Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych
16 lipca 2020
W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.
Kluczową cechą tego protokołu jest to, że może być stosowany do szerokiej gamy nanomateriałów żelazo-tlenek żelaza. Może być również stosowany na wielosegmentowych nanomateriałach, takich jak nanodruty żelazo-złoto. Protokół ten można bezpiecznie wykonać w każdym standardowym laboratorium biologicznym.
Głównymi zaletami tej techniki biofunkcjonalizacji jest możliwość wytworzenia specjalnie ukierunkowanego nanomateriału opartego na silnym wiązaniu kowalencyjnym między nanodrutem a przeciwciałami. Zacznij od pocięcia aluminiowych krążków na małe kawałki za pomocą jednoostrzowego ostrza i małego młotka. Umieść pocięte kawałki w dwumililitrowej tubie i napełnij ją jednym mililitrem jednomolowego wodorotlenku sodu, upewniając się, że wszystkie kawałki aluminium są zakryte.
Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej w dygestorii chemicznej na 30 minut. Po inkubacji usuń kawałki aluminium za pomocą pęsety i trzymaj uwolnione nanodruty w wodorotlenku sodu przez dodatkowe 30 minut. Umieść probówkę w magnetycznym suchym stojaku, odczekaj dwie minuty i zastąp roztwór świeżym wodorotlenkiem sodu.
Sonikuj dwumililitrową rurkę z nanodrutami przez 30 sekund i pozostaw ją na godzinę w dygestoriach chemicznych. Powtórz ten krok co najmniej cztery razy. Po zakończeniu umieść dwumililitrową rurkę w stojaku magnetycznym, wyrzuć wodorotlenek sodu i zastąp go jednym mililitrem absolutnego etanolu.
Sonikuj nanodruty przez 30 sekund, umieść rurkę w stojaku magnetycznym i wymień etanol. Powtórz mycie etanolem co najmniej cztery razy. Po umyciu nanodrutów przenieś je do pięciomililitrowej szklanej rurki za pomocą jednomililitrowej pipety.
Dodaj 100 mikrolitrów APTES do roztworu nanodrutu i wiruj szklaną rurkę przez 20 sekund. Umieść probówkę w łaźni ultradźwiękowej i poddawaj ją sonikacji przez godzinę. Następnie wyjmij rurkę z kąpieli i dodaj 400 mikrolitrów wody dejonizowanej i 20 mikrolitrów jednomolowego wodorotlenku sodu.
Powtórz jednogodzinną sonikację. Po wyjęciu szklanej rurki z kąpieli ultradźwiękowej umieść ją obok magnesu, aby zebrać nanodruty. Zastąp supernatant jednym mililitrem świeżego absolutnego etanolu i poddaj probówkę sonikacji przez 10 sekund.
Powtórz płukanie etanolem i sonikację dwukrotnie. Rozpuść 0,4 miligrama EDC i 1,1 miligrama Sulfo-NHS i jeden mililitr MES w dwumililitrowej probówce. W kolejnej dwumililitrowej probówce dodaj 960 mikrolitrów 0,1-molowego PBS i dodaj do niej 30 mikrolitrów przeciwciała anty-CD44.
Następnie do tej probówki dodaj 10 mikrolitrów wcześniej przygotowanej mieszaniny EDC/Sulfo-NHS. Umieść probówkę z przeciwciałem w shakerze i potrząsaj nią 10 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie umieść magnes obok rurki z nanodrutami pokrytymi APTES na dwie minuty, wyrzuć etanol i zastąp go PBS.
Sonikuj nanodruty przez 10 sekund. Po ostatnim przemyciu PBS zebrać nanodruty i przenieść aktywowany roztwór przeciwciała do rurki z nanodrutami. Następnie wykonuj sonikację przez 10 sekund.
Wymień rurkę w rotatorze na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zbierz nanodruty za pomocą magnesu i wyrzuć supernatant. Dodaj jeden mililitr 2% BSA i inkubuj probówkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zablokować reakcję.
Spektroskopia strat energii elektronów lub mapy EELS mogą być wykorzystane do wizualizacji atomów krzemu na powierzchni nanodrutów i potwierdzenia obecności powłoki APTES. Na niepowlekanych nanodrutach atomy żelaza wydają się ciemnoniebieskie, a atomy zmieszane żelaza i tlenu są jasnoniebieskie. Odpowiednie mapowanie EELS niepowlekanych nanodrutów pokazuje większą intensywność żelaza w porównaniu z tlenem w środku niż na powierzchni, co wskazuje na strukturę żelaza-tlenku żelaza.
Mapowanie wykazało, że warstwa tlenku żelaza składa się z większej ilości tlenku żelaza(II, III) niż tlenku żelaza(III). Antygenowość przyłączonych przeciwciał potwierdzono za pomocą testów immunoprecypitacji i western blot. Test BCA wykorzystano do ilościowego określenia liczby przeciwciał na nanodrutach.
Pomiar potencjału zeta wykorzystano do wyjaśnienia funkcjonalizacji powierzchni. Końcowa grupa aminowa na APTES zmniejszyła ładunek ujemny w porównaniu z niepowlekanymi nanodrutami. Funkcjonalizacja przeciwciał jeszcze bardziej zmniejszyła ładunek.
Specyficzne ukierunkowanie nanodrutów funkcjonalizowanych przeciwciałem na komórki potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej. Rysunki A i B przedstawiają obrazy mikroskopowe w jasnym polu odpowiednio próbki C i D. Kolor czerwony odpowiada obrazowi błony komórkowej, niebieski reprezentuje jądro, a zielone klastry reprezentują obecność dołączonych, ukierunkowanych nanodrutów CD44.
Ponadto test żywotności komórek wykorzystano do sprawdzenia, czy niepowlekane, powlekane APTES i powlekane przeciwciałami nanodruty są biokompatybilne. W powłoce procesowej APTES bardzo ważne jest, aby dodać wodę dejonizowaną przed roztworem wodorotlenku sodu, aby wzmocnić wiązanie między cząsteczką APTES a nanodrutami. Ponadto podczas procesu biofunkcjonalizacji konieczne jest kilkukrotne przemycie nanodrutu buforem PBS, aby wzmocnić wiązanie kowalencyjne między przeciwciałem a nanodrutami.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów przeciwciałami w celu uzyskania specyficznego celowania w komórki, w szczególności z wykorzystaniem nanodrutów żelaznych do targetowania komórek nowotworowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanotechnologia
- Biomateriały
- Biologia komórki
Wstęp
- Nanomateriały magnetyczne wykazują potencjał w zastosowaniach w ukierunkowanym dostarczaniu leków.
- Biofunkcjonalizacja zwiększa specyficzność nanomateriałów względem konkretnych typów komórek.
- Nanodruty żelazne mogą być modyfikowane w celu poprawy ich zdolności do celowania.
- Zrozumienie oddziaływań między nanomateriałami a systemami biologicznymi jest kluczowe dla ich zastosowania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu biofunkcjonalizacji nanodrutów żelaznych.
- Wykazanie skuteczności nanodrutów funkcjonalizowanych przeciwciałami w celowaniu w komórki nowotworowe.
- Ocena biokompatybilności zmodyfikowanych nanodrutów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie nanodrutów żelaznych za pomocą procesów chemicznych.
- Powlekanie nanodrutów APTES w celu ułatwienia przyłączania przeciwciał.
- Wykorzystanie EDC/Sulfo-NHS do aktywacji przeciwciał.
- Charakterystyka nanodrutów z wykorzystaniem spektroskopii strat energii elektronów oraz pomiarów potencjału zeta.
Główne wyniki
- Protokół pozwolił na pomyślne otrzymanie nanodrutów żelaznych funkcjonalizowanych przeciwciałami.
- Mikroskopia konfokalna potwierdziła specyficzne celowanie w komórki nowotworowe za pomocą zmodyfikowanych nanodrutów.
- Testy biokompatybilności wykazały, że nanodruty są bezpieczne do zastosowań komórkowych.
- Funkcjonalizacja powierzchni została potwierdzona za pomocą różnych technik charakterystyki.
Wnioski
- Ta technika biofunkcjonalizacji umożliwia celowane dostarczanie czynników terapeutycznych.
- Protokół można dostosować do różnych rodzajów nanomateriałów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować celowane terapie nowotworowe z wykorzystaniem tych nanowłókien.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia otrzymywanie specyficznie ukierunkowanych nanomateriałów magnetycznych poprzez kowalencyjne przyłączanie przeciwciał, co wspiera rozwój precyzyjnych terapeutyków i diagnostyki. Dzięki zwiększeniu specyficzności celowania oraz umożliwieniu zdalnej kontroli magnetycznej, metoda ta przyczynia się do redukcji ryzyka mechanistycznego w programach onkologicznych na wczesnym etapie. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną interwencji opartych na nanomateriałach poprzez walidację zarówno wydajności celowania, jak i biokompatybilności.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez celowanie w specyficzne markery powierzchniowe komórek, takie jak nadekspresja CD44 w komórkach nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie antygenowości przyłączonych przeciwciał za pomocą immunoprecypitacji i western blotu.
- Wartość predykcyjna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez wykazanie specyficznego celowania i biozgodności w odpowiednich modelach komórkowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie zwalidowanych systemów biologicznych gotowych do dalszych etapów analiz, z potwierdzoną funkcjonalizacją powierzchni za pomocą EELS oraz pomiarów potencjału zeta.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanym etapom wiązania kowalencyjnego i blokowania z użyciem BSA.
- Wartość skalowalności: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w odniesieniu do nanomateriałów żelazo-tlenek żelaza oraz wielosegmentowych, w tym nanodrutów żelazo-złoto.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wykazuje ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną za pomocą śledzenia w mikroskopii konfokalnej oraz testów żywotności komórek.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez weryfikację biokompatybilności nanomateriałów niepowlekanych, powlekanych APTES oraz powlekanych przeciwciałami.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność mechanizmów celowania poprzez powiązanie przyłączania przeciwciał z wiązaniem specyficznym do komórek zaobserwowanym w obrazowaniu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów badawczych od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając wiarygodną ocenę związków dzięki zastosowaniu mierzalnych, magnetycznie responsywnych nanomateriałów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie specyficznego dostarczania do komórek nowotworowych wykazujących ekspresję CD44.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz oraz wyniki ilościowe dzięki zmianom potencjału zeta i potwierdzeniu modyfikacji powierzchni za pomocą EELS.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, takie jak ilość przeciwciał wyznaczona testem BCA oraz stopień pobrania przez komórki określony za pomocą mikroskopii konfokalnej.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością badań przedklinicznych poprzez wykazaną biokompatybilność i specyficzne targetowanie w modelach komórkowych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną możliwość generowania celowanych nanomateriałów w wielu projektach i w różnych formatach nanomateriałów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach nanomateriałów z komórkami.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność biofunkcjonalizacji w różnych warunkach laboratoryjnych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju nanoterapii.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, w oparciu o zwalidowane profile celowania i bezpieczeństwa.
Kwestie związane z implementacją
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z nanomateriałami, konjugacji przeciwciał oraz technikach charakteryzacji powierzchni.
- Zależy od dostępu do kąpieli ultradźwiękowych, statywów magnetycznych oraz aparatury do analiz EELS, potencjału zeta i western blot.
- Wymaga standaryzacji protokołów płukania, blokowania i inkubacji między zespołami w celu zapewnienia spójności partii.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy zastosowaniu nanomateriałów o różnych kształtach, składach lub chemii powierzchni.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność zachowania dokładnej kolejności dodawania reagentów (np. woda dejonizowana przed wodorotlenkiem sodu) w celu wzmocnienia wiązania APTES.
