Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii
10 maja 2020
Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.
Protokoły zademonstrowane w tym filmie mogą być odtworzone w dowolnym laboratorium na świecie. W połączeniu reprezentują systematyczne i skuteczne podejście do charakteryzowania ruchliwości wici bakteryjnej. Ruchliwość jest kluczowym aspektem rozprzestrzeniania się i przetrwania bakterii, a te trzy metody są użytecznymi i potężnymi narzędziami do analizy ruchliwości zarówno indywidualnej, jak i zbiorowej.
Opisane tutaj techniki można łatwo zastosować do badania szeregu bakterii, w tym tych sklasyfikowanych jako chorobotwórcze. Próbując tej procedury po raz pierwszy, należy pamiętać, że jeśli płytki roju są przygotowane nieprawidłowo, można zaobserwować niespójne zachowanie lub wzorce, które naśladują, ale nie odzwierciedlają tak naprawdę ruchu zbiorowego. Hoduj przez noc kultury pożądanego szczepu z niedoborem ruchliwości w pięciu mililitrach bulionu Lennox w temperaturze 30 stopni Celsjusza z poziomym wstrząsaniem, a następnie subkulturuj w świeżym LB w tych samych warunkach do fazy wykładniczej.
Zaszczepić sześć mikrolitrów kultury w środku miękkiej płytki agarowej, wciskając załadowaną końcówkę pipety do agaru, aby delikatnie usunąć zawartość. Inkubować płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się zaostrzenia ruchliwości, pochodzące z punktu zaszczepienia lub z obwodu pierścieni ruchliwości. Użyj sterylnej pętli drucianej, aby podnieść komórki z obszaru pochodni i rozprowadzić je na twardej płytce agarowej LB w celu oczyszczenia pojedynczych kolonii.
Aby potwierdzić, że wyizolowane mutanty supresorowe przywróciły ruchliwość, należy je hodować na miękkich płytkach agarowych dla interesujących szczepów. Dla porównania uwzględnij szczep typu dzikiego i szczep z początkowym niedoborem ruchliwości. Po inkubacji płytek hodowlanych w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez osiem do 10 godzin, zapisz średnicę najbardziej zewnętrznego pierścienia, aby ustalić, które z izolatów znacznie przywróciły ruchliwość.
Przygotuj wykładniczą kulturę fazową interesującego Cię szczepu. Następnie osadzaj 10 mililitrów komórek przez wirowanie w temperaturze 2000 razy G przez trzy minuty i ponownie zawieś je w 10 mililitrach wysterylizowanego przez filtr buforu ruchliwości lub MB. Umyj komórki jeszcze dwa razy w MB i ponownie zawieś je w jednym mililitrze MB po końcowym odwirowaniu. Przenieść zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności jednego mililitra i przymocować igłę o rozmiarze 23 do końca.
Zmontuj identyczną strzykawkę i igłę i połącz je ze sobą za pomocą sześciocalowej rurki polietylenowej, szczelnie osłoniętej na każdej końcówce igły. Ścinać wici, delikatnie przepuszczając zawiesinę komórek tam iz powrotem z jednej strzykawki do drugiej 50 razy, z jednominutowymi przerwami między każdymi 10 przejściami. Następnie odwirować ścięte komórki w temperaturze 2000 razy G przez trzy minuty i ponownie zawiesić je w 500 mikrolitrach MB.To przygotować komorę do utrwalania komórek, ułożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów na szklanym szkiełku mikroskopowym oddzielonym taśmą dwustronną.
Dodaj 0,01% roztwór polilizyny do górnej części komory, aby ją przepłukać. Przechyl dolną krawędź na chusteczkę zadaniową, aby przeciągnąć roztwór przez komorę, a następnie pozostaw go w temperaturze pokojowej na 10 minut. Umyj komorę trzykrotnie 40 mikrolitrami MB i dodaj 40 mikrolitrów zawiesiny ściętych komórek na górę komory.
Pozwól komórkom przymocować się do szkiełka nakrywkowego przez 10 minut, a następnie delikatnie przepłucz komorę 40 mikrolitrami MB, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Przenieś szkiełko na stolik mikroskopu i użyj mikroskopii z kontrastem fazowym oraz obiektywu 100X, aby zeskanować populację w poszukiwaniu komórek, które są nieruchome i obracają się wokół jednej osi. Otwórz oprogramowanie mikroskopu, upewnij się, że komórki są ostre i rozpocznij akwizycję wideo, aby zarejestrować rotację komórek przez jedną minutę.
Na podstawie odtwarzania wideo określ ilościowo liczbę pełnych obrotów na minutę i liczbę zmian kierunku komórki. Zaszczep sześć mikrolitrów kultury o średniej wykładniczości, umieszczając ją na wierzchu agaru. Pozostaw pokrywkę zdjętą na pięć do 10 minut i załóż ją, gdy inokulum wyschnie na powierzchni agaru.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Wlej około 30 mililitrów agaru roju do prawej komory dwukomorowej szalki Petriego, upewniając się, że jest ona na poziomie plastikowej przegrody między komorami, ale nie przelewa się do lewej. Po stwardnieniu agaru napełnij lewą komorę około 30 mililitrami agaru do pływania lub roju.
Zanim zastygnie, użyj sterylnej końcówki pipety, aby delikatnie przejechać agar przez granicę i połączyć obie strony za pomocą mostka agarowego o wysokości jednego milimetra, który rozciąga się na całej długości przegrody. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Wlewając agar, zwróć uwagę na jego głębokość.
Jeśli jest zbyt wysoki, przeleje się. Jeśli jest zbyt niski, nie będziesz w stanie połączyć dwóch komór. Protokół ten został wykorzystany do wyizolowania pseudo rewertacyjnych zaostrzeń w podwójnie zmutowanym szczepie E. coli z upośledzoną ruchliwością.
Jeden z tych rewertantów wykazywał ruchliwość zbliżoną do typu dzikiego. Jako kontrole wykorzystano podwójnie zmutowanego rodzica i izogeniczny szczep typu dzikiego. Nagrania wideo zostały przeanalizowane w celu obliczenia obrotów na minutę oraz ułamka czasu, w którym silniki obracają się w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub odchylenia koziołkowego.
Mutant yhjH wykazywał kilka obrotów na minutę i mniejsze odchylenie opadania w porównaniu z dzikim typem E. coli, zgodnie z oczekiwaniami. Zarówno podwójny mutant, jak i jego supresor wykazywały zachowanie motoryczne podobne do typu dzikiego. Test przekraczania granicy wykorzystano do porównania zdolności izolatu typu dzikiego i supresorowego do roju, a następnie do przekroczenia granicy i rojenia się na agarze uzupełnionym kanamycyną.
Oba szczepy wykazywały podobne tempo rojenia się od identycznego punktu inokulacji, ale krzyżowanie roju z komorą antybiotykową było konsekwentnie większe dla typu dzikiego niż supresorowego. Różnica między tymi dwoma szczepami była bardziej wyraźna przy wyższych stężeniach kanamycyny. Konfiguracja testów roju może być trudna.
Być może będziesz musiał poświęcić trochę czasu na optymalizację warunków rysowania, aby dopasować je do interesujących Cię bakterii, a także warunków laboratoryjnych podczas przygotowywania pożywki. Techniki zawarte w tym protokole zostały zastosowane do szeregu bakterii wiciowych i prawdopodobnie mogą być zastosowane do wielu nieprzetestowanych gatunków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje ruchliwość bakterii, koncentrując się na przemieszczaniu się napędzanym przez wici jako sposobie nawigacji w środowisku i kolonizacji. Z wykorzystaniem ugruntowanych metodologii, badanie identyfikuje kluczowe komponenty i szlaki zaangażowane w zachowania ruchliwe zarówno indywidualne, jak i zbiorowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ruchliwość bakterii
- Mechanika wici
- Zachowanie zbiorowe bakterii
Wstęp
- Ruchliwość jest kluczowa dla przetrwania i rozprzestrzeniania się bakterii.
- Badanie obejmuje analizę ruchliwości zarówno indywidualnej, jak i zbiorowej.
- Protokoły mogą mieć zastosowanie do różnych bakterii, w tym do patogenów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie ruchliwości jako narzędzia selekcyjnego
- Zastosowanie szalek z miękkim agarem i testów rojenia
- Mikroskopia kontrastowa do obserwacji komórek
Główne wyniki
- Wyizolowane mutanty supresorowe wykazały przywróconą ruchliwość.
- Porównanie zdolności do swarmingu między typem dzikim a mutantami wykazało istotne różnice w odpowiedzi na antybiotyki.
- Ilościowe określenie obrotów silniczków dostarczyło informacji na temat wzorców ruchliwości.
Wnioski
- Badanie wykazuje skuteczność wieloetapowych protokołów w charakterystyce ruchliwości bakterii.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia zachowań patogennych oraz mechaniki ruchliwości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie mechanizmów ruchliwości bakterii dostarcza kluczowych informacji na temat wirulencji patogenów i strategii kolonizacji gospodarza, co pozwala na walidację celów w opracowywaniu leków przeciwinfekcyjnych. Połączone zastosowanie testów ruchliwości umożliwia systematyczną redukcję ryzyka w hipotezach terapeutycznych poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z fenotypami funkcjonalnymi w ruchu indywidualnym i zbiorowym. Podejście to wspiera wczesne etapy procesów odkrywania leków, generując ilościowe i powtarzalne dane, które zwiększają pewność prognostyczną w priorytetyzacji celów oraz dalszych badaniach mechanistycznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie przywrócenia ruchliwości z mutacjami supresorowymi, co pozwala na wyjaśnienie funkcji genów w procesie montażu i sygnalizacji wiciowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skuteczny system selekcji do izolowania mutantów z funkcją uzyskaną (gain-of-function), co usprawnia identyfikację szlaków kompensacyjnych w szczepach o upośledzonej ruchliwości.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przesiew fenotypowy poprzez kwantyfikację odzyskania ruchliwości, pomagając w ocenie modyfikatorów genetycznych i oddziaływań między szlakami.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Technika przytwierdzania komórek umożliwia precyzyjny pomiar prędkości silniczka i zmiany kierunku ruchu, co pozwala na mechanistyczną weryfikację celów zaangażowanych w modulację strumienia jonów lub sygnalizację.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane przygotowanie komórek poddanych ścinaniu oraz komór fiksacyjnych zapewnia powtarzalne przytwierdzanie i wizualizację w mikroskopii kontrastowej fazowej.
- Gotowość testu: Generuje mierzalne wyniki, takie jak liczba obrotów na minutę i tendencja do koziołkowania, co ułatwia porównywanie różnych szczepów i warunków w zastosowaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Test przekraczania granicy łączy indywidualną ruchliwość z kolektywnym zachowaniem rojowym, modelując sposób, w jaki patogeny przechodzą z fazy rozprzestrzeniania się do kolonizacji powierzchni w warunkach stresu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ocenę adaptacji środowiskowej, takiej jak wpływ oporności na antybiotyki na migrację roju, co dostarcza informacji o znaczeniu translacyjnym biomarkerów.
- Pewność predykcyjna: Wykazuje, w jaki sposób mutacje supresorowe zmieniają przejście roju przez antybiotyk, stanowiąc model do badania mechanizmów oporności adaptacyjnej w warunkach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje wczesne etapy odkrywania leków poprzez powiązanie przesiewania genetycznego z funkcjonalnymi fenotypami motorycznymi, co wspiera przejście od walidacji trafień w celach terapeutycznych do ograniczania ryzyka mechanistycznego przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określenie wpływu zmian genetycznych na funkcję silnika wiciowego i zdolność do tworzenia roju, co zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celów.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników (prędkości obrotu, stronniczości kierunkowej, średnicy roju), które umożliwiają wiarygodne porównania między bibliotekami mutantów lub zaburzeniami chemicznymi.
- Analityka: Generuje mierzalne dane wyjściowe, takie jak stronniczość koziołkowania i szybkość ekspansji roju, co pomaga zespołom korelować genotyp z ryzykiem fenotypowym w modelach patogennych.
- Badania translacyjne: Łączy indywidualne zachowanie silnika z ruchem zbiorowym pod wpływem presji selekcyjnej, modelując adaptację fenotypową istotną dla dynamiki infekcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Trzy opisane techniki tworzą modularną, adaptacyjną platformę stosowalną w przypadku różnych patogenów wiciowatych, co sprzyja standaryzacji międzyprojektowej i dzieleniu się odczynnikami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozbicie motywności na komponenty funkcji silnika, zmiany kierunku i zachowania zbiorowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom inokulacji w miękkim agarze, ścinania komórek i przygotowania komory, co minimalizuje zmienność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez powiązanie modulacji celu z mierzalnymi zmianami w cechach motywności związanych z wirulencją.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich rolę w rozprzestrzenianiu napędzanym motywnością oraz przetrwaniu w organizmie gospodarza.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach hodowli bakterii, mikroskopii oraz pracy w warunkach aseptycznych, aby zapewnić powtarzalność testów motywności.
- Metody zależą od dostępu do mikroskopu kontrastowego, narzędzi do mikromanipulacji oraz kontrolowanych warunków inkubacji dla testów rojnych i testów na miękkim agarze.
- Konieczna jest standaryzacja stężenia agaru, czasu suszenia płytek oraz objętości inokulum, aby uniknąć artefaktów w testach przekraczania granic roju.
- Wymagana jest adaptacja składu buforu i parametrów ścinania podczas stosowania metody przytwierdzania komórek do różnych gatunków bakterii lub szczepów mutantów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na głębokość agaru rojnego oraz technikę mostkowania, które muszą zostać zoptymalizowane, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych lub mylących odczytów ruchu zbiorowego.
