Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Protokół ten pozwala na wizualizację i śledzenie międzygatunkowych interakcji bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Główną zaletą tej techniki jest jej zastosowanie do badania interakcji bakteryjnych, w tym śledzenia komórek, ekspresji genów i barwienia żywotności. Dodatkowo warunki mogą być modyfikowane w celu badania różnych organizmów.

Na początek przygotuj poduszki agarozowe, topiąc 2% niskotopliwą agarozę w 10 mililitrach pożywki bakteryjnej w czystej 50-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Podgrzewać kolbę w kuchence mikrofalowej w krótkich odstępach czasu, aż agaroza znajdzie się w roztworze, a następnie pozostawić ją do ostygnięcia w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Dopasuj wycięty silikon do otworu w 35-milimetrowym naczyniu, a następnie odwróć naczynie i lekko postukaj w wycięty silikon szpatułką, aby przymocować go do naczynia i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Gdy agaroza ostygnie, odpipetuj 915 mikrolitrów stopionej agarozy do formy i pozostaw wacik do wyschnięcia. Ogrzej komorę środowiskową mikroskopu do temperatury eksperymentalnej co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotuj chusteczki nawilżające, szczelnie zwijając niestrzępiącą się chusteczkę.

Umieść zwiniętą chusteczkę w sterylnej szalce Petriego i dodaj 500 mikrolitrów sterylnej wody bezpośrednio do chusteczek. Podgrzej chusteczki, podpaski i sterylne naczynie o średnicy 35 milimetrów do temperatury eksperymentalnej, aby zrównoważyć wszystkie materiały. Gdy płatki wyschną, odpipetuj jeden mikrolitr kokultury równomiernie na dnie wstępnie podgrzanego, sterylnego 35-milimetrowego szklanego naczynia nakrywkowego.

Usuń silikon wycięty z formy agarozowej za pomocą sterylnej pęsety, przechyl ją na bok i wsuń lekko zgiętą szpatułkę pod krawędź wacika agarozowego, aby upuścić ją na sterylną petryplate pokrywkę. Przenieś podkładkę do naczynia z komórkami bakteryjnymi dolną stroną do dołu, wsuwając szpatułkę pod kątem 90 stopni pod podkładkę i umieszczając ją na wierzchu zaszczepionego szkiełka nakrywkowego. Użyj szpatułki, aby podkładka przylegała do szkiełka nakrywkowego i delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza.

Usuń nadmiar wilgoci z wilgotnej chusteczki i umieść ją wokół krawędzi naczynia, upewniając się, że nie dotyka podkładki. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania. Przed zaszczepieniem elektrod ustaw mikroskop, wykonując kolorowe oświetlenie, aby wyrównać wszystkie klatki obrazu.

Gdy zaszczepione danie będzie gotowe, obejrzyj naczynie obiektywem 100X i skup się na wynikach bakterii. Kliknij opcję fazy w oprogramowaniu do obrazowania i dostosuj procentową ilość emitowanego światła LED DIA, wybierając źródło światła i przesuwając pasek na skali procentowej światła. Możesz też ręcznie wprowadzić czas naświetlania.

Zapisz ustawienia kanału fazowego, klikając prawym przyciskiem myszy kanał fazowy i wybierając opcję Przypisz bieżące ustawienie mikroskopu. Jeśli używasz fluorescencji, wybierz interesujący Cię kanał fluorescencji i ustaw procent emitowanego światła fluorescencyjnego, a następnie dostosuj czas ekspozycji zgodnie z wcześniejszym opisem. Możesz też zmienić głębokość stawki, aby dostosować zakres dynamiczny, wybierając jedną z pozostałych opcji z menu.

Zapisz ustawienia kanału fluorescencji, klikając kanał fluorescencji prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Przypisz bieżące ustawienie mikroskopu. Na karcie XY kliknij pole w kolumnie nazwy punktu, aby zapisać wybraną pozycję XY, która Cię interesuje. Następnie kliknij pole PFS u dołu karty, aby włączyć idealny system ustawiania ostrości.

Uaktywnij komórki i kliknij strzałkę w kolumnie PFS, aby zapisać punkt skupienia pozycji XY. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych pozycji XY. Zapisz ustawienia dla pozycji XY w zakładce fazy, jak pokazano wcześniej.

Kliknij kartę czasu i zaznacz pole, aby wybrać interwał akwizycji, częstotliwość i czas trwania obrazowania. Następnie kliknij zakładkę długości fali i zaznacz pole, aby wybrać kanały, które mają być używane w obrazowaniu i częstotliwość interwału kanału. Po złowieniu ustawień kliknij Uruchom teraz, aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe.

W porównaniu z komórkami P.aeruginosa w monokulturze, które pozostają zgrupowane w tratwach, gdy są w kokulturze z S. aureus, P.aeruginosa ma zwiększoną ruchliwość pojedynczych komórek w kierunku kolonii S. aureus. Pojedyncze komórki P.aeruginosa otaczają i ostatecznie atakują kolonie S.aureus. Zbyt duża lub zbyt mała wilgotność podczas eksperymentu i nieprawidłowo wysuszone elektrody to dwa częste problemy, które prowadzą do dryfu z powodu przesuwania się podkładki i przeciągania komórek poza pole widzenia.

Wybielanie zdjęć i fototoksyczność mogą spowodować, że komórki najpierw stracą fluorescencję, a następnie przestaną się dzielić i ostatecznie umrą w kolejnych klatkach. Komórki, które początkowo znajdują się zbyt blisko siebie, mogą nie mieć wystarczająco dużo czasu, aby ustalić gradient wydzielanych sygnałów, na które inne gatunki mogą zareagować. Żywotność komórek bakteryjnych można zwizualizować, dodając jodek propidyny do waszek agarozy.

Zielone komórki wskazują żywe komórki aktywnie eksprymujące GFP, podczas gdy czerwone krwinki wskazują martwe komórki barwione jodkiem propidyny po potraktowaniu supernatantem wolnym od komórek P.aeruginosa. Ruch poszczególnych komórek P.aeruginosa jest śledzony od ramki, w której komórka opuszcza tratwę, przez ramkę, w której komórki docierają do klastra S.aureus. Odległość między tratwą P.aeruginosa a gromadą S.aureus zapewnia odległość euklidesową, podczas gdy całkowita długość torów zapewnia skumulowaną odległość.

Kierunkowość każdej komórki oblicza się jako stosunek odległości euklidesowej do odległości skumulowanej. Dziki typ P.aeruginosa przesuwa się w kierunku dzikiego typu S.aureus ze znacznie większą ukierunkowaniem niż w kierunku S.Aureus, pozbawionego regulowanych przez agr czynników wydzielanych, które są niezbędne do ruchliwości kierunkowej. Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że każdy badacz będzie musiał zoptymalizować warunki suszenia płatków agarozy w obrazowaniu na żywo w oparciu o położenie geograficzne, środowisko laboratoryjne i konkretny eksperyment.

Technika ta ujawnia interakcje między Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, wcześniej niejasne podczas naszych badań nad ich zachowaniem w hodowli masowej, przybliżając nas do zrozumienia, w jaki sposób te organizmy oddziałują na siebie podczas infekcji.