Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Mikrodysekcja laserowa pozwala na analizę transkryptomiczną przestrzennie zdefiniowanych obszarów w próbkach tkanki nerkowej. Daje nam to wyjątkową możliwość identyfikacji interesujących struktur nawet po tym, jak zaszły zmiany wywołane chorobą. Głównymi zaletami tej metodologii jest jej komplementarność z innymi technologiami omicznymi, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.

Zapewnia niezwykłą oszczędność tkankową, a nawet umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej ekspresji. Po pobraniu próbki tkanki należy użyć kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza, aby przyciąć próbkę do grubości 12 mikrometrów i użyć adaptera suwakowego, aby przymocować próbkę do specjalistycznego szkiełka do mikrodysekcji laserowej. W ciągu 10 dni od kriosekcji wymieszaj 89,2 mikrolitrów 10% BSA bez RNaz w PBS z czterema mikrolitrami falloidyny FITC, 1,5 mikrolitra DAPI, dwoma mikrolitrami interesującego przeciwciała bezpośrednio sprzężonego z Alexa Fluor 546 i 3,3 mikrolitra inhibitora RNazy.

Myj szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza 100% aceton przez minutę i umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Umyj górną część szkiełka dwa razy świeżym PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund na pranie, a następnie dwa 30-sekundowe mycia z 10% BSA w PBS bez RNaz. Po ostatnim przemyciu należy potraktować próbkę przygotowanym roztworem przeciwciał przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć ją jeszcze dwa razy 10% BSA w PBS wolnym od RNaz.

Po drugim myciu wysusz szkiełko na powietrzu przez pięć minut w kapturze do hodowli tkankowych przed załadowaniem szkiełka na platformę do cięcia mikrodysekcji laserowej. Zainstalować na urządzeniu autoklawowane probówki do pobierania mikrowirówek o pojemności 500 mikrolitrów, odpowiednie do pracy PCR, zawierające 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego z zestawu do izolacji RNA. Po załadowaniu zidentyfikuj obszary zainteresowania w próbce na podstawie barwienia, morfologii i lokalizacji.

Użyj immunofluorescencji, aby obrysować interesujące Cię segmenty o powierzchni co najmniej 500 000 mikrometrów kwadratowych. Następnie zainicjuj mikrodysekcję laserową, aby wyciąć obszar za pomocą lasera o mocy większej niż 40. Po zakończeniu procesu mikrodysekcji laserowej zakryj probówki zbiorcze mikrowirówki i energicznie przesuwaj probówki, aby upewnić się, że zawartość przesuwa się z nasadek na dno probówek.

Po odwirowaniu inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut przed ponownym odwirowaniem probówek. Następnie przenieś supernatanty do nowych probówek o pojemności 500 mikrolitrów z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Identyfikacja podsegmentów kanalików w nerkach odbywa się poprzez barwienie przeciwciałami unikalnych markerów rurkowych, a także morfologii komórek i strukturalnych punktów orientacyjnych.

Znakowanie fluorescencyjne w połączeniu z morfologicznymi cechami tkanek i przestrzennym umiejscowieniem struktur obrazu ułatwia wizualizację podsegmentów nerek z dużą dozą pewności. W tej reprezentatywnej analizie sekwencjonowania niższego szczebla wskaźnik powodzenia w osiągnięciu minimalnego obszaru sekcji był większy niż 90%, co skutkowało wysoką całkowitą ilością mRNA dostępną do wykrywania genów. W tej analizie 100% próbek spełniało minimalny próg wykrywalności wynoszący co najmniej 10 000 genów.

Po mikrodysekcji laserowej można porównać analizę wzbogacenia ekspresji genów znanych markerów z tymi z innych kompartmentów. W tej analizie zidentyfikowano jeden marker dla każdego podsegmentu za pomocą regionalnej transkryptomiki mikrodysekcji laserowej, która również dała specyficzne barwienie immunohistochemiczne odpowiedniego podsegmentu nefronu. Ważne jest, aby pamiętać, że mikrodysekcja laserowa opiera się w dużej mierze na wiedzy użytkownika, aby precyzyjnie zidentyfikować interesujące go struktury, które mają zostać wypreparowane.

Technika ta pozwala na badanie specyficznych regionalnych sygnatur ekspresji genów, które można wykorzystać do oceny potencjalnych szlaków zaangażowanych w postęp choroby, a także biologii zdrowej tkanki.