Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Protokół zapewnia prosty model do oceny integralności synaptycznej w sposób zależny od wieku. Możemy więc badać choroby neurodegeneracyjne w tkankach, które są podatne zarówno na analizę strukturalną, jak i funkcjonalną. Technika ta ułatwia zachowanie zarówno tkanki neuronalnej, jak i mięśniowej z grzbietowych podłużnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Kompleksowe zbadanie funkcji synaps w czasie i tkanek, z którymi trudno jest pracować. Metoda ta może być stosowana do badania chorób neurodegeneracyjnych, w tym ALS, choroby Parkinsona, Huntingtona i Alzheimera. Przed rozpoczęciem sekcji odetnij około 10 milimetrów od końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Po podaniu znieczulenia zagraj w sześć do 10 much na sześciocentymetrowej szalce Petriego zawierającej 70% etanolu i użyj pędzla, aby delikatnie popijać każdą muchę. Po jednej do dwóch minut użyj kleszczy, aby przenieść jedną muchę za nogi lub skrzydła do naczynia preparacyjnego pokrytego elastomerem silikonowym zawierającego od siedmiu do 10 mililitrów PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Gdy mucha jest zanurzona w PBS, użyj kleszczy Dumont numer pięć, aby ostrożnie usunąć skrzydła i użyj nożyczek do preparowania sprężyny o prostej krawędzi, aby wykonać małe nacięcie po brzusznej stronie naskórka, aby usunąć nogi.

Trzymając nożyczki preparacyjne w jednej ręce i kleszcze w drugiej, ustaw muchę brzuszną stroną do góry i przytrzymując próbkę na miejscu za pomocą kleszczy, usuń głowę i brzuch nożyczkami. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na 40 mikrolitrów i zmodyfikowanej końcówki pipety, aby zebrać klatkę piersiową i umieścić izolowane próbki tkanek w odpowiednio oznakowanej probówce zawierającej 900 mikrolitrów PBS i 150 mikrolitrów 32% formaldehydu. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej użyj pipety Pasteura, aby usunąć utrwalacz i trzykrotnie przepłukać warstwy 1,5 mililitra PBS na pranie.

Przed rozpoczęciem bisekcji załóż rękawice ochronne i okulary ochronne, a następnie napełnij kolbę cieczowym ciekłym azotem. Użyj łamacza ostrzy, aby chwycić ostrze piór pod kątem i zegnij ostrze, aby odłamać mały kawałek. Użyj łamacza ostrzy, aby zablokować ostrze na miejscu i użyj szklanej pipety Pasteura, aby usunąć cały PBS z probówek do próbek.

Użyj pęsety kriogenicznej, aby zanurzyć probówki w kolbie z ciekłym azotem. Po 10 sekundach użyj pipety Pasteura, aby dodać około 300 mikrolitrów lodowatego PBS do każdej probówki na lodzie i umieść jedną biedną stronę brzuszną Axe do góry w 10-centymetrowym naczyniu preparacyjnym pokrytym elastomerem silikonowym zawierającym lodowaty PBS. Użyj pary kleszczy, aby ustawić klatkę piersiową i znaleźć parę kleszczy, aby usunąć część zwojów piersiowych, aby odsłonić linię środkową klatki piersiowej.

Używając linii środkowej klatki piersiowej jako przewodnika, użyj luzu, aby wykonać płytkie cięcie przez jedną trzecią klatki piersiowej i użyj kleszczy, aby ustawić klatkę piersiową pod kątem 45 stopni. Użyj ostrza, aby przeciąć prosto linię środkową klatki piersiowej, aby uzyskać dwie półkrwi i ostrożnie wykonaj jedno lub dwa cięcia, aby usunąć nadmiar tkanki bez uszkadzania mięśni podłużnych grzbietu. Następnie umieść próbki tkanki mięśniowej w odpowiednio oznakowanej probówce PBS.

Gdy wszystkie próbki klatki piersiowej zostaną przecięte na pół, należy przepuścić tkanki w buforze blokującym przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować świeżo przygotowany roztwór barwienia strukturalnego i dodać 150 mikrolitrów barwnika do każdej próbki na dwugodzinną inkubację na rotatorze w temperaturze pokojowej w ciemności. Po zabarwieniu umyj próbki w PBST i umieść pięć etykiet wzmacniających ułożonych w stos i przeciętych na pół w odległości 15 milimetrów od siebie na jednym szklanym szkiełku mikroskopowym.

Użyj zmodyfikowanej końcówki mikropipety, aby przenieść klatkę piersiową na każde szkiełko i użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar PBST. Użyj kleszczy, aby ułożyć próbki w taki sposób, aby klatka piersiowa była skierowana mięśniowo do góry. Gdy próbki są prawidłowo zorientowane, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby nałożyć 70 mikrolitrów podłoża montażowego na każde szkiełko i przykryć każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie użyj lakieru do paznokci, aby obficie pokryć zewnętrzne krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uzyskać pełne uszczelnienie wokół każdej tkanki. Aby ocenić integralność synaptyczną. Połączenia nerwowo-mięśniowe mogą być barwione peroksydazą chrzanową i cyną krową Neurony ruchowe w białku wiążącym smołę 43 Kilodalton mutan mają niewielkie lub żadne barwienie peroksydazą chrzanową do 21 dnia, podczas gdy białko typu dzikiego pozostaje nienaruszone.

Nie obserwuje się widocznych różnic w barwieniu mięśni. Oprócz barwienia strukturalnego, znakowanie połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych może również zapewnić ocenę integralności synaptycznej za pomocą markerów presynaptycznych i postsynaptycznych. Należy pamiętać, że błyskawiczne zamrażanie ciekłym azotem ułatwia udaną bisekcję, ponieważ tkanka bez szybkiego zamrożenia jest bardziej podatna na uszkodzenia podczas sekcji.

Zgodnie z tą procedurą, zachowane próbki mogą być analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zmierzenia określonych aspektów struktury synaptycznej.