych lub kombinatorycznych, wykrywania lub naprowadzania komórek oraz wykrywania biologicznego). W połączeniu z biofunkcjonalizacją, jak opisano tutaj, można osiągnąć specyficzne ukierunkowanie na komórki w celu zwiększenia precyzji i skuteczności.

Unikalną właściwością nanomateriałów magnetycznych jest ich zdolność do reagowania na pola magnetyczne1, co może być korzystnie wykorzystane do ich aktywacji na wiele sposobów, podczas gdy mogą być również monitorowane, na przykład, za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI). Stosując zmienne pole magnetyczne o wysokiej częstotliwości, mogą generować ciepło, które może wywołać hipertermię, zapewniając opcję terapeutyczną1. Innym podejściem jest obróbka fototermiczna, którą można przeprowadzić za pomocą lasera bliskiej podczerwieni (NIR)2,3.
Spośród dużej liczby nanomateriałów magnetycznych, tlenek żelaza zyskał największą uwagę w zastosowaniach biologicznych, takich jak separacja magnetyczna, hipertermia2,4, cell guidance5, drug delivery6,7,8, oraz jako środek kontrastowy w MRI9,10. Wynika to z ich wysokiej biokompatybilności11,12, duże namagnesowanie11,12, możliwość powlekania9,13,14,15, zdolność do przenoszenia narkotyków2,16, możliwość funkcjonalizacji za pomocą leków2,16 lub/i agentów celujących12,13,17,18, oraz zdolność do konwersji energii optycznej na ciepło2. Niedawno firma MagForce rozpoczęła badania kliniczne na pacjentach z rakiem przy użyciu nanocząsteczek tlenku żelaza do leczenia hipertermią19.
Ostatnio, magnetyczne nanoprzewody (NW) są coraz częściej wykorzystywane do zastosowań biomedycznych3,11,16,20,21,22. Mają podobne właściwości jak nanokulki magnetyczne, ale oferują anizotropowy kształt i bardzo duży moment magnetyczny, co umożliwia bardzo wydajne zdalne sterowanie za pomocą pola magnetycznego23,24, w tym uruchamianie o niskiej częstotliwości w celu wywołania efektów magnetomechanicznych25,26,27,28,29. W związku z tym, NW zostały wdrożone do różnych zastosowań biologicznych, takich jak izolacja egzosomów30 cell tracking21, leczenie raka3,11,16, drug delivery16,31,32, oraz jako środek kontrastowy MRI33.
Biofunkcjonalizowane nanomateriały magnetyczne o specyficznej zdolności do celowania w komórki mają ogromny potencjał do zastosowań biomedycznych i w medycynie precyzyjnej34,35. Aby przymocować te środki celujące, wymagana jest modyfikacja powierzchni nanomateriałów. Zazwyczaj potrzebują powłoki, która zapewnia grupę funkcyjną, która ułatwia mocowanie środków leczniczych. W literaturze istnieje duża liczba organicznych i nieorganicznych powłok nanomateriałów magnetycznych. W oparciu o grupę funkcyjną, która może zostać unieruchomiona przez nanomateriał, powłoki te można podzielić na cztery główne grupy: cząsteczki oparte na grupach kwasów karboksylowych, polimery, histydyna i cząsteczki oparte na grupach silanowych.
Cząsteczki oparte na grupach kwasów karboksylowych to jedna z metod modyfikacji powierzchni. Wykorzystuje wysokie powinowactwo 
Między ujemną grupą kwasu karboksylowego na powłoce a dodatnim ładunkiem na nanomateriałach magnetycznych36,37,38. Proces wiązania kwasu karboksylowego z powierzchnią metalu może obejmować wytwarzanie soli karboksylowych metali lub adhezję grupy karboksylowej do metalu. Jednak w przypadku wielosegmentowych NW, takich jak żelazo/złoto lub nikiel/złoto NW, które mają doskonałe właściwości do zastosowań biologicznych39,40, ten rodzaj powłoki nie może być łatwo nałożony. Wymaga dwóch różnych powłok w tym samym czasie: grup tiolowych do modyfikacji segmentów złota i grup karboksylowych do segmentów magnetycznych (żelazo lub nikiel)38. Niektóre przykłady cząsteczek opartych na grupach karboksylowych to hematoporfiryna, kwas pimelowy, kwas palmitynowy i kwas 3-[(2-aminoetylo)ditiono] propionowy (AEDP)38. Modyfikacja powierzchni nanomateriałów magnetycznych z wykorzystaniem polimerów ma pewne wyraźne zalety. Ze względu na dużą masę cząsteczkową polimerów zwiększa stabilność nanomateriału magnetycznego w roztworze38. Spowoduje to jednak znaczne zwiększenie rozmiaru nanomateriału38. Poliwinylopirolidon (PVP), polietylenoimina (PEI), kwas asparaginowy arginina-glicyna-D (RGD) i glikol polietylenowy (PEG) to tylko niektóre przykłady najczęściej stosowanych polimerów do modyfikacji powierzchni. Każdy z nich ma swoje własne funkcje i używa38. Trzecią metodą modyfikacji powierzchni jest zastosowanie powłoki histydyny. Histydyna jest białkiem z łańcuchem bocznym aminokwasu histydyny, które ma wysokie powinowactwo do ograniczonej liczby nanomateriałów magnetycznych, takich jak nikiel38. Może być stosowany w procesach oczyszczania białek38,41,42. Powłokę histydynową można również nakładać na wielosegmentowe NW, takie jak nikiel/złoto NWs38. Silanizacja powierzchni nanomateriału jest dobrze znanym procesem38,43,44. Opiera się na atomie krzemu połączonym z dowolną powierzchnią tlenku metalu za pomocą trzech pojedynczych wiązań, a jednocześnie ten atom krzemu wiąże się z grupą funkcyjną na końcu za pomocą łańcucha alkilowego38,43,44. Zaletą tej powłoki jest dostarczanie wolnych grup aminowych i ma zdolność powlekania zarówno materiałów magnetycznych, jak i niemagnetycznych38,45, takich jak odpowiednio nikiel i złoto. Dlatego stosowanie cząsteczek opartych na grupie soli fizjologicznej jest praktyczną drogą biofunkcjonalizacji wielosegmentowych NW. Przykładami cząsteczek opartych na grupach silanowych są (3-aminopropylo) trietoksysilan (APTES) i (3-aminopropylo)trimetoksysilan (APTMS)38,45.
Dodanie środka celującego do powłoki może odegrać znaczącą rolę zarówno w diagnostyce, jak i leczeniu chorych komórek, a jednocześnie zminimalizować skutki uboczne dla zdrowych tkanek46,47. Dodanie czynnika celującego na powierzchni nanomateriałów wzmacnia zarówno selektywne wiązanie komórek, jak i internalizację poprzez receptory endocytozy7. Bez tych ligandów docelowych nanomateriały oddziałują niespecyficznie z błonami komórkowymi, które wiążą się z mniejszą szybkością w porównaniu z nanomateriałami z ligandami48. Jednym z wyzwań związanych z celowaniem w tkanki nowotworowe jest ich charakterystyczne podobieństwo do zdrowych tkanek. W związku z tym powodzenie targetowania zależy głównie od określenia odpowiedniego liganda do użycia jako cel biologiczny49,50. Zastosowano różne czynniki celujące, aby skierować nanomateriały do komórek nowotworowych48,51 (np. CD44, ze względu na jego wysoką ekspresję w komórkach rakowych w porównaniu ze zdrowymi komórkami52,53,54,55).
Czynniki celujące można podzielić na trzy główne grupy, w zależności od komponentów, z których są zbudowane i ich złożoności: celowanie oparte na aptamerach, celowanie oparte na ligandach i celowanie oparte na przeciwciałach. Aptamery to krótkie, chemicznie syntetyzowane nici DNA lub oligonukleotydów RNA, które są złożone w dwu- i trójwymiarowe struktury, dzięki czemu są zdolne do celowania w określony antygen, najczęściej białka56. Targetowanie oparte na ligandach obejmuje peptydy i krótkie łańcuchy aminokwasów57. Celowanie oparte na przeciwciałach polega na użyciu całego przeciwciała lub fragmentów przeciwciała, takich jak zmienne fragmenty jednołańcuchowe lub fragmenty wiążące antygen51. Zastosowanie tej metody ma tę zaletę, że posiada dwa miejsca wiązania o wysokim powinowactwie wiązania do specyficznego antygenu docelowego, co zapewnia mu niezwykle wysoką selektywność58. Miejsca wiązania są analogiczne do zamka, a antygen do key58.
W tej pracy, użyte NW zostały wytworzone przez elektroosadzanie na membranach z tlenku glinu, metoda opisana szczegółowo w poprzedniej publikacji59. Nacisk kładziony jest tutaj na uwolnienie tych NW tlenku żelaza (rdzeń-powłoka) z błon i biofunkcjonalizacja ich specyficznymi przeciwciałami, aby zapewnić zdolność celowania. Przeciwciała nie mogą wiązać się bezpośrednio z NW tlenku żelaza i żelaza i wymagają łącznika. Powlekanie NW APTES zapewnia wolne grupy aminowe, umożliwiając kowalencyjne przyłączanie przez grupę karboksylową na przeciwciałach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Zaletą powłoki APTES jest jej zdolność do pracy zarówno z materiałami magnetycznymi21, jak i niemagnetycznymi60, takimi jak żelazo/złoto lub nikiel/złoto NWs45. Wszystkie etapy powlekania i biofunkcjonalizacji wyjaśnione w tym protokole można ogólnie wykorzystać z dowolnym nanomateriałem żelaza/tlenku żelaza. Jako przykład użyto tutaj NW żelaza/tlenku żelaza. Wyniki pokazują, że funkcjonalizowane przeciwciałami NW mają wysoką antygenowość w stosunku do specyficznych receptorów powierzchniowych komórek, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań. Przykłady obejmują separację komórek, dostarczanie leków, leczenie specyficznymi komórkami nowotworowymi za pomocą zabiegów fototermicznych i/lub magnetomechanicznych.

<table><tbody><tr><td>Probówka 2 ml (mikrowirówka zatrzaskowa)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2-N-Morfolino EtaneKwas sulfonowy hydrat 99% (MES)</td><td>Thermscientific AC172590250</td><td></td><td>Stężenie 0,1 m i pH 4,7</td></tr><tr><td>3-3-dimetylo-aminopropylokarbodimid (EDC)</td><td>Thermofisher</td><td>PG82079</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-tri-etoksy-silan (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>919302</tr><tr><td>Szklana probówka 5 ml</td><td>Fisherscientific</td><td>03-339-22C</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa (płaska denna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>550990</td><td>Klon 515, stężenie 1 mg / ml</td></tr><tr><td>APTES ((3-aminopropylo)trietoksysilan), 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919-30-2</td><td>Stężenie 99%</td></tr> <tr><td>Test BCA (Pierce Zestaw do oznaczania białek BCA)</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Stężenie 35%</td></tr><tr><td>Inkubator komórkowy</td><td>Thermofisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik żywotności komórek</td><td>AlamarBlue,Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Komórki raka jelita grubego - linia komórkowa HCT116</td><td>ATCC</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Młotek</td><td></td><td></td> do drewna liściastego <td>Można użyć dowolnego narzędzia młotkowego, nie ma konkretnej marki.</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)</td><td>Perkin Elmer</td><td>ELAN 9000 ICP-MS</td><td>Używane oprogramowanie to "Sesja kontroli przyrządu Elan"</td></tr><tr><td>Laboratoryjny stojak retortowy z zaciskiem</td><td>RVFM</td><td>13-0140</td><td>Służy do obsługi szklanej rurki o pojemności 5 ml w kąpieli sonikatora.</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny (DynaMag-2 Magnet)</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A Medium 1x</td> Czytnik mikropłytek <td>Gibco</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>(spektrofotometr absorbancji Bio-Rad xMark)</td><td>Oprogramowanie Bio-Rad</td><td>1681150</td><td>Microplate Manager 6 (#168-9520)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10x</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>Stężenie 0,1 M (bez wapnia, bez magnezu)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td>Stężenie 0,01 M (bez różniczkowania, bez magnezu)</td></tr> <tr><td>Wytrząsarka płytkowa (Microplate Genie)</td><td>Przemysł naukowy (Genie)</td><td>SI-0400</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki jednoostrzowe</td><td>Polysciences</td><td>08410-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorek sodu (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Stężenie 1 M, pH 13</td></tr><tr><td>Sulfo-N-hydroksysulfosukcynimid (sulfo-NHS)</td><td>Thermofisher</td><td>106627-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Obracacz rur</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do rur (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-400-204</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa (2510)</td><td>Branson</td><td>2489502</td><td></td></tr></tbody></table>

biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Nanomateriały magnetyczne cieszą się dużym zainteresowaniem w różnych zastosowaniach biomedycznych. Biofunkcjonalizacja tych nanomateriałów za pomocą specyficznych środków celujących jest kluczowym aspektem zwiększającym ich skuteczność w diagnostyce i leczeniu przy jednoczesnej minimalizacji skutków ubocznych. Zaletą nanomateriałów magnetycznych w porównaniu z nanomateriałami niemagnetycznymi jest ich zdolność do reagowania na pola magnetyczne w sposób bezkontaktowy i na duże odległości. Pozwala to na ich prowadzenie lub gromadzenie, a także na ich monitorowanie. Niedawno opracowano nanodruty magnetyczne (NW) o unikalnych właściwościach do zastosowań biomedycznych. Duży moment magnetyczny tych NW umożliwia efektywniejsze zdalne sterowanie ich ruchem za pomocą pola magnetycznego. Zostało to wykorzystane z dużym powodzeniem w leczeniu raka, dostarczaniu leków, śledzeniu komórek, różnicowaniu komórek macierzystych lub obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego. Ponadto wytwarzanie NW metodą osadzania elektrochemicznego wspomaganego matrycą zapewnia wszechstronną metodę ze ścisłą kontrolą właściwości NW. Szczególnie NW żelaza i tlenek żelaza (rdzeń-powłoka) NW nadają się do zastosowań biomedycznych, ze względu na ich wysokie namagnesowanie i niską toksyczność.
W tej pracy przedstawiamy metodę biofunkcjonalizacji żelaza/tlenku żelaza NW za pomocą specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko specyficznemu markerowi powierzchni komórki, który ulega nadekspresji w dużej liczbie komórek nowotworowych. Ponieważ metoda wykorzystuje właściwości powierzchni tlenku żelaza, ma również zastosowanie do superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza. NW są najpierw powlekane 3-aminopropylo-tri-etoksy-silanem (APTES) działającym jako łącznik, do którego przeciwciała są kowalencyjnie przyłączane. Powłoka APTES i biofunkcjonalizacja przeciwciał są udowodnione za pomocą spektroskopii strat energii elektronów (EELS) i pomiarów potencjału zeta. Ponadto antygenowość przeciwciał na NW jest badana za pomocą immunoprecypitacji i western blot. Specyficzne ukierunkowanie biofunkcjonalizowanych NW i ich biokompatybilność są badane za pomocą mikroskopii konfokalnej i testu żywotności komórek.

Ważne jest, aby pociąć aluminiowe (Al) krążki (Ryc. 2A) na małe kawałki (Ryc. 2B>, aby zmieściły się w używanej probówce. Po dodaniu 1 M NaOH do kawałków Al powinna natychmiast rozpocząć się reakcja, objawiająca się powstawaniem pęcherzyków. Jeśli w ciągu 1 min nie zajdzie żadna reakcja lub jeśli reakcja przebiega bardzo gwałtownie i roztwór staje się całkowicie mętny z białą chmurą, należy natychmiast usunąć zużyty roztwór NaOH i zastąpić go świeżym roztworem. Należy sprawdzić wartość pH roztworu NaOH; powinno ona wynosić pH&gt;12. Gdy NW zostaną uwolnione z kawałków Al w ciągu pierwszych 30 min w NaOH, NW (czarne skupiska, Ryc. 3A) będą unosić się w roztworze NaOH. W ostatnim etapie uwalniania NW roztwór powinien być jednorodny. Nie powinny występować żadne skupiska NW (Ryc. 3B). Jeśli NW zostały zebrane magnesem przez 3 min, roztwór powinien być klarowny, a osad z NW powinien być czarny (Ryc. 3C). Jeśli osad był szary, należy wyrzucić probówkę i rozpocząć proces ponownie z nową próbką Al.
Podczas procesu uwalniania nanowłókna (NWs) pokrywają się naturalną warstwą tlenku żelaza o grubości około 5 nm, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami11,16,20. Warstwa tlenku ta ma istotny wpływ na biokompatybilność16, funkcjonalizację16,18 oraz właściwości magnetyczne20 NWs. Jednakże pozostawienie NWs w matrycy (tj. nieuwalnianie ich) do momentu potrzeby zapobiegnie oddziaływaniu na nie czynników środowiskowych. Średnica i długość NWs po procesie uwalniania wynosiły odpowiednio 2,5 µm oraz 41,5 nm. Masę pojedynczego NW można obliczyć zgodnie z opisem w Tabeli 1, co zostało potwierdzone za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS). W tym przypadku każdy dysk z tlenku glinu zawierał około 0,3 mg żelaza.
Aby zmniejszyć agregację nanodrutów (NWs) po ich uwolnieniu i umożliwić dalszą funkcjonalizację, NWs zostały pokryte APTES. Powłoka ta dostarcza wolnych grup aminowych i posiada zdolność do pokrywania zarówno materiałów magnetycznych, jak i niemagnetycznych39,45, co czyni ją odpowiednią do pokrywania wielosegmentowych NWs, takich jak nanodruty żelazo/złoto. Podczas pokrywania nanodrutów ważne jest skupienie się na dwóch kwestiach. Po pierwsze, należy obliczyć potrzebną objętość cząsteczek APTES62 na podstawie powierzchni właściwej i masy NWs. Obliczenia te przedstawiono w Tabeli 2. Po drugie, nanodruty należy utrzymywać w ciągłym ruchu, aby zapobiec ich aglomeracji oraz blokowaniu części powierzchni NWs przed nałożeniem powłoki APTES. Przykładowo, w niniejszym protokole nanodruty inkubowano odpowiednio w kąpieli ultradźwiękowej oraz na rotatorze podczas pokrywania APTES i funkcjonalizacji przeciwciałami. Każda cząsteczka APTES zawiera atom krzemu i terminalną funkcjonalną grupę aminową21. W związku z tym do potwierdzenia obecności powłoki APTES można wykorzystać mapy spektroskopii strat energii elektronów (EELS), wykazując atomy krzemu (kolor różowy) na powierzchni NWs (Rysunek 4A). W przeciwieństwie do nich, niepokryte NWs wykazują atomy żelaza w kolorze ciemnoniebieskim (Rysunek 4B) oraz mieszankę atomów żelaza i tlenu w kolorze jasnoniebieskim (Rysunek 4B). Odpowiadające im mapowanie EELS niepokrytych NWs (Rysunek 4C,4D) wykazuje wyższą intensywność żelaza w stosunku do tlenu w centrum (Rysunek 4C) niż na powierzchni (Rysunek 4D), co wskazuje na strukturę żelazo-tlenek żelaza (rdzeń-powłoka). Na podstawie mapowania EELS (Rysunek 4C,4D) zidentyfikowano, że warstwa tlenku żelaza na NWs to w większym stopniu Fe3O4 niż Fe2O3, co jest zgodne z poprzednią publikacją20.
Antygeniczność przyłączonych przeciwciał można potwierdzić za pomocą analiz IP i WB, w których prążek jest widoczny w próbce dodatniej, natomiast nie występuje w kontrolach ujemnych (Rysunek 5). Należy pamiętać, że aby zaobserwować wyraźny prążek, nie należy używać mniej niż 0,1 mg NWs/10 x 106 komórki. Metoda BCA (Tabela materiałów) w połączeniu z niektórymi obliczeniami przedstawionymi w Tabela 3 zastosowano do określenia liczby przeciwciał na NW.
Ponadto pomiar potencjału zeta został wykorzystany do wyjaśnienia funkcjonalizacji powierzchni. Końcowa grupa aminowa w APTES zmniejszyła ładunek ujemny niepowlekanych NW, co przedstawiono na Rysunku 6. NW funkcjonalizowane przeciwciałami również wykazały zmianę ładunku w porównaniu do NW powlekanych APTES (Rysunek 6). Wszystkie pomiary potencjału zeta przeprowadzono przy pH 7.
Specyficzne celowanie komórkowe nanowłókien funkcjonalizowanych przeciwciałami można potwierdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rysunek 7). Biokompatybilność każdego nowego nanomateriału powinna zostać przetestowana przed rozpoczęciem jakiejkolwiek aplikacji. W związku z tym zastosowano test żywotności komórek, który potwierdził, że nanowłókna niepowlekane, powlekane APTES oraz powlekane przeciwciałami są biokompatybilne nawet przy wysokim stężeniu (Rysunek 8).
<img alt="Schemat procesu funkcjonalizacji przeciwciałami; od Fe-NW do APTES-NW, aktywacja przeciwciał, wiązanie NW." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający metodę powlekania i biofunkcjonalizacji nanodrutów. (A) Powlekanie żelaznych NW za pomocą APTES. (B) Aktywacja przeciwciał z użyciem EDC + Sulfo-NHS, aby w rezultacie otrzymać (C) nanodrut funkcjonalizowany przeciwciałami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyrównanie nanodrutów Al, schemat; mikroskopia, struktura nanomateriału, skala 1 cm, badanie procesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Aluminiowa tarcza z osadzonym żelazem. (A) Tarcza aluminiowa przed wycięciem. (B) Czerwone linie wskazują miejsca cięcia tarczy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Agregacja nanowłókien; A) aglomeraty w roztworze, B) zawiesina, C) proces separacji indukowanej magnesem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Etapy uwalniania nanowłókien. (A) Aglomeraty nanowłókien unoszące się w roztworze NaOH. Zdjęcie wykonano 10 min po dodaniu NaOH i po usunięciu membrany Al. (B) Nanowłókna w zawiesinie w etanolu. Zdjęcie wykonano w ostatnim etapie uwalniania, bezpośrednio po sonikacji. (C) Czarny osad nanowłókien zebrany za pomocą magnesu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych spektroskopowych; nanomateriały; mapowanie pierwiastków tlenu/żelaza; mikroskopia, wykres widma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Mapa spektroskopii strat energii elektronów (EELS). (A) Nanodrut powlekany APTES (APTES-NW). Kolory niebieski i różowy reprezentują odpowiednio atomy żelaza i krzemu. (B) Nanodrut niepowlekany (NW). Kolory ciemnoniebieski i jasnoniebieski reprezentują odpowiednio mapowanie żelaza oraz mieszaniny żelaza i tlenu. Odpowiadające im mapowanie EELS (C) rdzenia i (D) otoczki niepowlekanych NW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza lizatu komórkowego; NW CD44, NW izotypowe, porównanie wizualne; wykres wyników eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
Rysunek 5: Potwierdzenie funkcjonalizacji i aktywności nanowires sprzężonych z przeciwciałami. Antygieniczność CD44-NWs została potwierdzona za pomocą immunoprecypitacji (IP) i western blot (WB). +Ve: oznacza kontrolę dodatnią (pełny lizat komórkowy). -Ve: oznacza kontrolę ujemną (tylko niepowlekane NW). – CD44 cells: oznacza komórki, które nie wykazują ekspresji antygenu CD44; + CD44 cells: oznacza komórki raka jelita grubego wykazujące ekspresję antygenu CD44. Jest to reprezentatywny blot z n = 3 niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący potencjał zeta NWs, APTES-NWs oraz Antibody-NWs w analizie ładunku powierzchniowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wartości potencjału zeta dla NWs, APTES-NWs i przeciwciała.Słupki reprezentują średnią ± błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna nanodrutów CD44 i izotypowych w komórkach, porównanie rozmiarów w skali 10 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Obrazy z mikroskopii konfokalnej wykazują specyficzne celowanie. Przedstawiono przyłączanie się CD44-NWs (A i C), podczas gdy Isotype-NWs (kontrola negatywna) nie przyłączyły się (B i D). Kolory czerwony, niebieski i zielony reprezentują odpowiednio błonę komórkową, jądro oraz skupiska CD44-NWs. Zdjęcia A i B są obrazami w polu jasnym odpowiednio dla C i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent przeżywalności komórek dla grup Antibody-NWs, APTES-NWs, NWs i No NWs." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Badanie przeżywalności komórek raka jelita grubego (HCT116) inkubowanych z różnymi formulacjami nanodrutów. Komórki poddano działaniu NWs po 24h inkubacji, a następnie inkubowano przez kolejne 24h z NWs. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Słupki reprezentują średnią ± błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Wartość</td>
			<td>Jednostka</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość nanodrutów Fe (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promień (średnica/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gęstość Fe (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>g/cm3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Objętość nanodrutu Fe (V) = π r^2h</td>
			<td>2,30E-15</td>
			<td>cm3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 masa Fe NW = V x D</td>
			<td>1,80E-08</td>
			<td>µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 powierzchnia Fe NW = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2,76E-01</td>
			<td>µm2</td>
			<td>2,8E+05</td>
			<td>nm2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Obliczanie masy nanodrutów żelaznych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Wartość</td>
			<td>Jednostka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gęstość APTES/100 µL*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa (MW) APTES</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba moli APTES = masa/MW</td>
			<td>4.29E-03</td>
			<td>mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cząsteczek APTES/100 µL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>cząsteczek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmiar APTES ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powierzchnia APTES</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>nm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powierzchnia NW****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>nm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba NW w 0.3 mg NW ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>NW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cząsteczek APTES potrzebna do utworzenia jednej warstwy wokół NW</td>
			<td>1.38E+06</td>
			<td>cząsteczek APTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cząsteczek APTES potrzebna dla 0.3 mg NW</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>cząsteczek APTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Numer referencyjny 61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">** Liczba cząsteczek = Liczba moli * liczba Avogadra (6E+23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">***Numer referencyjny 62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">****Z Tabeli 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Obliczanie liczby cząsteczek APTES wymaganych do powlekania NWs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>przeciwciało IgG w kształcie litery Y</td>
			<td>NW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa jednego przeciwciała</td>
			<td>2,3E-13 µg</td>
			<td>1,8E-08 µg*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powierzchnia właściwa jednego przeciwciała</td>
			<td>23 nm2</td>
			<td>2,6E+05 nm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na podstawie analizy BCA</td>
			<td colspan="2">0,3 mg na 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cząsteczek przeciwciał i NW w 0,3 mg przeciwciała na mg NW</td>
			<td colspan="2">~1E+15 przeciwciał na ~5,6E+10 NWs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba cząsteczek przeciwciał na NW</td>
			<td colspan="2">~2E+04 przeciwciał na 1 NW***</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Obliczone na podstawie tabeli 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Liczbę przeciwciał w 0,3 mg obliczono, dzieląc liczbę przeciwciał uzyskaną z testu z BSA (0,3 mg) przez średnią masę cząsteczkową przeciwciał IgG w kształcie litery Y (180 kDa = 3E-16 mg).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Biorąc pod uwagę powierzchnię jednej cząsteczki przeciwciał IgG w kształcie litery Y (~23 nm²) oraz powierzchnię jednego nanodrutu (NW) (~2,6E+05 nm²), około 1E+04 przeciwciał byłoby wystarczające do utworzenia monowarstwy na NW. W naszym przypadku gęstość przeciwciał była dwukrotnie większa od przewidywanej ilości. Może to być związane z powłoką z APTES, która zapewnia więcej grup funkcyjnych, co umożliwia wysoki stopień przyłączenia przeciwciał. Taki stan zapewnia pełne pokrycie NW przeciwciałami, a prawdopodobieństwo związania przeciwciała z antygenem powierzchniowym komórki, niezależnie od orientacji NW, będzie wysokie. Jednakże, jeśli gęstość przeciwciał będzie niższa od przewidywanej liczby (1E+04 cząsteczek przeciwciał), szansa na związanie komórki z NW będzie mniejsza.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Obliczanie liczby przeciwciał na nanodrucie.

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

Kluczową cechą tego protokołu jest to, że może być stosowany do szerokiej gamy nanomateriałów żelazo-tlenek żelaza. Może być również stosowany na wielosegmentowych nanomateriałach, takich jak nanodruty żelazo-złoto. Protokół ten można bezpiecznie wykonać w każdym standardowym laboratorium biologicznym.Głównymi zaletami tej techniki biofunkcjonalizacji jest możliwość wytworzenia specjalnie ukierunkowanego nanomateriału opartego na silnym wiązaniu kowalencyjnym między nanodrutem a przeciwciałami. Zacznij od pocięcia aluminiowych krążków na małe kawałki za pomocą jednoostrzowego ostrza i małego młotka. Umieść pocięte kawałki w dwumililitrowej tubie i napełnij ją jednym mililitrem jednomolowego wodorotlenku sodu, upewniając się, że wszystkie kawałki aluminium są zakryte.Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej w dygestorii chemicznej na 30 minut. Po inkubacji usuń kawałki aluminium za pomocą pęsety i trzymaj uwolnione nanodruty w wodorotlenku sodu przez dodatkowe 30 minut. Umieść probówkę w magnetycznym suchym stojaku, odczekaj dwie minuty i zastąp roztwór świeżym wodorotlenkiem sodu.Sonikuj dwumililitrową rurkę z nanodrutami przez 30 sekund i pozostaw ją na godzinę w dygestoriach chemicznych. Powtórz ten krok co najmniej cztery razy. Po zakończeniu umieść dwumililitrową rurkę w stojaku magnetycznym, wyrzuć wodorotlenek sodu i zastąp go jednym mililitrem absolutnego etanolu.Sonikuj nanodruty przez 30 sekund, umieść rurkę w stojaku magnetycznym i wymień etanol. Powtórz mycie etanolem co najmniej cztery razy. Po umyciu nanodrutów przenieś je do pięciomililitrowej szklanej rurki za pomocą jednomililitrowej pipety.Dodaj 100 mikrolitrów APTES do roztworu nanodrutu i wiruj szklaną rurkę przez 20 sekund. Umieść probówkę w łaźni ultradźwiękowej i poddawaj ją sonikacji przez godzinę. Następnie wyjmij rurkę z kąpieli i dodaj 400 mikrolitrów wody dejonizowanej i 20 mikrolitrów jednomolowego wodorotlenku sodu.Powtórz jednogodzinną sonikację. Po wyjęciu szklanej rurki z kąpieli ultradźwiękowej umieść ją obok magnesu, aby zebrać nanodruty. Zastąp supernatant jednym mililitrem świeżego absolutnego etanolu i poddaj probówkę sonikacji przez 10 sekund.Powtórz płukanie etanolem i sonikację dwukrotnie. Rozpuść 0,4 miligrama EDC i 1,1 miligrama Sulfo-NHS i jeden mililitr MES w dwumililitrowej probówce. W kolejnej dwumililitrowej probówce dodaj 960 mikrolitrów 0,1-molowego PBS i dodaj do niej 30 mikrolitrów przeciwciała anty-CD44.Następnie do tej probówki dodaj 10 mikrolitrów wcześniej przygotowanej mieszaniny EDC/Sulfo-NHS. Umieść probówkę z przeciwciałem w shakerze i potrząsaj nią 10 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie umieść magnes obok rurki z nanodrutami pokrytymi APTES na dwie minuty, wyrzuć etanol i zastąp go PBS.Sonikuj nanodruty przez 10 sekund. Po ostatnim przemyciu PBS zebrać nanodruty i przenieść aktywowany roztwór przeciwciała do rurki z nanodrutami. Następnie wykonuj sonikację przez 10 sekund.Wymień rurkę w rotatorze na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zbierz nanodruty za pomocą magnesu i wyrzuć supernatant. Dodaj jeden mililitr 2% BSA i inkubuj probówkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zablokować reakcję.Spektroskopia strat energii elektronów lub mapy EELS mogą być wykorzystane do wizualizacji atomów krzemu na powierzchni nanodrutów i potwierdzenia obecności powłoki APTES. Na niepowlekanych nanodrutach atomy żelaza wydają się ciemnoniebieskie, a atomy zmieszane żelaza i tlenu są jasnoniebieskie. Odpowiednie mapowanie EELS niepowlekanych nanodrutów pokazuje większą intensywność żelaza w porównaniu z tlenem w środku niż na powierzchni, co wskazuje na strukturę żelaza-tlenku żelaza.Mapowanie wykazało, że warstwa tlenku żelaza składa się z większej ilości tlenku żelaza(II, III) niż tlenku żelaza(III). Antygenowość przyłączonych przeciwciał potwierdzono za pomocą testów immunoprecypitacji i western blot. Test BCA wykorzystano do ilościowego określenia liczby przeciwciał na nanodrutach.Pomiar potencjału zeta wykorzystano do wyjaśnienia funkcjonalizacji powierzchni. Końcowa grupa aminowa na APTES zmniejszyła ładunek ujemny w porównaniu z niepowlekanymi nanodrutami. Funkcjonalizacja przeciwciał jeszcze bardziej zmniejszyła ładunek.Specyficzne ukierunkowanie nanodrutów funkcjonalizowanych przeciwciałem na komórki potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej. Rysunki A i B przedstawiają obrazy mikroskopowe w jasnym polu odpowiednio próbki C i D. Kolor czerwony odpowiada obrazowi błony komórkowej, niebieski reprezentuje jądro, a zielone klastry reprezentują obecność dołączonych, ukierunkowanych nanodrutów CD44.Ponadto test żywotności komórek wykorzystano do sprawdzenia, czy niepowlekane, powlekane APTES i powlekane przeciwciałami nanodruty są biokompatybilne. W powłoce procesowej APTES bardzo ważne jest, aby dodać wodę dejonizowaną przed roztworem wodorotlenku sodu, aby wzmocnić wiązanie między cząsteczką APTES a nanodrutami. Ponadto podczas procesu biofunkcjonalizacji konieczne jest kilkukrotne przemycie nanodrutu buforem PBS, aby wzmocnić wiązanie kowalencyjne między przeciwciałem a nanodrutami.

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia magnetycznej bakteryjnej nanocelulozy (BNC) do zastosowań w rekonstrukcji uszkodzonych naczyń krwionośnych. BNC został zsyntetyzowany przez szczep G. xylinus. Z drugiej strony, namagnesowanie BNC zostało zrealizowane poprzez wytrącanie in situ jonów żelazawychFe2+ i Fe3+ wewnątrz siatki BNC.

Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ta praca opisuje protokoły przygotowania nanocząstek magnetycznych, ich powlekania SiO2, następnie funkcjonalizacji aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugacji z deferoksaminą przy użyciu ugrupowania sukcynylu jako łącznika. Szczegółowo opisano również szczegółowy opis charakterystyki strukturalnej i test wychwytywania bakterii z użyciem Y. enterocolitica dla wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu.

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Ta praca przedstawia oddolne podejście do inżynierii lokalnych sił magnetycznych do kontroli organizacji neuronów. Komórki podobne do neuronów załadowane nanocząstkami magnetycznymi (MNP) są powlekane na wierzchu i kontrolowane przez platformę o mikrowzorze z prostopadłym namagnesowaniem. Opisano również charakterystykę magnetyczną, wychwyt komórkowy MNP, żywotność komórek i analizę statystyczną.

Wytwarzanie platform magnetycznych do organizacji połączonych neuronów w skali mikronowej

Informujemy o jednogarnkowej syntezie hydrotermalnej klastrów ferrytu manganu (MFC), która oferuje niezależną kontrolę nad wymiarami i składem materiału. Separacja magnetyczna umożliwia szybkie oczyszczanie, a funkcjonalizacja powierzchni za pomocą sulfonowanych polimerów zapewnia, że materiały nie agregują się w biologicznie istotnym środowisku. Uzyskane w ten sposób produkty są dobrze przygotowane do zastosowań biomedycznych.

Stabilne zawiesiny wodne klastrów ferrytu manganu o przestrajalnym wymiarze i składzie w nanoskali

Poznaj protokół biofunkcjonalizacji nanodrutów żelaznych przeciwciałami do celowanego namierzania komórek nowotworowych. Metoda obejmuje powlekanie APTES, aktywację EDC/Sulfo-NHS i charakteryzację spektroskopiową.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Przeglądaj więcej filmów