Name: Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Odkryj mikrodysekcję laserową do analizy transkryptomiki regionalnej w ludzkiej tkance nerkowej. Ta metoda umożliwia izolację RNA z określonych segmentów, takich jak kłębuszek i kanalik proksymalny, w celu badania zmian ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ogólne: Autorzy chcieliby podziękować badaczom z Projektu Medycyny Precyzyjnej Nerek (www.kpmp.org) za ich łaskawe wsparcie i rady.
Finansowanie: Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), w ramach nagrody numer U2CDK114886.
Dostępność danych i materiałów: Dane są archiwizowane w Omnibusie Ekspresji Genów (GEO # oczekujące)

Badanie zostało zatwierdzone do użytku przez Institutional Review Board (IRB) na Uniwersytecie Indiana.
UWAGA: Użyj tego protokołu z tkanką nefrektomijną nerki (do 2 cm zarówno w wymiarach X, jak i Y) zakonserwowaną w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywaną w temperaturze -80 °C. Wykonuj wszystkie prace w sposób ograniczający zanieczyszczenie RNA, używaj czystych rękawiczek jednorazowych i maski na twarz. Zadbaj o czystość wszystkich powierzchni. Sprzęt, dla którego zoptymalizowano ten protokół, to laserowy system mikrodysekcji z pulsacyjnym laserem UV.
1. Kriosekcja
<ol>
	<li>Preparaty z membraną LMD PPS (poli(siarczek p-fenylenu) o średnicy 1,2 μm należy wystawić na działanie światła UV (w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych) przez 30 minut, bezpośrednio przed kriosekcją. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej, aby zapewnić optymalne przyleganie tkanek.</li>
	<li>Schłodzić kriostat do temperatury -20 °C. Oczyść powierzchnie robocze i zainstaluj nowe ostrze tnące.</li>
	<li>Umieść małe pudełko na szkiełka (oczyszczone roztworem do odkażania powierzchni RNazy) w komorze kriostatu, aby przechowywać szkiełka ze świeżo ściętą chusteczką.</li>
	<li>Przykleić próbkę w OCT do uchwytu na tkanki i pozostawić do zrównoważenia przez kilka minut, aby osiągnąć temperaturę komory i wzmocnić przyczepność między blokiem OCT a uchwytem. Wspomóż ten proces za pomocą ekstraktora ciepła.</li>
	<li>Przyciąć próbkę do grubości 12 μm i przymocować ją do specjalistycznego szkiełka LMD za pomocą adaptera do szkiełka. Na każdym szkiełku znajduje się jedna sekcja nefrektomii na szkiełku lub do dwóch sekcji biopsji nerki na szkiełku. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C z wkładem ze środkiem osuszającym i w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie, aby zapobiec gromadzeniu się nadmiaru wilgoci wewnątrz pudełka na szkiełka.</li>
	<li>Oznacz każdy slajd identyfikatorem próbki, datą i numerem slajdu.</li>
	<li>Szkiełka należy zużyć z próbkami w ciągu 10 dni od pierwotnej daty kriosekcji.</li>
</ol>
2. Mikrodysekcja laserowa
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed barwieniem należy przygotować Mieszankę Przeciwciał (Ab-Mix) w 10% BSA w PBS wolnym od RNaz, dodając: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL przeciwciała Tamm-Horsfall Protein (THP) bezpośrednio sprzężonego z Alexa Fluor 546, 3,3 μL inhibitora RNazy i 89,2 μL 10% BSA w PBS (do uzyskania objętości 100 μL). 
UWAGA: Zamiast przeciwciała THP można zastosować przeciwciała alternatywne. Na przykład 2 μl przeciwciała megalina/LRP2, bezpośrednio sprzężonego z Alexa Fluor 568, można użyć do znakowania kanalika proksymalnego. Ab-Mix zawiera przeciwciało LRP2 lub THP (do wizualizacji odpowiednio kanalików proksymalnych lub grubych kończyn wstępujących). Inne przeciwciała mogą być walidowane zgodnie z potrzebami użytkownika.</li>
	<li>Umyj szkiełko w lodowatym (-20 °C) 100% acetonie przez 1 minutę i przenieś do komory wilgotnościowej.</li>
	<li>Umyj górną część szkiełka PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund. Powtórz.</li>
	<li>Umyj górną część szkiełka 10% BSA w PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund. Powtórz.</li>
	<li>Nakładaj Ab-Mix na 5 minut.</li>
	<li>Umyj górną część szkiełka 10% BSA w PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund. Powtórz.</li>
	<li>Suszyć szkiełko na powietrzu przez 5 minut i załadować je na platformę do cięcia mikrodywekcji laserowej.</li>
	<li>Zainstalować probówki zbiorcze (autoklawowane probówki do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml) odpowiednie do pracy PCR, zawierające 50 μl buforu ekstrakcyjnego z zestawu do izolacji RNA.</li>
	<li>Kontynuuj z LMD. Ukończ każdą sesję LMD w ciągu maksymalnie 2 godzin.
	<ol>
		<li>Zbierz obrazy immunofluorescencyjne przed i po LMD, używając kamery mikroskopowej do walidacji sekcji pod kątem zmienności między operatorami, a także do celów archiwalnych, szkolenia i oceny jakości wykonanego protokołu. Aby uzyskać 0,5 – 1 ng RNA, wymagane jest minimum 500 000μm2 powierzchni. Często wymaga to użycia przekrojów o grubości do 8 x 12 μm, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału dla wszystkich podsegmentów będących przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Zidentyfikuj obszary zainteresowania na podstawie barwienia, morfologii i lokalizacji, a następnie wytnij je za pomocą lasera o mocy większej niż 40, 
		UWAGA: Oto kryteria sekcji. Kanalik proksymalny jest zdefiniowany przez znakowanie FITC-falloidyną i LRP2. Grube wznoszące się ramię jest definiowane przez oznakowanie THP. Kanał zbiorczy jest zdefiniowany przez morfologię jądrową (DAPI) i brak innych zabarwień. Kłębuszek nerkowy jest zdefiniowany przez FITC-falloidynę i morfologię. Śródmiąższ definiuje się jako obszar między barwionymi kanalikami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj sygnatura wyrażenia przekroju poprzecznego, umieszczając dwie sekcje 12 μm na szkiełku LMD i analizując całe sekcje w buforze ekstrakcyjnym.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu LMD zamknij probówki do mikrowirówki zbierającej i energicznie nimi potrząśnij, aby upewnić się, że zawartość przesunęła się z nasadki na dno probówki</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 3 000 x g przez 30 s.</li>
	<li>Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 3 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Izolacja RNA
UWAGA: Dla tego protokołu izolacji RNA dostosowaliśmy protokół z komercyjnego zestawu do izolacji RNA. Protokół producenta został zmodyfikowany tak, aby spełniał wymagania kontroli jakości określone dla projektu.
<ol>
	<li>Dodać 250 μl kondycjonowanego buforu (CB) do każdej kolumny oczyszczającej RNA (PC) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować wszystkie komputery przez 1 minutę przy 16 000 x g.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 70% etanolu (dostarczonego w zestawie) do probówek z próbkami tkanek. Dobrze wymieszać próbki, pipetując w górę i w dół. Nie wirować. Nie odwirowywać.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do kondycjonowanych komputerów PC i wirować przez 2 minuty przy 100 x g (w celu związania RNA), a następnie szybko odwirować przez 30 s przy 16 000 x g (w celu usunięcia przepływu). Powtórz ten krok, jeśli dla danego podsegmentu dostępna jest więcej niż 1 probówka z próbkami tkanek.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu płuczącego 1 (WB1) do komputerów i wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.</li>
	<li>Przygotować 40 μl DNazy na każdą próbkę (dodać 5 μl DNazy do 35 μl buforu RDD). Następnie dodać 40 μl mieszaniny bezpośrednio na membranę PC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 40 μl WB1 na membranę PC i wirować przez 15 s przy 8 000 x g.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu płuczącego 2 (WB2) na membranę PC i wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.</li>
	<li>Dodać 100 μl WB2 na membranę PC, wirować przez 2 minuty przy 16 000 x g, a następnie bezpośrednio przez wirowanie przez 1 minutę przy 16 000 x g.</li>
	<li>Przenieś komputer do nowej probówki o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Dodać 12 μl buforu elucyjnego (EB) na membranę i inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej. W związku z tym końcowa objętość wszystkich połączonych wypreparowanych próbek tkanek wynosi 12 μl na podsegment.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 1 minutę przy 1 000 x g, a następnie przez 2 minuty przy 16 000 x g.</li>
	<li>Przenieś 2 μl do świeżej probówki w celu analizy bioanalizatorem (aby zapobiec zamarzaniu i rozmrażaniu).</li>
	<li>Przechowywać wszystkie probówki w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do dalszej obróbki.</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie RNA
<ol>
	<li>Oceń każdą próbkę, przeznaczoną do sekwencjonowania, pod kątem jakości za pomocą komercyjnego bioanalizatora i chipa dedykowanego do pomiaru małych ilości RNA.</li>
	<li>Przed przygotowaniem biblioteki i sekwencjonowaniem wymagane są następujące parametry kontroli jakości (QC): Ilość RNA większa niż 4 ng dla objętości i większa niż 0,5 – 1 ng dla każdego podsegmentu; Procent transkryptów dłuższych niż 200 nukleotydów (DV200) musi być większy niż 25% dla próbek LMD (optymalna > 75%).</li>
	<li>Przeprowadź przygotowanie biblioteki za pomocą komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki cDNA przeznaczonego dla małych ilości zdegradowanego RNA. W przypadku zestawu komercyjnego wymienionego w suplemencie sugerujemy użycie opcji 2, która wymaga minimalnego DV200 wynoszącego 25% i braku fragmentacji. Niektóre technologie sekwencjonowania mogą wymagać wyższych minimalnych progów DV200, takich jak 30%7.</li>
	<li>Dodaj adaptery i indeksy cDNA.</li>
	<li>Oczyść biblioteki RNAseq za pomocą technologii kulek magnetycznych.</li>
	<li>Zuboż rybosomalne cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do usuwania rRNA przed etapem amplifikacji biblioteki RNAseq.</li>
	<li>Oczyść końcową bibliotekę RNAseq za pomocą technologii kulek magnetycznych przy stężeniu biblioteki cDNA 2 ng/μl.</li>
	<li>Przeprowadzić sekwencjonowanie RNA sparowanego końca 75 pz w komercyjnym systemie sekwencjonowania z 30 milionami odczytów/próbkę dla objętości i 100 milionami odczytów/próbkę dla odcinków podsegmentowych.</li>
	<li>Używaj referencyjnego RNA (25 μg) przy każdym cyklu sekwencjonowania, aby umożliwić kontrolę efektu partii. Początkowe stężenie naszego referencyjnego RNA wynosi 1 μg/μl, podczas gdy końcowe stężenie wykorzystywane w sekwencjonowaniu wynosi 25 ng/μL. Uruchom referencyjne RNA jako oddzielną próbkę podczas przygotowywania biblioteki i uruchamiaj ze wszystkimi próbkami LMD za każdym razem.</li>
	<li>Przeprowadzaj analizę danych za pomocą aplikacji FastQC w celu oceny jakości sekwencjonowania, odczytów międzygenowych i mitochondrialnych oraz w celu określenia odczytów przypisywanych genowi.</li>
	<li>Użyj Integrative Genomics Viewer (IGV) do wyrównania i edgeR/rbamtools do miar ekspresji transkryptu.</li>
	<li>Usuń próbki z mniej niż 100 000 odczytów. Kwantyl normalizuje nieprzetworzone odczyty w zestawie danych po odfiltrowaniu genów o niskiej ekspresji na progu zdefiniowanym przez użytkownika.</li>
	<li>Określ ilościowo wyrażenie jako stosunek podsegmentu będącego przedmiotem zainteresowania do średniej wszystkich innych podsegmentów i transformacji log2. Względna ekspresja tego samego genu może być porównywana między podsegmentami i próbkami; jednak porównywanie względnej ekspresji między dwoma różnymi genami ze względu na potencjalne różnice w degradacji między genami i gatunkami RNA nie jest idealne.</li>
	<li>Przeprowadź analizę wzbogacenia, aby porównać ekspresję genów dla zestawu producentów specyficznych dla każdego podsegmentu nefronu, podczas gdy referencyjne próbki RNA są porównywane między partiami. Za dopuszczalny uważa się efekt partii w granicach 1 odchylenia standardowego od średniej wyrażenia o wartości R > 0,9. Dodatkowa normalizacja jest wymagana w celu uzyskania wyższego wyniku efektu wsadowego. Każdy przebieg, który odbiega od zaakceptowanego efektu wsadowego, może zostać oflagowany. Q30 powinien być większy niż >90% dla każdego przebiegu sekwencjonowania.</li>
</ol>

<ol><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li>
<li>Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+segmental+renal+gene+expression+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection.</a> Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).</li>
<li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IF-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li>
<li>Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+kidney+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of kidney tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).</li>
<li>Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+of+renal+tubule+cells+and+linear+amplification+of+RNA+for+microarray+profiling+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf">https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf</a> (2016).</li>
<li>Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+laser+micro-dissection+of+specific+nephron+segments+in+the+mouse+kidney+allows+targeted+downstream+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis.</a> Physiological Reports. 3 (2), (2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832(2019).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Hipp, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Aided+Laser+Dissection%3A+A+Microdissection+Workflow+Leveraging+Image+Analysis+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools.</a> Journal of Pathology Informatics. 9, 45(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Transkryptomika oparta na LMD jest użyteczną technologią, która zakotwicza ekspresję genów w określonych obszarach tkanki. Podstawy tej technologii i jej potencjalne zastosowanie w nerkach zostały opisane wcześniej8. Jednak optymalizacja, modernizacja i usprawnienie sekcji opartej na fluorescencji, ukierunkowanej specjalnie na preparację o wysokiej dokładności w celu sekwencjonowania RNA, jest mniej wszechobecne. Ponieważ metodologia ta jest przestrzennie osadzona w tkance, może potencjalnie ujawn...

Postęp technologiczny w badaniu próbek tkanek poprawił zrozumienie stanu zdrowia i chorób w różnych narządach. Postępy te uwypukliły fakt, że patologia może rozpocząć się w ograniczonych regionach lub w określonych typach komórek, a mimo to ma istotne implikacje dla całego narządu. Dlatego w obecnej erze medycyny spersonalizowanej ważne jest zrozumienie biologii zarówno na poziomie komórki, jak i regionalnym, a nie tylko globalnie1. Jest to szczególnie prawdziwe w nerce, która składa się z różnych wyspecjalizowanych komórek i struktur, które w różny sposób inicjują i/lub reagują na stres patologiczny. Patogeneza różnych rodzajów chorób nerek u ludzi wciąż nie jest dobrze poznana. Opracowanie metodologii badania zmian w ekspresji genów w określonych segmentach kanalików, strukturach lub obszarach śródmiąższu w ludzkiej nerce zwiększy zdolność do odkrywania zmian specyficznych dla regionu, które mogą informować o patogenezie choroby.
Próbki z biopsji ludzkiej nerki są ograniczonym i cennym zasobem. Dlatego technologie badające transkryptomikę w tkance nerkowej powinny być zoptymalizowane w celu oszczędzania tkanki. Dostępne metody badania transkryptomiki na poziomie komórkowym i regionalnym obejmują sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNaseq), pojedyncze jądrowe RNaseq (snRNaseq), hybrydyzację przestrzenną in situ i mikrodysekcję laserową (LMD). Ten ostatni doskonale nadaje się do precyzyjnej izolacji regionów lub struktur będących przedmiotem zainteresowania w obrębie skrawków tkanki, do sekwencjonowania i analizy RNA2,3,4,5. LMD można zastosować do identyfikacji określonych typów lub struktur komórek na podstawie zwalidowanych markerów przy użyciu obrazowania opartego na fluorescencji podczas sekcji.
Unikalne cechy regionalnej transkryptomiki wspomaganej mikrodysekcją laserową obejmują: 1) zachowanie przestrzennego kontekstu komórek i struktur, co uzupełnia technologie jednokomórkowe, w których komórki są identyfikowane przez ekspresję, a nie histologicznie; 2) technologia dostarcza informacji i jest informowana przez inne technologie obrazowania, ponieważ marker przeciwciał określa sygnatury ekspresji; 3) zdolność do identyfikacji struktur nawet wtedy, gdy markery zmieniają się w chorobie; 4) wykrywanie transkryptów o niskiej ekspresji w około 20 000 genów; i 5) niezwykła gospodarka tkankowa. Technologia jest skalowalna do biopsji nerki o grubości rdzenia mniejszej niż 100 μm niezbędnej do wystarczającego pozyskania RNA i umożliwia wykorzystanie zarchiwizowanych zamrożonych tkanek, które są powszechnie dostępne w dużych repozytoriach lub ośrodkach akademickich6.
W dalszej pracy szczegółowo opisujemy technologię transkryptomiki regionalnej i masowej, zoptymalizowaną za pomocą nowatorskiego protokołu szybkiego barwienia fluorescencyjnego do użytku z ludzką tkanką nerkową. Podejście to jest lepsze od klasycznych eksploracji LMD, ponieważ zapewnia oddzielne dane dotyczące ekspresji dla podsegmentów śródmiąższu i nefronu, w przeciwieństwie do zagregowanej ekspresji cewkowo-śródmiąższowej. Uwzględniono środki zapewnienia jakości i kontroli wdrożone w celu zapewnienia rygoru i odtwarzalności. Protokół umożliwia wizualizację komórek i regionów będących przedmiotem zainteresowania, co skutkuje zadowalającym pozyskiwaniem RNA z tych izolowanych obszarów, co umożliwia sekwencjonowanie RNA w dalszej kolejności.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Wkład osuszający</td><td>Bel-Art</td><td>F42046-0000</td><td></td></tr><tr><td>Bufor DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>RDD jest zawarty w pakage</td></tr><tr><td>Mikroskop do mikrodysekcji laserowej</td><td>Leica</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Megalin/LRP2</td><td>Abcam</td><td>ab76969</td><td>Bezpośrednio sprzężone z probówkami do mikrowirówek Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td></td><td>TermoFisher</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Leica</td><td>DFC700T</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( Bez RNA)</td><td>VWR</td><td>K812-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidyna (Oregon Green 488)</td><td>Zestaw</td> do izolacji RNA ThermoFisher <td>O7466</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z membraną PPS</td><td>Leica</td><td>11505268</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Odniesienie dla człowieka Całkowite RNA 25 i mikro; g</td><td>Takara Clontech</td><td>636690</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Eukariont Całkowite RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNAzy</td><td>Sekwencer ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>(HiSeq lub NovaSeq)</td><td>Illumina</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2</td><td>Takara Clontech</td><td></td><td></td>634411</tr><tr><td>Przeciwciało białkowe Tamm-Horsfall</td><td>R& D Systems</td><td>AF5144</td><td>Bezpośrednio sprzężony z Alexa Fluor 546</td></tr><tr><td>Tissue-Tek&reg; O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Analiza ekspresji genów w ludzkiej tkance nerkowej jest ważnym narzędziem do zrozumienia homeostazy i patofizjologii chorób. Konieczne jest zwiększenie rozdzielczości i głębokości tej technologii oraz rozszerzenie jej na poziom komórek w tkance. Chociaż zastosowanie sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i pojedynczej komórki stało się powszechne, sygnatury ekspresji komórek uzyskane w wyniku dysocjacji tkanek nie zachowują kontekstu przestrzennego. Mikrodysekcja laserowa (LMD) oparta na specyficznych markerach fluorescencyjnych pozwoliłaby na izolację określonych struktur i grup komórek o znanej lokalizacji, umożliwiając w ten sposób uzyskanie przestrzennie zakotwiczonych sygnatur transkryptomicznych w tkance nerkowej. Zoptymalizowaliśmy metodologię LMD, kierując się szybkim barwieniem opartym na fluorescencji, aby wyizolować pięć odrębnych przedziałów w ludzkiej nerce i przeprowadzić sekwencjonowanie RNA z cennych próbek ludzkiej tkanki nerkowej. Prezentujemy również parametry kontroli jakości umożliwiające ocenę adekwatności pobranych próbek. Przebieg pracy opisany w tym manuskrypcie pokazuje wykonalność tego podejścia do izolowania subsegmentowych sygnatur transkryptomicznych z dużą pewnością. Przedstawione tu podejście metodologiczne może być również zastosowane do innych typów tkanek z podstawieniem odpowiednich markerów przeciwciał.

Próbki
Przedstawiamy dane z dziewięciu referencyjnych nefrektomii (3 preparaty pozyskane na Indiana University oraz 6 preparatów pozyskanych w ramach Kidney Precision Medicine Project), z wykorzystaniem protokołu szybkiego barwienia fluorescencyjnego w celu izolacji segmentów nefronów nerkowych i obszarów śródmiąższowych. Przekroje wykorzystane w tym procesie uzyskano od zmarłych dawców nerek lub z nieobjętych guzem obszarów nefrektomii. Próbki te nie wykazywały patologicznych...

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...

Mikrodysekcja laserowa pozwala na analizę transkryptomiczną przestrzennie zdefiniowanych obszarów w próbkach tkanki nerkowej. Daje nam to wyjątkową możliwość identyfikacji interesujących struktur nawet po tym, jak zaszły zmiany wywołane chorobą. Głównymi zaletami tej metodologii jest jej komplementarność z innymi technologiami omicznymi, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.Zapewnia niezwykłą oszczędność tkankową, a nawet umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej ekspresji. Po pobraniu próbki tkanki należy użyć kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza, aby przyciąć próbkę do grubości 12 mikrometrów i użyć adaptera suwakowego, aby przymocować próbkę do specjalistycznego szkiełka do mikrodysekcji laserowej. W ciągu 10 dni od kriosekcji wymieszaj 89,2 mikrolitrów 10% BSA bez RNaz w PBS z czterema mikrolitrami falloidyny FITC, 1,5 mikrolitra DAPI, dwoma mikrolitrami interesującego przeciwciała bezpośrednio sprzężonego z Alexa Fluor 546 i 3,3 mikrolitra inhibitora RNazy.Myj szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza 100% aceton przez minutę i umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Umyj górną część szkiełka dwa razy świeżym PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund na pranie, a następnie dwa 30-sekundowe mycia z 10% BSA w PBS bez RNaz. Po ostatnim przemyciu należy potraktować próbkę przygotowanym roztworem przeciwciał przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć ją jeszcze dwa razy 10% BSA w PBS wolnym od RNaz.Po drugim myciu wysusz szkiełko na powietrzu przez pięć minut w kapturze do hodowli tkankowych przed załadowaniem szkiełka na platformę do cięcia mikrodysekcji laserowej. Zainstalować na urządzeniu autoklawowane probówki do pobierania mikrowirówek o pojemności 500 mikrolitrów, odpowiednie do pracy PCR, zawierające 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego z zestawu do izolacji RNA. Po załadowaniu zidentyfikuj obszary zainteresowania w próbce na podstawie barwienia, morfologii i lokalizacji.Użyj immunofluorescencji, aby obrysować interesujące Cię segmenty o powierzchni co najmniej 500 000 mikrometrów kwadratowych. Następnie zainicjuj mikrodysekcję laserową, aby wyciąć obszar za pomocą lasera o mocy większej niż 40. Po zakończeniu procesu mikrodysekcji laserowej zakryj probówki zbiorcze mikrowirówki i energicznie przesuwaj probówki, aby upewnić się, że zawartość przesuwa się z nasadek na dno probówek.Po odwirowaniu inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut przed ponownym odwirowaniem probówek. Następnie przenieś supernatanty do nowych probówek o pojemności 500 mikrolitrów z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Identyfikacja podsegmentów kanalików w nerkach odbywa się poprzez barwienie przeciwciałami unikalnych markerów rurkowych, a także morfologii komórek i strukturalnych punktów orientacyjnych.Znakowanie fluorescencyjne w połączeniu z morfologicznymi cechami tkanek i przestrzennym umiejscowieniem struktur obrazu ułatwia wizualizację podsegmentów nerek z dużą dozą pewności. W tej reprezentatywnej analizie sekwencjonowania niższego szczebla wskaźnik powodzenia w osiągnięciu minimalnego obszaru sekcji był większy niż 90%, co skutkowało wysoką całkowitą ilością mRNA dostępną do wykrywania genów. W tej analizie 100% próbek spełniało minimalny próg wykrywalności wynoszący co najmniej 10 000 genów.Po mikrodysekcji laserowej można porównać analizę wzbogacenia ekspresji genów znanych markerów z tymi z innych kompartmentów. W tej analizie zidentyfikowano jeden marker dla każdego podsegmentu za pomocą regionalnej transkryptomiki mikrodysekcji laserowej, która również dała specyficzne barwienie immunohistochemiczne odpowiedniego podsegmentu nefronu. Ważne jest, aby pamiętać, że mikrodysekcja laserowa opiera się w dużej mierze na wiedzy użytkownika, aby precyzyjnie zidentyfikować interesujące go struktury, które mają zostać wypreparowane.Technika ta pozwala na badanie specyficznych regionalnych sygnatur ekspresji genów, które można wykorzystać do oceny potencjalnych szlaków zaangażowanych w postęp choroby, a także biologii zdrowej tkanki.

application-laser-microdissection-to-uncover-regional-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Zewnątrzkomórkowe DNA (ecDNA) uwalniane podczas śmierci komórki jest prozapalne i przyczynia się do stanu zapalnego. Pomiar ecDNA w miejscu urazu może określić skuteczność leczenia w narządzie docelowym. Protokół ten opisuje wykorzystanie narzędzia uczenia maszynowego do automatyzacji pomiaru ecDNA w tkance nerkowej.

Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół analizy proteomicznej całej nerki, izolowanych kanalików korowych i proteomów rdzeniowych. W badaniu porównano również regionalne proteomy w mysim modelu z cukrzycą i myszach bez cukrzycy.

Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy

W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji i oceny funkcjonalnej ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, ułatwiający badania przedkliniczne w celu opracowania farmaceutycznego.

Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki

Odkryj mikrodysekcję laserową do analizy transkryptomiki regionalnej w ludzkiej tkance nerkowej. Ta metoda umożliwia izolację RNA z określonych segmentów, takich jak kłębuszek i kanalik proksymalny, w celu badania zmian ekspresji genów.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Przeglądaj więcej filmów