Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Zmieniona ekspresja mikroRNA w AKI może być przydatna do biomarkerów i terapii. Protokół ten jest prosty i zapewnia stałe wyniki między laboratoriami. IRI nerki stanowi jeden z głównych czynników ryzyka AKI. Kwantyfikacja mikroRNA, które są zmieniane przez IRI, prowadzi do diagnozy. MikroRNA oczyszczone z próbki nerki nakłada się na inny układ. Uważnie monitoruj hipotermię, nawilżenie jelit i głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu. Dzieje się tak, ponieważ istnieje wiele technik manualnych, do których można się przyzwyczaić.

[Narrator] Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca u nogi, umieść znieczuloną mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej. Po wykonaniu nacięcia brzucha w linii środkowej użyj bawełnianego wacika zwilżonego PBS, aby delikatnie wypchnąć jelito na lewą stronę dodatkowej jamy brzusznej, aby odsłonić prawą nerkę i moczowód i użyj kleszczy pod kątem, aby podnieść prawy moczowód. Podwiązać moczowód w dwóch miejscach za pomocą jedwabnych plecionych szwów 4-0, pozostawiając dłuższe wiązania na szew, który jest bliżej nerki, i przeciąć między szwami. Ostrożnie trzymając pozostały szew, tępo wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz wzdłuż nerki i zidentyfikuj naczynie krwionośne, które nie jest tętnicami nerkowymi lub żyłami, które dostarczają krew do prawej nerki. Podwiązać naczynie, a gdy prawa nerka zostanie wystarczająco odłączona, podwiązać żyłę nerkową i tętnicę. Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego PBS delikatnie popchnij jelito w kierunku prawej strony dodatkowej jamy brzusznej, aby odsłonić lewą nerkę i przykryj jelito zwilżoną zasłoną. Po przygotowaniu lewej nerki, jak pokazano, zaciśnij tętnicę nerkową i żyłę w odległości jednego centymetra od nerki, aby wywołać niedokrwienie lewej nerki. Udane niedokrwienie można wizualnie potwierdzić poprzez stopniowe, równomierne ciemnienie tkanki nerkowej. Po potwierdzeniu niedokrwienia należy przywrócić tkankę jelitową do jamy brzusznej, uważając, aby uniknąć skrętu jelit, a także tymczasowo zamknąć i ułożyć skórę brzucha. Po 25 do 45 minutach zdejmij zacisk i upewnij się, że poprawia się reperfuzja przepływu krwi i kolor nerek. Po upewnieniu się, że jelito nie jest skręcone, wkroplić PBS dootrzewnowe i zamknąć mięśnie brzucha i skórę w dwóch warstwach za pomocą nylonowych szwów 4-0. 24 godziny po indukcji urazu niedokrwiennego ponownie otwórz nacięcie linii środkowej i użyj igły o rozmiarze 27, aby pobrać krew z żyły głównej dolnej. Wykonaj nacięcie w linii środkowej w ścianie klatki piersiowej i wprowadź igłę o rozmiarze 23 do lewej komory. Po potwierdzeniu przepływu zwrotnego do igły należy wykonać nacięcie w prawym płacie wątroby i wstrzyknąć 20 mililitrów PBS. Wątroba zmieni kolor na czerwony na różowy, potwierdzając, że odsączono wystarczającą ilość krwi. Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć lewą nerkę i umyć wyciętą tkankę w naczyniu z PBS. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć powięź nerkową bez wysuszania nerki i przeciąć nerkę na pół wzdłuż pionowej linii środkowej. W celu oczyszczenia mikroRNA umieść 30 miligramów zamrożonej próbki nerki w szklanym homogenizatorze zawierającym 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenyloguanidyny na lodzie i powoli i wielokrotnie przekręcaj tłuczek, aby całkowicie homogenizować próbkę. Gdy tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana, przenieś homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki w dwumililitrowej probówce zbiorczej i zbierz próbkę na dno probówki przez odwirowanie. Przenieść lizat do nowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 140 mikrolitrów chloroformu i mieszać probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund z mocno dokręconą nakrętką. Po dwu- lub trzyminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, należy osadzać próbkę przez odwirowanie i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 1,5 raza objętość 100% etanolu bez naruszania osadu. Mieszać próbkę przez pięć sekund przez wirowanie przed przeniesieniem 700 mikrolitrów próbki do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Po krótkim odwirowaniu odrzucić przepływowy płyn i przemyć próbkę dwa razy 500 mikrolitrami buforu płuczącego 2 w nowej kolumnie wirowej na bazie membrany krzemionkowej na każde płukanie, aby usunąć wszelkie ślady soli. Po drugim płukaniu ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej i po odrzuceniu przepływu przenieść kolumnę do nowej 1,5-mililitrowej probówki zbiorczej. Dodać 25 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do kolumny i inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed ponownym odwirowaniem próbki. Następnie przenieś 25-mikrolitrowy eluit zawierający mikroRNA do nowej mikroprobówki wirówkowej. W tym badaniu zbadano siedem mikroRNA, które uległy ekspresji u ludzi, a które były regulowane w górę w nerkach myszy z ostrym uszkodzeniem nerek. Stwierdzono, że poziomy sześciu mikroRNA były znacznie zwiększone w nerkach myszy z uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwienia w porównaniu z tymi u myszy pozorowanych przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, jak wykazano. Stężenie mocznika, azotu i kreatyniny w surowicy krwi oraz ostra martwica kanalików również uległy znacznemu zwiększeniu.

Biomarkery do diagnozowania IRI i specyficznego leczenia AKI pozostają niejasne. Mam nadzieję, że badania nad mikroRNA posuną się naprzód i przyczynią się do diagnozowania i leczenia AKI.