Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Protokół ten zapewnia unikalne narzędzie do generowania i izolowania chlamydii ze zmienionymi profilami rozwojowymi, co ostatecznie pozwala na identyfikację genów regulujących cykl rozwojowy. Głównymi zaletami tej metody są możliwość śledzenia rozwoju komórek chlamydii w czasie rzeczywistym oraz możliwość izolowania chlamydii za pomocą zmieniających się programów rozwojowych. Aby zmutaginizować osobę zgłaszającą chlamydię trachomatis, zaobserwowano stado chlamydiów zawierające około trzy razy ciała podstawowe od 10 do 7.

Przekształcona za pomocą interesującej nas plazmy reporterowej i osadu, myśl jest przechowywana przez centrofugację. Użyj sonikacji z mocą 10% przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić ciała elementarne w 100 mikrolitrach bufora przypadkowego metabolizmu i podzielić powstałą zawiesinę ciała elementarnego równo między dwie 1,5 mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu metabolizmu EMS do podwielokrotności chlamydii do mutagenezy i 50 mikrolitrów buforu metabolizmu wakcynowego do podwielokrotności chlamydii tylko do mutagenezy wyjściowej i inkubować obie próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

EMS jest znanym czynnikiem rakotwórczym, należy nosić rękawice podczas obchodzenia się z nim i namoczyć cały zanieczyszczony sprzęt i podłoże EMS w jednym molowym wodorotlenku sodu na 24 godziny przed usunięciem. Stworzenie hurtowej hodowli do obrazowania i izolacji zmutygenizowanych trachometrów chlamydii. Zasiej sześć dołków szklanych płytek dolnych, z sześcioma razy 10 do piątych kosztuje siedem komórek, w dwóch mililitrach kompletnego podłoża na studzienkę i wysiewaj 24-dołkową płytkę polistyrenową z 10 do piątej powoduje siedem komórek w jednym mililitrze kompletnego podłoża na studzienkę.

Aby zainfekować hodowlę komórek gospodarza mutagenizowanymi, zaprzecza zakażeniu chlamydia trachomatis, pięć studzienek szklanej płytki z dnem z około sześć razy 10 do piątej zmutagenizowanej ciał elementarnych. W 1,5 mililitra lodowatego HBSS na studzienkę. i zainfekować pozostałą studzienkę, około dwa razy 10 do piątego imitacji mutagenizowanych ciał elementarnych w 1,5 mililitra lodowatego HBSS na studzienkę, po 15-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z kołysaniem, umyć zainfekowane komórki HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza uzupełnionej jednym miligramem na mililitr heparyny, a następnie natychmiast przepłukać HBSS.

ponownie przemyć komórki heparyną, a następnie natychmiast wykonać dwa płukania samym HBSS, aby upewnić się, że cała heparyna została usunięta. Po ostatnim praniu dodaj cztery mililitry pożywki do obrazowania o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki. I napełnij przestrzenie międzydołkowe dejonizowaną wodą o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 godzin.

Pod koniec inkubacji ustaw inkubator ze stopniem mikroskopu na 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. I umieść sześciodołkową szklaną płytę dolną w inkubatorze etapowym. W oprogramowaniu do obrazowania, Użyj wtyczki do ekranowania o wysokiej zawartości, aby wybrać szablon płytki sześciodołkowej i wygeneruj listę pozycji obrazowania składającą się z 12 pól widzenia na studzienkę, użyj opcji autofokusa, aby ustawić ostrość dla automatycznego obrazowania i ustaw ekspozycję na 250 milisekund przy intensywności 4% w kanale GFB i 18% gęstości w kanale RFP.

Tak więc w cyklu obrazowania przez 24 godziny, w odstępach 30-minutowych, aby uchwycić kinetykę cyklu rozwojowego i ustawić przechwytywanie obrazu tak, aby obejmowało wiele stosów Z z zakresem ostrości, który kończy się po obu stronach wycinka InFocus, a następnie wybierz względne Z dla obrazowania, wiele plasterków w oknie akwizycji i użyj opcji pliku stosu obrazów. , aby ustawić obrazy, które mają być zapisywane jako pliki stosu TIFF. Aby zidentyfikować ścieżki włączenia ze zmienionymi profilami rozwojowymi, użyj komórki importu na ekranie EMS, notesu języka Python markdown, aby zaimportować dane ścieżki włączenia z miejsc w statystykach ścieżek, plików CSV do ramki danych Pandy.

Użyj komórki obliczeniowej, aby obliczyć czas, aby uzyskać maksymalne wyrażenie zarówno dla wczesnych, jak i późnych reporterów dla każdej ścieżki i użyj pakietu do kreślenia bokeh w komórce wykresu half max, aby zwizualizować czas dwa pół maksimum wyrażenie do połowy maksymalnego wyrażenia w stosunku do tego hctB prom. Użyj interaktywnego eksploratora identyfikatorów ścieżek bokeh, aby zidentyfikować inkluzje z populacji mutantów, które nie mieszczą się w pozorowanej chmurze rozproszonej. Aby zobrazować zmiany w kinetyce ekspresji promotora, dynamicznie na animowanym wykresie komórek krwi intensywność ekspresji EOU prom w stosunku do hctB prom.

Następnie zwizualizuj migawkę z animowanego wykresu w komórce lokalizatora dołączenia. Aby wyizolować rozwojowe Newtony od inkluzji będących przedmiotem zainteresowania, ustaw pole widzenia nad studnią ze zidentyfikowanym włączeniem i przełóż igłę nad źródłem światła kanału światła białego z kontrastem interferencji fazowej, aby uwidocznić igłę, użyj kanału wzbudzenia 595 nanometrów, aby uwidocznić ciała elementarne do ekstrakcji. I użyj precyzyjnej regulacji i mikromanipulatora, aby manewrować igłą kapilarną do inkluzji, zerwać inkluzję z igłą i użyć mikrowtryskiwacza, aby wciągnąć podstawowe ciała do końcówki igły kapilarnej.

Wyekstrahowane ciała elementarne z igły kapilarnej do jednego dołka z przygotowanej w 24 dołku płytki polistyrenowej i użyć nowej igły kapilarnej do następnej ekstrakcji. Po wystarczającym rozprężeniu każdego izolatu, rozbić zainfekowaną monowarstwę za pomocą jednomililitrowej końcówki mikropipety i przenieść resztki pożywki komórkowe i uwolnioną chlamydię do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Zebrane chlamydie osadzać przez wirowanie i ponownie zawieś osad w 75 mikrolitrach lodowatego buforu glutaminianu fosforanu sacharozy, a następnie równo podziel zawiesinę inkluzyjną między trzy nowe 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe z nakrętką i przechowuj probówki w temperaturze minus 80, aby odczytać stopnie Celsjusza.

Aby skonfigurować hodowlę komórek gospodarza do obrazowania mutagenów, izolaty ISED wysiewają 96-dołkową szklaną płytkę dolną z 1,6 razy 10 do czwartej kosztuje siedem komórek, w 100 mikrolitrach kompletnego podłoża na studzienkę. Po tym, jak monowarstwa komórki gospodarza osiągnie zbieg, rozmrozić zebrane zmutowane klony i zapasy chlamydii typu dzikiego na lodzie i użyć jednej kolumny na izolat do przeprowadzenia dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia każdego zmutowanego izolatu. Zakażon pozostałą kolumnę chlamydią typu dzikiego, przy wielokrotności infekcji około 0,5 i umieść płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej na 10 godzin pod koniec inkubacji, wybierz trzy studzienki na izolat mutanta, które odpowiadają wielokrotności infekcji mniejszej niż jedna i wygeneruj listę pozycji obrazowania.

składający się z dwóch pól widzenia na studzienkę. Na tym wykresie rozrzutu można zaobserwować czas do połowy maksymalnej ekspresji promotorów EOU i hctB z poszczególnych izolatów chlamydiów klony A3667 i B3858 zostały wybrane do izolacji, ponieważ wytwarzały krótsze czasy, aby uzyskać maksymalną ekspresję, od promotora EOU i dłuższe razy cztery hctB. Inkluzje ze zmienioną kinetyką można zidentyfikować na podstawie wizualizacji dynamicznej ekspresji genów dwóch promotorów, a migawka animowanego wykresu może być wykorzystana do określenia lokalizacji interesujących inkluzji.

W tych reprezentatywnych wizualizacjach zidentyfikowano łącznie 24 inkluzje do izolacji, z których 10 wykazywało zróżnicowaną kinetykę, po ponownym przetestowaniu w trzech różnych kategoriach fenotypowych, osiem izolatów wykazywało zmniejszoną ekspresję promotora EOU po około 24 godzinach od infekcji. Jak wykazano w przypadku klonu A3667, izolat B3858 również wykazywał zmniejszoną ekspresję promotora EOU po około 24 godzinach od infekcji. Ale ogólny wzrost ekspresji promotora hctB, podczas gdy izolat B3662, wyrażał zwiększony poziom kwiatostanu z promotora EOU, po którym nastąpiła nagła utrata ekspresji w obu promotorach.

Analiza mikrofotografii żywych komórek pod kątem mutacji B3662 ujawnia, że liza komórek gospodarza nastąpiła w komórkach zakażonych tym mutantem znacznie wcześniej niż w komórkach zakażonych typem dzikim. Powrót do zdrowia po chlamydii może nie być możliwy w rozwoju typu komórkowego, ponieważ komórki te nie mogą ponownie zainfekować gospodarza. Badania asocjacyjne całego genomu mogą być wykorzystane po izolacji, do identyfikacji genów rozwojowych, poprzez korelację statystyczną, z włączeniem alternatywnych promotorów reporterujących.

Metoda ta może być rozszerzona na badanie wielu szlaków genetycznych, na analizę mechanizmów obwodów genetycznych i innych patogenów wewnątrzkomórkowych.