Name: Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę genetyczną opartą na żywych komórkach do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis. Wykorzystuje fluorescencyjne reportery i mikroskopię w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Andersowi Omslandowi z Washington State University za dostarczenie nośników aksonicznych-1. Prace te były wspierane przez granty NIH R01AI130072, R21AI135691 i R21AI113617. Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez fundusze startowe z University of Idaho i Center for Modeling Complex Interactions za pośrednictwem grantu NIH P20GM104420.

<ol><li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chlamydial+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li>
<li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li>
<li>Yu, H. H. Y., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CF%8328+RNA+polymerase+regulates+hctB%2C+a+late+developmental+gene+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia.</a> Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).</li>
<li>Koo, I., Stephens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmentally+Regulated+Two-component+Signal+Transduction+System+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).</li>
<li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).</li>
<li>Belland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).</li>
<li>Nguyen, B., Valdivia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li>
<li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817(2016).</li>
<li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li>
<li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li>
<li>Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdelstein%2C+A+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14-20 (2010).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Plotly Technologies Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Collaborative+data+science%22">Collaborative data science</a>. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li>
<li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li>
<li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza mechanizmów kontrolujących cykl rozwojowy chlamydii jest utrudniona ze względu na ograniczenia dostępnych obecnie narzędzi genetycznych. Wykorzystując nasz promotor-reporter Chlamydia w połączeniu z automatyczną mikroskopią żywych komórek, zbudowano system, który umożliwia monitorowanie rozwoju typu komórkowego w poszczególnych inkluzjach przez okres 24 godzin. System ten, w połączeniu z mutagenezą chemiczną i izolacją bezpośredniego włączenia, ustanowił metodę szybkiej i klonalnej selekcji Chlamydii...

Chlamydia trachomatis (Ctr) jest obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym patogenem, który przechodzi przez dwufazowy cykl rozwojowy, który jest niezbędny do jego przetrwania i proliferacji1. Cykl ten składa się z dwóch form rozwojowych, ciała elementarnego (EB) i ciała siatkowego (RB). EB jest niekompetentny w replikacji, ale pośredniczy w inwazji komórek poprzez endocytozę indukowaną efektorem2. Po znalezieniu się w żywicielu EB dojrzewa do replikatywnego RB. RB przeprowadza wiele rund replikacji przed konwersją z powrotem do EB w celu zainicjowania kolejnych rund infekcji.
Ograniczony wachlarz narzędzi genetycznych ograniczył większość badań nad chlamydiami do badań biochemicznych lub stosowania systemów zastępczych. W związku z tym wyjaśnienie regulacji genów i kontroli cyklu rozwojowego było trudne3,4. Jednym z ważniejszych wyzwań w dziedzinie chlamydii jest śledzenie czasowe cyklu rozwojowego chlamydii z wysoką rozdzielczością i identyfikacja białek zaangażowanych w jego regulację. Ekspresja genów podczas cyklu rozwojowego chlamydii była tradycyjnie realizowana za pomocą destrukcyjnych metod "punktu końcowego", w tym RNAseq, qPCR i mikroskopii komórek stałych5,6. Chociaż metody te dostarczyły bezcennych informacji, zastosowane techniki są pracochłonne i mają niską rozdzielczość czasową5,6.
W ciągu ostatniej dekady, manipulacja genetyczna Ctr rozwinęła się wraz z wprowadzeniem transformacji plazmidu i metod mutagenezy7,8,9. Na potrzeby tego badania opracowano system oparty na plazmidzie do monitorowania rozwoju chlamydii w poszczególnych inkluzjach w czasie rzeczywistym w trakcie infekcji. Stworzono transformant chlamydiowy, który wykazywał ekspresję promotora-reportera specyficznego zarówno dla komórek RB, jak i EB. Reporter specyficzny dla RB został skonstruowany przez fuzję promotora wczesnego genu RB euo przed fluorescencyjnym białkiem Clover. EUO jest regulatorem transkrypcji, który tłumi podzbiór późnych genów związanych z EB10. Promotor hctB, który koduje białko podobne do histonów biorące udział w kondensacji nukleoidu EB, został sklonowany bezpośrednio przed mKate2 (RFP) w celu stworzenia specyficznej dla EB klasy reporter11. Szkieletem dla hctBprom-mKate2/euoprom-Clover był p2TK2SW27. Promotory hctB i euo amplifikowano z genomowego DNA Ctr-L2. Każda sekwencja promotora składała się z ~ 100 par zasad przed przewidywanym miejscem rozpoczęcia transkrypcji dla określonego genu chlamydiowego oraz pierwszych 30 nukleotydów (10 aminokwasów) odpowiedniego ORF. Fluorescencyjne warianty FP uzyskano komercyjnie jako zoptymalizowane bloki genów kodonu Ctr i sklonowano w ramce z pierwszymi 30 nukleotydami każdego genu i promotora chlamydii. Terminator incD został sklonowany bezpośrednio za mKate2. Drugi promotor-reporter został umieszczony za terminatorem incD. Gen oporności na ampicylinę (bla) w p2TK2południowy zachód2 został zastąpiony genem aadA (oporność na spektynomycynę) z pBam4. W ten sposób powstała ostateczna konstrukcja p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover (Rysunek 1A), która została przekształcona w Ctr-L27. Ten szczep reporterowy RB / EB pozwolił na obserwację cyklu rozwojowego w obrębie pojedynczych inkluzji za pomocą mikroskopii żywych komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C).
Wykorzystując nasz konstrukt promotora-reportera w połączeniu z mutagenezą chemiczną, opracowano protokół do śledzenia i izolowania indywidualnych klonów, które wykazywały nieprawidłowości rozwojowe od mutagenizowanych populacji serowara Ctr L2. Protokół ten pozwala na bezpośrednie monitorowanie poszczególnych inkluzji chlamydii, śledzenie profili ekspresji genów w czasie, identyfikację klonów chlamydii, które wyrażają zmieniony rozwojowy wzorzec ekspresji genów oraz klonalną izolację Chlamydii z poszczególnych inkluzji.
Chociaż ten protokół został stworzony specjalnie do identyfikacji genów zaangażowanych w rozwój chlamydii, można go łatwo dostosować do badania dowolnej liczby szlaków genetycznych chlamydii.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowe płytki polistyrenowe</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Wzrost kultur komórkowych w celu reinfekcji izolatów</td></tr><tr><td>6-dołkowe szklane płytki denne</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Wzrost kultur komórkowych do obrazowania</td></tr><tr><td>96-dołkowe szklane płytki denne</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>Wzrost kultur komórkowych do obrazowania</td></tr><tr><td>Pogrubiona linia Jednostka CO2</td><td>OKO Labs</td><td>JEDNOSTKA CO2 BL</td><td>Stage inkubator Kontrola CO2</td></tr><tr><td>Bold line T Unit</td><td>OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>Inkubator Stage Kontrola temperatury</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter Instrument</td><td>B1005010</td><td>Rurki kapilarne</td></tr><tr><td>Filtr emisji pasmowo-przepustowej BrightLine (514/30nm)</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>Filtr fluescencyjny</td></tr><tr><td>kostka BrightLine (641/75nm)</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/ 75-25</td><td>Kostka filtracyjna fluescencyjna</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Mikroiniektor</td></tr><tr><td>Chlamydia trachmatis serowar L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>Pożywka Chlamydia trachomatis</td></tr><tr><td>-1</td><td>We własnym</td><td>NA</td><td>Media Axenic. IPB uzupełniony o 1% FBS, 25 &mu; M aminokwasy, 0,5 mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT i 50 &mu; M GTP, UTP oraz CTP. (Omsland, A. 2012) wykonane we własnym zakresie.</td></tr><tr><td>Komórki Cos-7 (ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Komórka nerkowa afrykańskiej zielonej małpy (komórki gospodarza)</td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>MP Biomedicals</td><td>194527</td><td>Inhibitor wzrostu komórek gospodarza</td></tr><tr><td>Metanosulfonian etylu, 99%</td> <td>Acros Organics</td><td>AC205260100</td><td>Mutagen</td></tr><tr><td>Fetal Plex</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-602</td><td>Suplement do podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Fidżi/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>Otwarte źródło Oprogramowanie do analizy obrazu. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Galaxy 170 S</td><td>Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>Gbloki inkubacji kultur komórkowych</td></tr><tr><td>(warianty fluorescencyjne FP: Clover i mKate2)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td></td><td>NA gblock ORF zoptymalizowanych pod kątem Ctr wariantów FP do klonowania do p2TK2południowy</td></tr><tr><td>zachód2 Gentamycyna 10mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>Antybiotyk do pożywek wzrostowych</td></tr><tr><td>HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>Płukanie komórek gospodarza</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Amersham Life Science</td><td>16920</td><td>hamuje i odwraca wczesne oddziaływania elektrostatyczne między komórką gospodarza a EB</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>Bufor pH do podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Mikromanipulator</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>Wizualizacja śladów inkluzji. https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Instrument</td><td>LB10-3</td><td>Sterownik koła filtrów</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>Oko Interfejs</td><td>dotykowy do sterowania linią Bold T i CO2</td></tr><tr><td>Jednostka Poprzedni etap XY</td><td>Prior</td><td>H107</td><td>Zmotoryzowany stolik mikroskopu XY</td></tr><tr><td>Wirówka PrismR</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>Mikrowirówka z kontrolowaną temperaturą</td></tr><tr><td>Problot Piec hybrydyzacyjny</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>Inkubator kołyszany do zakażenia Chlamydia</td></tr><tr><td>Proscan II</td><td>Wcześniejszy</td> sterownik stopnia <td>mikroskopu H30V4</td><td>XYZ</td></tr><tr><td>Oczyszczacz Klasa 2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>Praca w hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej)</td> <td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>Podstawowa pożywka wzrostowa do obrazowania</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (czerwień fenolowa) GE</td> <td>Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td>Podstawowy zakres podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Diody LED wzbudzenia LED (470nm, 595nm)</td><td>scopeLED</td><td>F140</td><td>Światło wzbudzenia</td></tr><tr><td>Dysmembrator soniczny Model 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>Sonicator, ponowne zaparcie granulatu chlamydiowego</td></tr><tr><td>Inkubator etapowy</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Komora inkubacyjna na płytce studziennej</td></tr><tr><td>z sacharozą, fosforanem i glutaminianem bufor 1X (SPG)</td><td>W domu</td><td>NA</td><td>Bufor do przechowywania chlamydiów. (10 mM fosforan sodu [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sacharozy, 0,50 mM kwas L-glutaminowy; pH 7,4)</td></tr><tr><td>Kolby T-75</td><td>Thermo Scientific 156499</td><td></td><td>Wzrost kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony TE 300</td><td>Mikroskop Nikon</td><td>16724</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>Światło białe</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>Usuwa komórki gospodarza z kolby do wysiewu na płytki</td></tr><tr><td>Kamera obrazowa Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td></td></tr><tr><td>&mikro; Manager 2.0gamma</td><td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td><td>Pakiet oprogramowania do automatycznego sterowania mikroskopem z otwartym zasobem</td></tr></tbody></table>

genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w chlamydia trachomatis

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny Chlamydia trachomatis przechodzi cykl rozwojowy składający się z dwóch morfologicznie odrębnych form rozwojowych. Niereplikacyjny organizm elementarny (EB) inicjuje infekcję gospodarza. Po wejściu do środka EB różnicuje się w ciało siateczkowate (RB). Następnie RB przechodzi wiele rund replikacji, zanim zróżnicuje się z powrotem do zakaźnej formy EB. Cykl ten ma zasadnicze znaczenie dla przeżycia chlamydii, ponieważ brak przełączania między typami komórek zapobiega inwazji lub replikacji gospodarza.
Ograniczenia w technikach genetycznych wynikające z obligatoryjnego wewnątrzkomórkowego charakteru Chlamydii utrudniły identyfikację mechanizmów molekularnych zaangażowanych w rozwój typu komórkowego. Zaprojektowaliśmy nowatorski system plazmidowy z podwójnym promotorem-reporterem, który w połączeniu z mikroskopią żywych komórek pozwala na wizualizację przełączania typów komórek w czasie rzeczywistym. Aby zidentyfikować geny zaangażowane w regulację rozwoju typu komórki, wykorzystano system promotor-reporter żywej komórki do opracowania przyszłościowego podejścia genetycznego poprzez połączenie mutagenezy chemicznej podwójnego szczepu reporterowego, obrazowania i śledzenia chlamydii ze zmienioną kinetyką rozwojową, a następnie klonalnej izolacji mutantów. Ten postępowy przepływ pracy genetycznej jest elastycznym narzędziem, które można modyfikować w celu ukierunkowania na badanie w szerokim zakresie ścieżek genetycznych.

Bezpośrednia mutageza EMS naszego szczepu chlamydii z promotorem-reporterem spowodowała ok. 75% redukcję zakaźności. Wykorzystując opisany protokół obrazowania żywych komórek, w okresie 24 h obrazowano i śledzono ok. 60 inkluzji. Kinetykę ekspresji fluorescencyjnej obu reporterów w każdej inkluzji wizualizowano za pomocą niestandardowych skryptów w notatniku Python. W celu zidentyfikowania kandydatów do izolacji zmutowanych Chlamydia wdrożono dwa podejścia do wizualizacji. Pierwsza metoda (krok 3.3.8) wizualizuj...

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Protokół ten zapewnia unikalne narzędzie do generowania i izolowania chlamydii ze zmienionymi profilami rozwojowymi, co ostatecznie pozwala na identyfikację genów regulujących cykl rozwojowy. Głównymi zaletami tej metody są możliwość śledzenia rozwoju komórek chlamydii w czasie rzeczywistym oraz możliwość izolowania chlamydii za pomocą zmieniających się programów rozwojowych. Aby zmutaginizować osobę zgłaszającą chlamydię trachomatis, zaobserwowano stado chlamydiów zawierające około trzy razy ciała podstawowe od 10 do 7.Przekształcona za pomocą interesującej nas plazmy reporterowej i osadu, myśl jest przechowywana przez centrofugację. Użyj sonikacji z mocą 10% przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić ciała elementarne w 100 mikrolitrach bufora przypadkowego metabolizmu i podzielić powstałą zawiesinę ciała elementarnego równo między dwie 1,5 mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu metabolizmu EMS do podwielokrotności chlamydii do mutagenezy i 50 mikrolitrów buforu metabolizmu wakcynowego do podwielokrotności chlamydii tylko do mutagenezy wyjściowej i inkubować obie próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.EMS jest znanym czynnikiem rakotwórczym, należy nosić rękawice podczas obchodzenia się z nim i namoczyć cały zanieczyszczony sprzęt i podłoże EMS w jednym molowym wodorotlenku sodu na 24 godziny przed usunięciem. Stworzenie hurtowej hodowli do obrazowania i izolacji zmutygenizowanych trachometrów chlamydii. Zasiej sześć dołków szklanych płytek dolnych, z sześcioma razy 10 do piątych kosztuje siedem komórek, w dwóch mililitrach kompletnego podłoża na studzienkę i wysiewaj 24-dołkową płytkę polistyrenową z 10 do piątej powoduje siedem komórek w jednym mililitrze kompletnego podłoża na studzienkę.Aby zainfekować hodowlę komórek gospodarza mutagenizowanymi, zaprzecza zakażeniu chlamydia trachomatis, pięć studzienek szklanej płytki z dnem z około sześć razy 10 do piątej zmutagenizowanej ciał elementarnych. W 1,5 mililitra lodowatego HBSS na studzienkę. i zainfekować pozostałą studzienkę, około dwa razy 10 do piątego imitacji mutagenizowanych ciał elementarnych w 1,5 mililitra lodowatego HBSS na studzienkę, po 15-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z kołysaniem, umyć zainfekowane komórki HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej jednym miligramem na mililitr heparyny, a następnie natychmiast przepłukać HBSS.ponownie przemyć komórki heparyną, a następnie natychmiast wykonać dwa płukania samym HBSS, aby upewnić się, że cała heparyna została usunięta. Po ostatnim praniu dodaj cztery mililitry pożywki do obrazowania o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki. I napełnij przestrzenie międzydołkowe dejonizowaną wodą o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 godzin.Pod koniec inkubacji ustaw inkubator ze stopniem mikroskopu na 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. I umieść sześciodołkową szklaną płytę dolną w inkubatorze etapowym. W oprogramowaniu do obrazowania, Użyj wtyczki do ekranowania o wysokiej zawartości, aby wybrać szablon płytki sześciodołkowej i wygeneruj listę pozycji obrazowania składającą się z 12 pól widzenia na studzienkę, użyj opcji autofokusa, aby ustawić ostrość dla automatycznego obrazowania i ustaw ekspozycję na 250 milisekund przy intensywności 4% w kanale GFB i 18% gęstości w kanale RFP.Tak więc w cyklu obrazowania przez 24 godziny, w odstępach 30-minutowych, aby uchwycić kinetykę cyklu rozwojowego i ustawić przechwytywanie obrazu tak, aby obejmowało wiele stosów Z z zakresem ostrości, który kończy się po obu stronach wycinka InFocus, a następnie wybierz względne Z dla obrazowania, wiele plasterków w oknie akwizycji i użyj opcji pliku stosu obrazów. , aby ustawić obrazy, które mają być zapisywane jako pliki stosu TIFF. Aby zidentyfikować ścieżki włączenia ze zmienionymi profilami rozwojowymi, użyj komórki importu na ekranie EMS, notesu języka Python markdown, aby zaimportować dane ścieżki włączenia z miejsc w statystykach ścieżek, plików CSV do ramki danych Pandy.Użyj komórki obliczeniowej, aby obliczyć czas, aby uzyskać maksymalne wyrażenie zarówno dla wczesnych, jak i późnych reporterów dla każdej ścieżki i użyj pakietu do kreślenia bokeh w komórce wykresu half max, aby zwizualizować czas dwa pół maksimum wyrażenie do połowy maksymalnego wyrażenia w stosunku do tego hctB prom. Użyj interaktywnego eksploratora identyfikatorów ścieżek bokeh, aby zidentyfikować inkluzje z populacji mutantów, które nie mieszczą się w pozorowanej chmurze rozproszonej. Aby zobrazować zmiany w kinetyce ekspresji promotora, dynamicznie na animowanym wykresie komórek krwi intensywność ekspresji EOU prom w stosunku do hctB prom.Następnie zwizualizuj migawkę z animowanego wykresu w komórce lokalizatora dołączenia. Aby wyizolować rozwojowe Newtony od inkluzji będących przedmiotem zainteresowania, ustaw pole widzenia nad studnią ze zidentyfikowanym włączeniem i przełóż igłę nad źródłem światła kanału światła białego z kontrastem interferencji fazowej, aby uwidocznić igłę, użyj kanału wzbudzenia 595 nanometrów, aby uwidocznić ciała elementarne do ekstrakcji. I użyj precyzyjnej regulacji i mikromanipulatora, aby manewrować igłą kapilarną do inkluzji, zerwać inkluzję z igłą i użyć mikrowtryskiwacza, aby wciągnąć podstawowe ciała do końcówki igły kapilarnej.Wyekstrahowane ciała elementarne z igły kapilarnej do jednego dołka z przygotowanej w 24 dołku płytki polistyrenowej i użyć nowej igły kapilarnej do następnej ekstrakcji. Po wystarczającym rozprężeniu każdego izolatu, rozbić zainfekowaną monowarstwę za pomocą jednomililitrowej końcówki mikropipety i przenieść resztki pożywki komórkowe i uwolnioną chlamydię do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Zebrane chlamydie osadzać przez wirowanie i ponownie zawieś osad w 75 mikrolitrach lodowatego buforu glutaminianu fosforanu sacharozy, a następnie równo podziel zawiesinę inkluzyjną między trzy nowe 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe z nakrętką i przechowuj probówki w temperaturze minus 80, aby odczytać stopnie Celsjusza.Aby skonfigurować hodowlę komórek gospodarza do obrazowania mutagenów, izolaty ISED wysiewają 96-dołkową szklaną płytkę dolną z 1,6 razy 10 do czwartej kosztuje siedem komórek, w 100 mikrolitrach kompletnego podłoża na studzienkę. Po tym, jak monowarstwa komórki gospodarza osiągnie zbieg, rozmrozić zebrane zmutowane klony i zapasy chlamydii typu dzikiego na lodzie i użyć jednej kolumny na izolat do przeprowadzenia dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia każdego zmutowanego izolatu. Zakażon pozostałą kolumnę chlamydią typu dzikiego, przy wielokrotności infekcji około 0,5 i umieść płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej na 10 godzin pod koniec inkubacji, wybierz trzy studzienki na izolat mutanta, które odpowiadają wielokrotności infekcji mniejszej niż jedna i wygeneruj listę pozycji obrazowania.składający się z dwóch pól widzenia na studzienkę. Na tym wykresie rozrzutu można zaobserwować czas do połowy maksymalnej ekspresji promotorów EOU i hctB z poszczególnych izolatów chlamydiów klony A3667 i B3858 zostały wybrane do izolacji, ponieważ wytwarzały krótsze czasy, aby uzyskać maksymalną ekspresję, od promotora EOU i dłuższe razy cztery hctB. Inkluzje ze zmienioną kinetyką można zidentyfikować na podstawie wizualizacji dynamicznej ekspresji genów dwóch promotorów, a migawka animowanego wykresu może być wykorzystana do określenia lokalizacji interesujących inkluzji.W tych reprezentatywnych wizualizacjach zidentyfikowano łącznie 24 inkluzje do izolacji, z których 10 wykazywało zróżnicowaną kinetykę, po ponownym przetestowaniu w trzech różnych kategoriach fenotypowych, osiem izolatów wykazywało zmniejszoną ekspresję promotora EOU po około 24 godzinach od infekcji. Jak wykazano w przypadku klonu A3667, izolat B3858 również wykazywał zmniejszoną ekspresję promotora EOU po około 24 godzinach od infekcji. Ale ogólny wzrost ekspresji promotora hctB, podczas gdy izolat B3662, wyrażał zwiększony poziom kwiatostanu z promotora EOU, po którym nastąpiła nagła utrata ekspresji w obu promotorach.Analiza mikrofotografii żywych komórek pod kątem mutacji B3662 ujawnia, że liza komórek gospodarza nastąpiła w komórkach zakażonych tym mutantem znacznie wcześniej niż w komórkach zakażonych typem dzikim. Powrót do zdrowia po chlamydii może nie być możliwy w rozwoju typu komórkowego, ponieważ komórki te nie mogą ponownie zainfekować gospodarza. Badania asocjacyjne całego genomu mogą być wykorzystane po izolacji, do identyfikacji genów rozwojowych, poprzez korelację statystyczną, z włączeniem alternatywnych promotorów reporterujących.Metoda ta może być rozszerzona na badanie wielu szlaków genetycznych, na analizę mechanizmów obwodów genetycznych i innych patogenów wewnątrzkomórkowych.

live-cell-forward-genetic-approach-to-identify-isolate-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Wrażliwe na temperaturę (ts) śmiertelne mutanty są cennymi narzędziami do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. W tym miejscu opisujemy metody generowania i klasyfikowania letalnych mutantów ts o wysokiej przepustowości.

Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin na brak gospodarza. Pokazujemy zastosowanie patogenów bakteryjnych eksprymujących GFPuv w identyfikacji roślin wyciszonych genowo podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Takie podejście jest łatwe, szybkie i ułatwia badania przesiewowe na dużą skalę, a podobny protokół można zastosować do badania różnych innych interakcji roślina-mikroorganizm.

Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Poznaj metodę genetyczną opartą na żywych komórkach do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis. Wykorzystuje fluorescencyjne reportery i mikroskopię w czasie rzeczywistym.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Przeglądaj więcej filmów