Name: Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metody badania ruchliwości bakterii Escherichia coli napędzanej wiciami. Wykorzystaj testy na płytkach z miękkim agarem i mikroskopię kontrastu fazowego do analizy ruchu pojedynczych komórek oraz zachowań zbiorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez GM118085 grantowe National Institutes of Health oraz częściowo przez Fundację Roberta Welcha (grant F-1811 dla R.M.H.).

1. Izolacja mutantów supresorowych w szczepach z niedoborem ruchliwości
UWAGA: Użyj tej metody jako szerokiego "uniwersalnego określenia" do określenia ogólnej natury wady ruchliwości.
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki z miękkim agarem 
	UWAGA: Soft-agar, określany również jako agar motoryczno-pływacki lub pływacki, to agar o niskiej zawartości procentowej (~0,2-0,35% w/v), od dawna używany do oznaczania chemotaksji<klasa sup = "xref">31,32.
	<ol>
		<li>Dodać 3 g bakto-agaru (0,3% w/v) i 20 g LB do kolby okrągłodennej o pojemności 2 l. Dodać 1 l ddH2O (wody podwójnie destylowanej) do kolby i równomiernie wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej.</li>
		<li>Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Pozostawić do ostygnięcia, delikatnie mieszając, używając pręta/płytki jak powyżej. Gdy temperatura osiągnie około 50 °C, wlać 25 ml do sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić stopiony agar z założoną pokrywką na co najmniej 1 godzinę, do użycia w ciągu 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hodowli, inokulacja i izolacja mutantów supresorowych 
	UWAGA: E. coli zaszczepione w środku pożywki bogatej w składniki odżywcze zestalonej miękkim agarem zużywają składniki odżywcze lokalnie, tworząc gradient składników odżywczych, za którym podążają. Gdy przemieszczają się na zewnątrz, pojawiają się zdefiniowane "pierścienie" (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), które są związane z określonymi chemoatraktantami, na które reagują bakterie. Wady systemu chemotaksji lub elementów strukturalnych silnika wici mogą pogorszyć wydajność tego testu. Często mutanty z przewagą ruchliwości pojawiają się podczas badań przesiewowych i można je zobaczyć wyłaniające się z jednego lub z wielu punktów na obwodzie pierścienia, skąd "rozbłyskują" (<silna klasa="xfig">Ryc. 1C). Można zauważyć, że najbardziej zewnętrzna krawędź frontu pływackiego łatwo kontrastuje z nieskolonizowanym dziewiczym miękkim agarem.
	<ol>
		<li>Hoduj przez noc kultury pożądanego szczepu z niedoborem ruchliwości w 5 ml bulionu Lennox (LB; 10 g/L tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/L NaCl, tabela materiałów) w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem poziomym (220 obr./min). Następnego dnia subkultura (rozcieńczenie 1:100) w świeżym LB, rosnąca w tych samych warunkach do fazy wykładniczej (OD600 0,6).</li>
		<li>Zaszczepić 6 μl kultury w środku miękkiej płytki agarowej (1.1) za pomocą pipety, wciskając obciążoną sterylną końcówkę do agaru, aby delikatnie usunąć zawartość. Przenieść do temperatury 30 °C i inkubować (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), aż pojawią się "rozbłyski" ruchliwości, emanujące z punktu inokulacji lub obrzeża pierścieni ruchliwości, zwykle w ciągu 24-36 godzin (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: W testach ruchliwości zaszczepić szczep typu dzikiego wraz ze zmutowanymi izolatami dla porównania. Ten dziki szczep pokaże charakterystyczne koncentryczne pierścienie chemotaktyczne (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i wypełni płytkę w ciągu 8-10 godzin.</li>
		<li>Użyj sterylnej pętli drucianej, aby podnieść komórki z obszaru "rozbłysku" i smugi, aby oczyścić pojedyncze kolonie na twardą płytkę agarową LB (LB przygotowaną jak powyżej, zestaloną z 15 g / l bakto-agarem).</li>
		<li>Wybierz pojedyncze kolonie z płytki smugowej za pomocą sterylnej pętli drucianej i ponownie oczyść, tworząc smugi dla pojedynczych kolonii, aby zapewnić izolację "czystego" izolatu kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie i charakterystyka mutantów supresorowych
	<ol>
		<li>Upewnij się, że izolowany mutant supresorowy (mutanty) przywrócił ruchliwość. Przygotować płytki z miękkim agarem (1.1) i kultury dla szczepów będących przedmiotem zainteresowania (jak w 1.2.1), w tym szczepu typu dzikiego i szczepu wyjściowego z "niedoborem ruchliwości" dla porównania.</li>
		<li>Zaszczepić płytki (jak w ppkt 1.2.2) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 8-10 godzin.</li>
		<li>Zapisz średnicę najbardziej zewnętrznego pierścienia (krawędzi okręgu) i porównaj, aby ustalić, które z izolatów znacznie przywróciły ruchliwość. 
		UWAGA: Zaleca się, aby płyty były fotografowane przez cały czas trwania eksperymentu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj urządzenia "wiadro światła"30, gdzie kamera cyfrowa jest zamontowana nad źródłem światła dla lepszego oświetlenia, aby zmierzyć średnicę kolonii pływackiej i odróżnić ją od nieskolonizowanego agaru.</li>
		<li>Tester zweryfikował izolacje WGS zgodnie z wymaganiami, co pozwoliło na wystarczające "pokrycie sekwencji", aby pozytywnie zidentyfikować mutacje, które przywróciły funkcję typu dzikiego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja zachowania motorycznego wici za pomocą tetheringu komórkowego
UWAGA: Użyj tej metody, gdy normalne zachowanie podczas przewracania (chemotaksja) wydaje się być zagrożone.
<ol>
	<li>Przygotowanie hodowli i strzyżenie wici
	<ol>
		<li>Przygotuj hodowlę fazową wykładniczą interesującego szczepu, jak opisano w kroku 1.2.1.</li>
		<li>Osad 10 ml komórek przez odwirowanie przy 2,000 x g przez 3 minuty przed ponownym zawieszeniem w 10 ml wysterylizowanego przez filtr buforu ruchliwości (MB; 10 mM bufor fosforanu potasu [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). 
		UWAGA: MB wspomaga ruchliwość, ale nie wspomaga wzrostu bakterii</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.1.2 jeszcze dwa razy przed ponownym umieszczeniem ostatniej osadki w 1 ml MB.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocować igłę 23G do końca. Zmontuj identyczną strzykawkę/igłę i połącz je ze sobą za pomocą 6-calowej rurki polietylenowej (średnica wewnętrzna 0,58 mm) szczelnie osłoniętej na każdej końcówce igły.</li>
		<li>Ścinaj wici (są kruche i łatwo pękają), delikatnie przesuwając zawiesinę komórkową tam iz powrotem z jednej strzykawki do drugiej 50 razy, z 1-minutowymi przerwami między każdymi 10 przejściami.</li>
		<li>Odwirować ścięte komórki w temperaturze 2 000 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić w końcowej objętości 500 μl MB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów i wiązanie komórek
	<ol>
		<li>Przygotuj komorę do utrwalania komórek, układając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na szklanym szkiełku mikroskopowym o wymiarach 3 cale x 1 cal x 1 mm, oddzielone taśmą dwustronną (<silna klasa = "xfig">Rysunek S1).</li>
		<li>Przepłukać komorę 0,01% (w/v) roztworem polilizyny, nakładając na górną część komory. Przechyl dolną krawędź (szkiełko nakrywkowe równo ze szkiełkiem mikroskopowym) na wycieraczkę zadaniową (bibułkę), aby pomóc w przeprowadzeniu roztworu przez komorę (<silna klasa = "xfig">Rysunek S1). Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Przemyć komorę trzykrotnie 40 μl MB, używając zgodnie z opisem w kroku 2.2.2</li>
		<li>Dodać 40 μl zawiesiny komórek ściętych (przygotowanej powyżej) do górnej części komory i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Delikatnie przepłukać komorę 40 μl MB, jak w ppkt 2.2.3, w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestrowanie rotacji komórek i kwantyfikacja
	<ol>
		<li>Przenieś szkiełko mikroskopowe załadowane komórkami na uwięzi do stolika mikroskopu.</li>
		<li>Korzystając z mikroskopii z kontrastem fazowym i obiektywu 100x, zeskanuj populację w poszukiwaniu komórek, które są nieruchome i obracają się wokół jednej osi, tj. płynne obroty w ustalonym punkcie, a nie prezentują się pod kątem, w którym komórka porusza się w pozycji ostrej i nieostrej (Wideo 1).</li>
		<li>Użyj komercyjnego mikroskopu i powiązanej kamery. Otwórz powiązane oprogramowanie, upewnij się, że interesujące komórki są ostre i kliknij akwizycję wideo, aby nagrywać obrót komórki przez jedną minutę (przy 10 klatkach na sekundę lub więcej).</li>
		<li>Na podstawie odtwarzania wideo określ ilościowo liczbę pełnych obrotów na minutę oraz liczbę zmian kierunku komórki (częstotliwość przełączania). 
		UWAGA: Prędkości obrotowe i częstotliwość przełączania mogą być zbyt szybkie, aby można je było ocenić na oko, dlatego zaleca się korzystanie z oprogramowania wideo, które oferuje wolne/dokładne odtwarzanie lub przyjmuje zautomatyzowany system oprogramowania do ilościowego określania wzorców obrotowych33. Alternatywą byłoby zwiększenie lepkości MB za pomocą metylocelulozy (lub podobnego środka), aby pomóc spowolnić i rozwiązać problem rotacji szybszych bakterii lub zrekompensować, gdy używane są kamery o niskiej liczbie klatek na sekundę.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.2 z kontrpróbami biologicznymi, aby skompilować reprezentację populacji będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie rojów w teście przekraczającym granicę
UWAGA: Użyj tej metody do oceny wpływu mutacji lub stanu na ruchliwość grupy. Agar rojowy odnosi się do agaru, w którym procent jest zwykle wyższy niż w przypadku agaru miękkiego. W miękkim agarze (0,3%) komórki pływają pojedynczo wewnątrz agaru. W agarze roju (0,5% i więcej) komórki poruszają się jako grupa na powierzchni. Podczas gdy talerze roju muszą być używane zgodnie z opisem tutaj, talerze do pływania mają dłuższy okres przydatności do spożycia i mogą być używane przez kilka dni. Naszym osobistym preferencjem jest użycie w ciągu 1-2 dni.
<ol>
	<li>Przygotowanie agaru roju
	<ol>
		<li>Dodać 5 g agaru Eiken (0,5% w/v) i 20 g LB do kolby okrągłodennej o pojemności 2 l. Dodać 1 l ddH2O do kolby i równomiernie wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej.</li>
		<li>Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.</li>
		<li>Pozostawić do ostygnięcia, delikatnie mieszając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, używając pręta/płytki jak powyżej. Gdy temperatura wynosi około 50 °C, dodać glukozę sterylizowaną filtrem, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 %.</li>
		<li>Wlać 25 ml do sterylnych szalek Petriego (100 mm x 15 mm) i pozostawić do zastygnięcia w temperaturze pokojowej na co najmniej 14 godzin i nie dłużej niż 20 godzin. Nie przechowywać do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja i inkubacja płytek roju
	<ol>
		<li>Zaszczepić 6 μl kultury o średniej wykładniczej wielkości (przygotowanej jak w 1.2) przez nakrapianie na wierzchu agaru.</li>
		<li>Pozostaw pokrywkę zdjętą na 5-10 minut i wymień, gdy inokulum wyschnie na powierzchni agaru.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 30 °C przez 8 godzin. Należy unikać pokusy sprawdzania postępu roju poprzez zdejmowanie pokrywy, ponieważ przyczyni się to do wysuszenia agaru i zakłóci wydzielanie się roju. 
		UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od fenotypu szczepu. Niektóre izolowane mutacje mogą utrudniać zdolność rojowania się i będą wymagały zmniejszonego procentu agaru lub dłuższego okresu inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek do oznaczania przekroczeń granicy 
	UWAGA: Ten test wykorzystuje zmodyfikowaną szalkę Petriego, w której plastikowa przegroda (granica) tworzy dwie komory, a nie jedną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Każda komora może być przygotowana niezależnie od drugiej, oferując różne warunki do roju, przed "połączeniem" tych dwóch. W zależności od projektu eksperymentalnego, pierwsza komora (oznaczona po lewej) może być przygotowana z agarem do pływania (0,3% w/v) lub agarem rojowym (0,5% w/v), skąd bakterie mogą migrować przez granicę do prawej komory zawierającej agar roju +/- wszelkie wymagane suplementy lub prowokacje (np. antybiotyki). Migracja na którymkolwiek z agarów jest zazwyczaj mierzona/porównywana poprzez rejestrowanie najszerszej średnicy kolonizacji bakteryjnej (od krawędzi do krawędzi) od pierwotnego punktu zaszczepienia.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby przygotować agar do pływania zgodnie z opisem w ppkt 1.1.</li>
		<li>Przygotować agar roju zgodnie z opisem w ppkt 3.1.</li>
		<li>Wlej ~30 ml agaru roju (z pożądaną suplementacją, jeśli jest to wymagane) do prawej komory dwukomorowej szalki Petriego (100 mm x 15 mm), do punktu, w którym znajduje się na poziomie plastikowej przegrody między komorami, ale nie przelewa się do lewej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Po stwardnieniu agaru napełnij lewą komorę ~ 30 ml agaru do pływania lub roju, ponownie do punktu kontaktu z plastikową przegrodą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C). Zanim zastygnie, użyj sterylnej końcówki pipety, aby delikatnie przeciągnąć agar przez granicę, aby połączyć dwie strony za pomocą mostka agarowego o wysokości ~1 mm, który rozciąga się na całej długości przegrody (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Pozostawić płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (3.1). 
		UWAGA: Alternatywną metodą tworzenia mostka jest pozostawienie agaru z lewej komory do wyschnięcia, a następnie powolne pipetowanie ~100 μl stopionego agaru roju wzdłuż plastikowej przegrody, aby połączyć dwie komory (3.4). Zaszczepić płytki w lewej komorze, jak opisano powyżej, dla agaru do pływania (1.2.2) lub roju (3.2), przed inkubacją w temperaturze 30 °C przez 12-16 godzin lub do momentu, gdy roje poczynią wystarczający postęp w prawej komorze, aby umożliwić porównania między interesującymi szczepami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Izolacja i charakterystyka mutacji supresorowych z powodzeniem przyczyniły się do zidentyfikowania kluczowych elementów systemu chemotaksji 35,36,37, a także samej maszynerii motorycznej 38,39,40. Podczas korzystania z Protokołu 1 ważne jest, aby uwzględnić wiele niezależnych powtórzeń, aby zapewnić izolację szerokiego spektrum możliwyc...

Bakterie wykorzystują wiele wyrostków do przemieszczania się i rozprzestrzeniania w swoich niszach ekologicznych1. Ruchliwość sterowana wiciami jest najszybszą z nich, promując kolonizację korzystnych miejsc w odpowiedzi na sygnały środowiskowe i znacząco przyczyniając się do zdolności patogennych niektórych gatunków2,3. Bakterie wiciowe mogą pływać pojedynczo w płynie lub roić się jako kolektyw po półstałej powierzchni4. Wici zewnątrzkomórkowe przyczepiają się do silników obrotowych osadzonych w membranie i są przez nie napędzane, które wykorzystują moc gradientów jonów do generowania momentu obrotowego, który powoduje rotację1,2,4,5,6,7,8. W E. coli, którego silniki pracują ze stałym momentem obrotowym9, moc wyjściową silnika można podzielić pod względem prędkości obrotowej i przełączania wirnika między kierunkiem przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (CCW) i zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW). Rotacja CCW sprzyja tworzeniu się spójnej wiązki wiciowej, która popycha komórkę do przodu (bieg), podczas gdy przejściowe przełączanie kierunku rotacji (CW) powoduje częściowy lub całkowity rozkład wiązki10, a komórka zmienia kierunek pływania (tumble). E. coli zazwyczaj biegną przez sekundę i przewracają się przez jedną dziesiątą sekundy. Częstotliwość przełączania wirnika lub "odchylenie wirowania" jest kontrolowane przez system sygnalizacji chemotaksji, w którym transbłonowe chemoreceptory wykrywają zewnętrzne sygnały chemiczne i przesyłają je za pośrednictwem fosfoprzekaźnika do silnika wiciowego w celu przedłużenia przebiegów w odpowiedzi na atraktanty lub stłumienia ich w odpowiedzi na toksyczne chemikalia11,12. Ruchliwość pływania jest oznaczana w 0,3% miękkim agarze .
Podczas roju, bakterie poruszają się po półstałej powierzchni jako gęsty kolektyw, gdzie stada bakterii przepływają ciągłym ruchem wirowym2,13,14,15. Roje E. coli wykazują zmienioną fizjologię chemosensoryczną (mniejsze odchylenie opadania), wyższe prędkości i wyższą tolerancję na środki przeciwdrobnoustrojowe w komórkach pływających w płynie luzem16,17. Roje różnią się między sobą stosowaniem mnóstwa strategii, które wspomagają ruch, w tym produkcji środków powierzchniowo czynnych, hiperbiczowania i wydłużania komórek2. Rój daje bakteriom przewagę konkurencyjną zarówno w środowisku ekologicznym, jak i klinicznym18,19,20. Istnieją dwie kategorie bakterii rojowych: roje umiarkowane, które mogą roić się tylko na pożywkach zestalonych z 0,5-0,8% agarem, oraz silne roje, które mogą poruszać się po wyższych stężeniach agaru21.
Istnieje wiele testów do badania motoryki pływania i jej regulacji. W przypadku upośledzenia przez mutacje lub warunki środowiskowe, ruchliwość sama w sobie oferuje silną selekcję do identyfikacji mutacji supresorowych wzmocnienia funkcji. Te tłumiki mogą być prawdziwymi rewertantami oryginalnej mutacji lub pseudo-rewertanami, w których druga mutacja przywraca funkcjonalność. Takie mutanty można zidentyfikować za pomocą sekwencjonowania całego genomu (WGS). Alternatywą dla bezstronnej selekcji supresorów jest tendencyjna strategia mutagenezy celowanej (np. mutageneza PCR). Metodologie te często rzucają światło na funkcję lub regulację środowiskową aparatu motorycznego. Jeśli celem jest badanie funkcji motorycznych, to przywrócenie motoryki typu dzikiego mierzonej w miękkim agarze niekoniecznie musi wskazywać na przywrócenie mocy motorycznej typu dzikiego. Test wiązania komórek, w którym komórki są przymocowane do szklanej powierzchni za pomocą pojedynczej wici, a następnie monitorowana jest rotacja ciała komórki, może być pierwszym testem z wyboru do oceny zachowania motorycznego. Chociaż obecnie dostępne są bardziej wyrafinowane metodologie monitorowania właściwości silnika, wymagana konfiguracja szybkiej kamery i zastosowanie pakietów oprogramowania do analizy ruchu ograniczają ich powszechne stosowanie22,23,24,25. Test wiązania komórek wymaga jedynie ścinania wici, co pozwala na przymocowanie krótkich włókien do szkiełka szkiełkowego, a następnie nagranie obrotu ciała komórki. Chociaż zarejestrowane prędkości motoryczne są niskie w tym teście ze względu na duże obciążenie, jakie ciało komórki wywiera na wić, test ten przyczynił się jednak do cennych spostrzeżeń na temat reakcji chemotaktycznych26,27,28,29 i pozostaje ważnym narzędziem śledczym, jak omówiono poniżej.
Ruchliwość roju stanowi inny zestaw wyzwań dla badaczy. Wybór tłumików wzmocnienia funkcji działa tylko w rojach, które produkują dużo środków powierzchniowo czynnych i łatwo się roją13. Nieproducenci środków powierzchniowo czynnych, takich jak E. coli, są wybredni pod względem wyboru agaru, składu podłoża i wilgotności otoczenia2,13,14,21. Po ustaleniu warunków roju, test przekraczania granicy17 jest przydatną metodologią do badania zdolności roju do poruszania się w nowych/trudnych warunkach. Chociaż przedstawione poniżej protokoły odnoszą się do E. coli, można je łatwo przystosować do stosowania u innych gatunków.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa, dwuwodzian</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Eiken Eiken Chemical Co. Japonia</td><td>E-MJ00</td><td>Niezbędny do roju E. coli</td></tr><tr><td>Glukoza D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>Rosół 410955000</tr><tr><td>LB (Lennox)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Materiały i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopem CellSense (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Lub równoważne oprogramowanie do używanego mikroskopu</td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa Sciences Scotch 666 Doube Taśma jednostronna</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe matowe 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX53</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu pionowego lub odwróconego mikroskopu fazowego</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (średnica 100 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Do testów miękkich agarowych</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna nebulizatora polietylenowego (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>9908265</tr><tr><td>Okrągła szalka Petriego z 2 przegrodami</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>Do testów granicznych</td></tr><tr><td>Bezpieczne igły podskórne (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka - 1 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki zadaniowe/tkankowe</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Lub równoważne chusteczki do jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>VWR mikro szkło osłonowe 18x18mm</td><td>Kamera VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Lub równoważna kamera mikroskopowa</td></tr></tbody></table>

badanie ruchliwości sterowanej wiciami u escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Ruchliwość jest kluczowa dla przetrwania i sukcesu wielu gatunków bakterii. Istnieje wiele metodologii wykorzystujących ruchliwość w celu zrozumienia szlaków sygnałowych, wyjaśnienia funkcji i montażu części wiciowych oraz zbadania i zrozumienia wzorców ruchu. W tym miejscu przedstawiamy kombinację trzech z tych metodologii. Ruchliwość w miękkim agarze jest najstarsza, oferując silną selekcję do izolowania mutacji supresorowych wzmocnienia funkcji w szczepach o upośledzonej ruchliwości, w których ruchliwość jest przywracana przez drugą mutację. Technika wiązania komórek, po raz pierwszy zastosowana w celu zademonstrowania obrotowego charakteru silnika wiciowego, może być wykorzystana do oceny wpływu efektorów sygnalizacyjnych na prędkość silnika i jego zdolność do zmiany kierunku obrotów. Test "przekraczania granic" jest nowszy, w którym pływające bakterie mogą być przygotowane do przejścia do poruszania się zbiorowo jako rój. W połączeniu, protokoły te reprezentują systematyczne i skuteczne podejście do identyfikacji elementów maszynerii ruchliwości oraz do scharakteryzowania ich roli w różnych aspektach pływania i roju. Można je łatwo przystosować do badania ruchliwości u innych gatunków bakterii.

Izolacja pseudo-rewertantów w szczepie E. coli, którego ruchliwość jest upośledzona przez wysokie poziomy cząsteczki sygnałowej c-di-GMP, została szczegółowo opisana w niedawnej pracy naszego laboratorium34. Szczep ten (JP142) posiadał dwie mutacje: ΔyhjH oraz ΔycgR. YhjH jest najaktywniejszą fosfodiesterazą degradującą c-di-GMP w E. coli. Brak YhjH prowadzi do podwyższonych poziomów c-di-GMP i zahamowania ruchliwości. YcgR jest efektorem c-di-GMP. W kompleksie ...

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Protokoły zademonstrowane w tym filmie mogą być odtworzone w dowolnym laboratorium na świecie. W połączeniu reprezentują systematyczne i skuteczne podejście do charakteryzowania ruchliwości wici bakteryjnej. Ruchliwość jest kluczowym aspektem rozprzestrzeniania się i przetrwania bakterii, a te trzy metody są użytecznymi i potężnymi narzędziami do analizy ruchliwości zarówno indywidualnej, jak i zbiorowej.Opisane tutaj techniki można łatwo zastosować do badania szeregu bakterii, w tym tych sklasyfikowanych jako chorobotwórcze. Próbując tej procedury po raz pierwszy, należy pamiętać, że jeśli płytki roju są przygotowane nieprawidłowo, można zaobserwować niespójne zachowanie lub wzorce, które naśladują, ale nie odzwierciedlają tak naprawdę ruchu zbiorowego. Hoduj przez noc kultury pożądanego szczepu z niedoborem ruchliwości w pięciu mililitrach bulionu Lennox w temperaturze 30 stopni Celsjusza z poziomym wstrząsaniem, a następnie subkulturuj w świeżym LB w tych samych warunkach do fazy wykładniczej.Zaszczepić sześć mikrolitrów kultury w środku miękkiej płytki agarowej, wciskając załadowaną końcówkę pipety do agaru, aby delikatnie usunąć zawartość. Inkubować płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się zaostrzenia ruchliwości, pochodzące z punktu zaszczepienia lub z obwodu pierścieni ruchliwości. Użyj sterylnej pętli drucianej, aby podnieść komórki z obszaru pochodni i rozprowadzić je na twardej płytce agarowej LB w celu oczyszczenia pojedynczych kolonii.Aby potwierdzić, że wyizolowane mutanty supresorowe przywróciły ruchliwość, należy je hodować na miękkich płytkach agarowych dla interesujących szczepów. Dla porównania uwzględnij szczep typu dzikiego i szczep z początkowym niedoborem ruchliwości. Po inkubacji płytek hodowlanych w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez osiem do 10 godzin, zapisz średnicę najbardziej zewnętrznego pierścienia, aby ustalić, które z izolatów znacznie przywróciły ruchliwość.Przygotuj wykładniczą kulturę fazową interesującego Cię szczepu. Następnie osadzaj 10 mililitrów komórek przez wirowanie w temperaturze 2000 razy G przez trzy minuty i ponownie zawieś je w 10 mililitrach wysterylizowanego przez filtr buforu ruchliwości lub MB. Umyj komórki jeszcze dwa razy w MB i ponownie zawieś je w jednym mililitrze MB po końcowym odwirowaniu. Przenieść zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności jednego mililitra i przymocować igłę o rozmiarze 23 do końca.Zmontuj identyczną strzykawkę i igłę i połącz je ze sobą za pomocą sześciocalowej rurki polietylenowej, szczelnie osłoniętej na każdej końcówce igły. Ścinać wici, delikatnie przepuszczając zawiesinę komórek tam iz powrotem z jednej strzykawki do drugiej 50 razy, z jednominutowymi przerwami między każdymi 10 przejściami. Następnie odwirować ścięte komórki w temperaturze 2000 razy G przez trzy minuty i ponownie zawiesić je w 500 mikrolitrach MB.To przygotować komorę do utrwalania komórek, ułożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów na szklanym szkiełku mikroskopowym oddzielonym taśmą dwustronną.Dodaj 0,01% roztwór polilizyny do górnej części komory, aby ją przepłukać. Przechyl dolną krawędź na chusteczkę zadaniową, aby przeciągnąć roztwór przez komorę, a następnie pozostaw go w temperaturze pokojowej na 10 minut. Umyj komorę trzykrotnie 40 mikrolitrami MB i dodaj 40 mikrolitrów zawiesiny ściętych komórek na górę komory.Pozwól komórkom przymocować się do szkiełka nakrywkowego przez 10 minut, a następnie delikatnie przepłucz komorę 40 mikrolitrami MB, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Przenieś szkiełko na stolik mikroskopu i użyj mikroskopii z kontrastem fazowym oraz obiektywu 100X, aby zeskanować populację w poszukiwaniu komórek, które są nieruchome i obracają się wokół jednej osi. Otwórz oprogramowanie mikroskopu, upewnij się, że komórki są ostre i rozpocznij akwizycję wideo, aby zarejestrować rotację komórek przez jedną minutę.Na podstawie odtwarzania wideo określ ilościowo liczbę pełnych obrotów na minutę i liczbę zmian kierunku komórki. Zaszczep sześć mikrolitrów kultury o średniej wykładniczości, umieszczając ją na wierzchu agaru. Pozostaw pokrywkę zdjętą na pięć do 10 minut i załóż ją, gdy inokulum wyschnie na powierzchni agaru.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Wlej około 30 mililitrów agaru roju do prawej komory dwukomorowej szalki Petriego, upewniając się, że jest ona na poziomie plastikowej przegrody między komorami, ale nie przelewa się do lewej. Po stwardnieniu agaru napełnij lewą komorę około 30 mililitrami agaru do pływania lub roju.Zanim zastygnie, użyj sterylnej końcówki pipety, aby delikatnie przejechać agar przez granicę i połączyć obie strony za pomocą mostka agarowego o wysokości jednego milimetra, który rozciąga się na całej długości przegrody. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Wlewając agar, zwróć uwagę na jego głębokość.Jeśli jest zbyt wysoki, przeleje się. Jeśli jest zbyt niski, nie będziesz w stanie połączyć dwóch komór. Protokół ten został wykorzystany do wyizolowania pseudo rewertacyjnych zaostrzeń w podwójnie zmutowanym szczepie E. coli z upośledzoną ruchliwością.Jeden z tych rewertantów wykazywał ruchliwość zbliżoną do typu dzikiego. Jako kontrole wykorzystano podwójnie zmutowanego rodzica i izogeniczny szczep typu dzikiego. Nagrania wideo zostały przeanalizowane w celu obliczenia obrotów na minutę oraz ułamka czasu, w którym silniki obracają się w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub odchylenia koziołkowego.Mutant yhjH wykazywał kilka obrotów na minutę i mniejsze odchylenie opadania w porównaniu z dzikim typem E. coli, zgodnie z oczekiwaniami. Zarówno podwójny mutant, jak i jego supresor wykazywały zachowanie motoryczne podobne do typu dzikiego. Test przekraczania granicy wykorzystano do porównania zdolności izolatu typu dzikiego i supresorowego do roju, a następnie do przekroczenia granicy i rojenia się na agarze uzupełnionym kanamycyną.Oba szczepy wykazywały podobne tempo rojenia się od identycznego punktu inokulacji, ale krzyżowanie roju z komorą antybiotykową było konsekwentnie większe dla typu dzikiego niż supresorowego. Różnica między tymi dwoma szczepami była bardziej wyraźna przy wyższych stężeniach kanamycyny. Konfiguracja testów roju może być trudna.Być może będziesz musiał poświęcić trochę czasu na optymalizację warunków rysowania, aby dopasować je do interesujących Cię bakterii, a także warunków laboratoryjnych podczas przygotowywania pożywki. Techniki zawarte w tym protokole zostały zastosowane do szeregu bakterii wiciowych i prawdopodobnie mogą być zastosowane do wielu nieprzetestowanych gatunków.

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Źródło: Morales-Soto, N. i wsp., Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia test roju z wykorzystaniem bakterii, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne, w celu obserwacji ruchliwości powierzchni na miękkim agarze. Obrazowanie poklatkowe rejestruje skoordynowaną ekspansję i tworzenie wąsów, podkreślając ruchliwość powierzchni bakterii.

Test roju do wizualizacji ruchliwości powierzchni bakterii

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.

Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii

Ostatnie odkrycia sugerują, że bakteryjne silniki wiciowe wyczuwają różne sygnały środowiskowe i w odpowiedzi na nie przebudowują się. Oczekuje się, że omówione tutaj testy perełkowe pomogą wyjaśnić rolę przebudowy w adaptacji komórek do stresorów środowiskowych.

Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i dokładniejsza oraz nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

Wizualizacja ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej

Protokół ten przedstawia szybką i skuteczną metodę identyfikacji czynników genetycznych zaangażowanych w różne typy ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa.

Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

Poznaj metody badania ruchliwości bakterii Escherichia coli napędzanej wiciami. Wykorzystaj testy na płytkach z miękkim agarem i mikroskopię kontrastu fazowego do analizy ruchu pojedynczych komórek oraz zachowań zbiorowych.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Przeglądaj więcej filmów