Name: Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj ilościową metodę wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki. Protokół wykorzystuje RT-qPCR do analizy ekspresji mikroRNA jako biomarkerów ostrego uszkodzenia nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorowi Nam Nguyenowi za redakcję szkicu tego rękopisu.

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi.
1. Model IRI
UWAGA: Uważnie monitoruj hipotermię, nawilżenie jelit i głębokość znieczulenia podczas całego zabiegu.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówkę wirówkową o pojemności 50 ml zawierającą bawełnę nasączoną izofluranem, podgrzewaną podkładkę chirurgiczną, szalkę Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), sterylne ostrze chirurgiczne i sterylne kleszczyki. Utrzymuj PBS na poziomie 37 °C. 
	UWAGA: Ten model IRI został wygenerowany przy użyciu samców myszy C57BL/6 (9 tygodni; 20–25 g) trzymanych w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę za pomocą izofluranu: stężenie indukcyjne 3%–5%, stężenie podtrzymujące 2%–3%, a stężenie podczas zaciskania 1%–1,5%. Aby zapobiec suchości oka podczas znieczulenia, nałóż maść okulistyczną na oczy. Potwierdź głębokość znieczulenia przez utratę odruchów. Znieczulenie wziewne ma tę zaletę, że czas można dostosować. Zabieg może zająć dużo czasu ze względu na złuszczanie się tkanki otaczającej nerkę. Jednak wadą znieczulenia wziewnego jest to, że temperatura ciała ma tendencję do spadku. Utrzymuj znieczulenie na wystarczającej głębokości, aby zapobiec reakcji na uszczypnięcie palca u nogi podczas zaciskania, unikając jednocześnie niepotrzebnie głębokiego znieczulenia.</li>
	<li>Zamontuj znieczuloną mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej na plecach, usuń włosy otaczające obszar nacięcia i zdezynfekuj skórę brzucha myszy za pomocą peelingu na bazie chlorheksydyny i 70% etanolu. Buprenorfinę podaje się podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc., 30 minut przed zabiegiem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry brzucha, mięśni i błony otrzewnej za pomocą ostrza chirurgicznego i kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego PBS delikatnie wypchnij jelito w kierunku lewej strony jamy pozabrzusznej, odsłaniając prawą nerkę i moczowód. Długi czas zabiegu może spowodować pooperacyjne uszkodzenie jelit. Dlatego lepiej jest operować bez usuwania jelit z jamy brzusznej, gdy można uzyskać pole widzenia. Unikaj wysuszania jelit. Suche waciki lub gaza mogą spowodować uszkodzenie jelit.</li>
	<li>Podnieś prawy moczowód za pomocą kleszczy kątowych. Dwukrotnie podwiązać prawy moczowód za pomocą szwów 4/0 z jedwabnym oplotem. Przeciąć między szwami, pozostawiając szew znajdujący się bliżej nerki na dłużej.</li>
	<li>Ostrożnie przytrzymaj pozostały szew, nie ciągnąc zbyt mocno, i tępo wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz wzdłuż nerki. Uzewnętrznienie nerki i przeprowadzenie zabiegu poza ustrojem zmniejsza ryzyko fizycznego uszkodzenia wątroby.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj naczynie krwionośne, inne niż tętnica nadnercza i żyła, które dostarcza krew do prawej nerki, a następnie podwiąż je lub przytnij. Gdy prawa nerka jest wystarczająco odłączona, podwiąż prawą tętnicę nerkową i żyłę za pomocą szwu z jedwabnym plecionym szwem 4/0. Zamiast szycia użyj klipsa hemostatycznego.</li>
		<li>Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego PBS delikatnie popchnij jelito w kierunku prawej strony jamy pozabrzusznej, aby odsłonić lewą nerkę, a następnie przykryj jelito zwilżoną serwetą, aby zapobiec jego wysuszeniu. Wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz wokół lewej nerki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj naczynie krwionośne, inne niż tętnica nadnercza i żyła, które dostarcza krew do lewej nerki, a następnie podwiąż je lub przytnij. Zacisnąć tętnicę nerkową i żyłę nerkową, aby wywołać niedokrwienie lewej nerki. Umieść klips hemostatyczny około 1 cm od nerki, aby uniknąć uszkodzenia miąższu nerki. Udane niedokrwienie można wizualnie potwierdzić poprzez stopniowe, równomierne ciemnienie nerki.</li>
	<li>Wróć do jamy brzusznej, uważając, aby uniknąć skrętu jelit; tymczasowo zamknij skórę brzucha i ułóż je, aby utrzymać wilgotne środowisko. Utrzymuj znieczulenie na wystarczającej głębokości, aby zapobiec reakcji na uszczypnięcie palca u nogi podczas zaciskania, unikając jednocześnie niepotrzebnie głębokiego znieczulenia. Czas zaciskania wynosi 25–45 min. Dłuższy czas zaciskania powoduje poważniejsze uszkodzenie nerek, ale także zwiększa długoterminową śmiertelność. Dostosuj, analizując wyniki patologii.</li>
	<li>Usuń zacisk po zakończeniu okresu niedokrwienia. Upewnij się, że poprawia się przepływ krwi, reperfuzja i kolor nerek. Upewnij się, że jelito nie jest skręcone przed zamknięciem skóry brzucha. Wkraplanić PBS dootrzewnowo jako suplement objętościowy, zanim brzuch zostanie zamknięty w dwóch warstwach. Zamknij skórę brzucha za pomocą nylonowych szwów 4-0. W przypadku dłuższych okresów usuwania nerek możliwość wystąpienia zrostów jelitowych można zmniejszyć poprzez oddzielne zamknięcie ściany brzucha i otrzewnej.</li>
	<li>Aby zminimalizować ryzyko infekcji pooperacyjnej, należy zastosować środek antyseptyczny (np. roztwór jodu/alkoholu) na obszar operacyjny. Buprenorfinę podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc. do momentu, gdy będzie to potrzebne.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek nerek
UWAGA: Ten film ma 45 minut zaciskania, pobierając nerki 24 godziny później.
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę 5% izofluranem i potwierdzić głębokość znieczulenia przez utratę odruchów.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry brzucha, mięśni i błony otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy. Pobrać krew z żyły głównej dolnej nakłutej igłą 27 G.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej ściany klatki piersiowej i wprowadź igłę 23 G do lewej komory. Potwierdź przepływ wsteczny. Wykonaj nacięcie w wątrobie i wstrzyknij 20 ml PBS. Gdy krew odpływa, wątroba zmienia kolor z czerwonego na różowy, potwierdzając, że wystarczająca ilość krwi została odsączona.</li>
	<li>Usuń lewą nerkę za pomocą kleszczy i nożyczek i umyj ją PBS na szalce Petriego. Usuń powięź nerkową za pomocą kleszczy, uważając, aby nie wysuszyć nerki.</li>
	<li>Przetnij nerkę na pół i użyj jednej połowy do histopatologii, a drugiej połowy do następnego kroku. Omijaj miednicę nerkową i zbierz 30 mg nerki. Przed użyciem przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie miRNA z próbek nerek
UWAGA: Tutaj próbki nerek o wadze 30 mg są homogenizowane za pomocą homogenizatora szklanego i systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki. Następnie miRNA z próbki nerki izoluje się za pomocą kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 lub 2,0 ml, 100% etanol, chloroform, homogenizator szklany, lód, system rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki<klasa sup="xref">9, kolumny wirujące na bazie membrany krzemionkowej<klasa sup="xref">9, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania zawierający guanidynę i etanol (bufor do płukania 1) oraz bufor do płukania zawierający etanol (bufor do płukania 2).</li>
	<li>Umieścić próbkę nerki o stężeniu 30 mg w szklanym homogenizatorze i dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Wykonaj ten krok na lodzie, ponieważ tkanka ulega denaturacji pod wpływem ciepła.</li>
	<li>Homogenizować próbkę nerki, powoli dociskając tłuczek do próbki, przekręcając ją. Powtórz ten proces kilkadziesiąt razy na lodzie, aż próbka nerki całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny. Gdy miRNA nie zostanie uzyskane w kolejnych pomiarach, jest to prawdopodobnie spowodowane niewystarczającym rozpuszczeniem.</li>
	<li>W celu dalszej homogenizacji przenieść homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Odwirować to w temperaturze 14 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść homogenizowany lizat do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 140 μl chloroformu do homogenizowanego lizatu i szczelnie zamknąć probówkę. Mieszaj probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund.</li>
	<li>Próbki należy inkubować przez 2–3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować je w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (zwykle 300 μl) do nowej probówki do mikrowirówki bez naruszania osadu i dodać 1,5 objętości (zwykle 450 μl) 100% etanolu. Mieszać próbkę przez wirowanie przez 5 sekund.</li>
	<li>Pobrać pipetę do 700 μl próbki do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij pokrywę kolumny i odwiruj przy 15 000 × g przez 15 sekund. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby dokładnie przepłukać próbkę. Zamknij pokrywę kolumny i odwiruj ją przy 15 000 × g przez 15 s. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej na bazie membrany krzemionkowej, aby usunąć wszelkie ślady soli. Zamknij pokrywę kolumny i odwiruj przy 15 000 × g przez 15 s. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.
	<ol>
		<li>Powtórz krok 3.11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej o masie 15 000 × g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić przepływający płyn z probówki zbiorczej.</li>
	<li>Umieść kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Przenieś 25 μl wody wolnej od RNaz do kolumny i zamknij nasadkę kolumny. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie odwirować ją w temperaturze 15 000 × g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść 25 μl eluatu zawierającego miRNA do nowej probówki do mikrowirówki. Ponieważ miRNA ulega degradacji przez wielokrotne rozpuszczanie, zaleca się dozowanie próbki do 2 lub 3 probówek. Przed użyciem należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Odwrotna transkrypcja miRNA
UWAGA: Tutaj 1,0 μg wyizolowanego RNA jest transkrybowane wstecznie przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i starterów oligo-dT.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; 8-dołkowe probówki paskowe; Woda wolna od RNaz; lód; 10x Mieszanka Kwasów Nukleinowych zawierająca deoksynukleotydy, trifosforany rybonukleotydów i startery oligo-dT; mieszanina polimerazy poli(A) i odwrotnej transkryptazy; i bufor aktywujący, w tym Mg2+, dezoksyrybonukleotydy, startery oligo-dT i losowe startery10.</li>
	<li>Przygotuj roztwór mieszaniny głównej zawierający 2,0 μl 10x mieszaniny kwasów nukleinowych, 2,0 μl mieszaniny polimerazy poli(A) i odwrotnej transkryptazy oraz 4,0 μl 5x buforu aktywującego, w tym Mg2+, dezoksyrybonukleotydy, startery oligo-dT i losowe startery, w sumie 8,0 μl na probówkę.</li>
	<li>Dozować 8,0 μl roztworu mieszanki głównej do każdej probówki.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 1,0 μg wyizolowanych miRNA oczyszczonych z próbki nerki.</li>
	<li>Dodać wodę wolną od RNaz do każdej probówki, w sumie 20 μl. Dokładnie wymieszać pipetując i odwirować przy 1 500 x g przez 15 sekund.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie bezpośrednio inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Ten krok można wykonać w termocyklerze.</li>
	<li>Przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej i rozcieńcz 10 razy (1:10) wodą wolną od RNaz.</li>
	<li>Rozcieńczone cDNA należy przechowywać przez krótki czas na lodzie i przez długi czas w temperaturze -80 °C przed użyciem.</li>
</ol>
5. qRT-PCR miRNA
UWAGA: qRT-PCR miRNA jest wykonywany przy użyciu barwnika interkalacyjnego. Zastosowano tu startery dla U6 small nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p i miRNA-574-5p.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, 96-dołkowe płytki reakcyjne do qRT-PCR, folia adhezyjna do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, startery specyficzne dla miRNA, PCR Master Mix składający się z polimerazy DNA Taq, buforu PCR, deoksynukleotydów i uniwersalnych starterów10 oraz instrument do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą 12,5 μl 2x PCR Master Mix, 2,5 μl każdego startera miRNA (5 μM) rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz i 1,25 μl 10x uniwersalnych starterów dla każdej studzienki.</li>
	<li>Dozować 22,5 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodaj 2,5 μl matrycowego cDNA do każdej studzienki.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Następnie odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 30 s.</li>
	<li>Korzystając z przyrządu i oprogramowania do PCR w czasie rzeczywistym, uruchom program cykliczny PCR w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Umieść płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Przypisz nazwę do próbki i docelowego miRNA w każdym dołku za pomocą oprogramowania Real-Time PCR.</li>
		<li>Wprowadź następujące warunki cykliczne PCR w oprogramowaniu do PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami: preinkubacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane qRT-PCR za pomocą oprogramowania urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Sprawdź, czy nie występują reakcje niespecyficzne. Przeanalizuj krzywą dysocjacji lub krzywą topnienia, aby potwierdzić, że nie wystąpiło wzmocnienie inne niż zamierzone.
	<ol>
		<li>Normalizuj poziom ekspresji docelowych miRNA do RNU-6 jako kontroli endogennej. Oblicz względny poziom ekspresji docelowych miRNA za pomocą metody 2−ΔΔCT 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kelly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+much+more+than+a+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminas+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: much more than a kidney disease.</a> Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).</li>
<li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+micromarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Noninvasive micromarkers.</a> Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).</li>
<li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease%3A+Background%2C+Mechanisms%2C+and+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+validation+of+extracellular%2Fcirculating+microRNAs+during+idiopathic+pulmonary+fibrosis+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression.</a> Gene. 562 (1), 138-144 (2015).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+urinary+cell-free+microRNA-214+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+in+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer.</a> Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).</li>
<li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+peritoneal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinial+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).</li>
<li>Ichii, O., Horino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+associated+with+the+development+of+kidney+diseases+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+miRNA-17-5p%2C+miRNA-21+and+miRNA-106a+level+during+rat+kidney+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury.</a> Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).</li>
<li>Saikumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+circulation%2C+and+excretion+profile+of+microRNA-21%2C+-155%2C+and+-18a+following+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%3A+an+Official+Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury.</a> Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Li, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+in+the+pathogenesis+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury.</a> Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression+profile+of+non-coding+RNAs+involved+in+ischemia%2Freperfusion-induced+acute+kidney+injury+in+mice+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing.</a> Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profile+by+next-generation+sequencing+in+a+novel+rat+model+of+contrast-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury.</a> Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).</li>
<li>Colbert, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model-specific+role+of+microRNA-223+as+a+mediator+of+kidney+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).</li>
<li>Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+body+temperature+in+a+rat+model+of+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).</li>
<li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59(2005).</li>
<li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Confirming microarray data--is it really necessary.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Korzystając z protokołu przedstawionego w tym manuskrypcie, miRNA z nerki myszy IRI zostały pomyślnie oczyszczone i wykryte za pomocą qRT-PCR. Punkty krytyczne procedury indukującej IRI w protokole obejmują dokładne monitorowanie temperatury ciała i stężeń znieczulenia, o których wiadomo, że wpływają na AKI20. Zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia wizualne potwierdzenie, czy osiągnięto niedokrwienie-reperfuzję. Istnieją jednak pewne ograniczenia tego modelu IRI. Wydłużenie czasu zacisku w ce...

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) nerki stanowi jeden z głównych czynników ryzyka rozwoju ostrego uszkodzenia nerek (AKI)1. AKI odgrywa znaczącą rolę w rokowaniu pacjentów, ale nie ustalono specyficznych terapii i wczesnych biomarkerów diagnostycznych.
MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA z około 18-25 zasadami. miRNA są stabilne w płynach ustrojowych, a ich sekwencje są wysoce konserwatywne wśród zwierząt2. MiRNA regulują ekspresję wielu białek poprzez tysiące celów, wpływając w ten sposób na różne szlaki sygnałowe2,3,4,5,6,7,8. W ostatnich latach doniesiono, że miRNA biorą udział w różnych stanach chorobowych i są skutecznymi biomarkerami do wczesnej diagnozy wielu chorób.
Ogólnym celem tego protokołu jest skuteczne oczyszczanie i wykrywanie miRNA w nerkach mysiego modelu AKI indukowanego przez IRI. Ten model IRI jest szeroko stosowanym modelem AKI i zwłóknienia nerek. Do zalet modelu IRI należy możliwość wizualnego potwierdzenia, czy osiągnięto niedokrwienie-reperfuzję i określenie dokładnego czasu wystąpienia AKI. Jednak czas trwania zacisku, który jest wystarczająco długi, aby spowodować szerokie uszkodzenie rurek, wiąże się z wysoką śmiertelnością, podczas gdy krótki czas trwania zacisku nie powoduje uszkodzenia przewodów rurowych, co powoduje dużą zmienność progresji uszkodzeń rurek w tym eksperymentalnym modelu. W porównaniu z obustronnym modelem zaciskania, prawa tkanka nefrektomii pobrana w jednostronnym modelu IRI nerki działa jako kontrola i zapewnia niewydolność nerek.
Próbka nerki jest rozgnieżdżana za pomocą szklanego homogenizatora, w którym białka i kwasy nukleinowe są rozdzielane, a DNA i RNA są rozdzielane9. Całkowite RNA, w tym miRNA, jest oczyszczane z próbki nerki za pomocą kolumny spinowej opartej na membranie krzemionkowej9. Następnie przeprowadza się syntezę cDNA (odwrotną transkrypcję) z całkowitego RNA przy użyciu polimerazy poli(A) i starterów oligo-dT10. Wreszcie, ekspresja miRNA jest oznaczana przez qRT-PCR przy użyciu interkalacyjnego barwnika 10. qRT-PCR może dokładniej określić ilościowo ekspresję genów w porównaniu z PCR objętości amplifikacji w punktach końcowych. qRT-PCR mierzy wysokie stężenia i charakteryzuje się szerokim zakresem dynamiki, co pozwala na dokładne oznaczanie ilościowe, które zależy od liczby cykli. Wcześniejsze badania wykazały, że proste procesy mogą być wykorzystane do skutecznego oczyszczania i wykrywania miRNA w tkankach8,9,10. Opisano w tym protokole metody syntezy cDNA (odwrotna transkrypcja) i wykrywania ekspresji miRNA za pomocą qRT-PCR przy użyciu barwnika interkalacyjnego, które wykazują wysoką dokładność i czułość10.
Dodatkowo, ten protokół jest prosty i zapewnia spójne wyniki między laboratoriami. Dlatego protokół ten jest przydatny w badaniach, które wymagają bardzo dokładnego i czułego wykrywania miRNA w nerkach myszy AKI.

<table><tbody><tr><td>Pęseta stożkowa z wygiętą końcówką bez haczyka</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-47</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>bufor myjący 1</td></tr><tr><td>Bufor RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>mycie 2</td></tr><tr><td>myszy C57B6</td><td>SLC</td><td>nie przypisuje</td><td></td></tr><tr><td>kleszcza z zębami</td><td>Kleszcz Natsume Seisakusho</td><td>MA-49</td><td></td></tr><tr><td>bez zębów</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-48-1</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy hemostatyczne</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN&minus; 353</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR</td><td>96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific 4311971</td><td></td><td>do 96-dołkowej płytki reakcyjnej</td></tr><tr><td>miRNA-132-3p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00003458</td><td>5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG</td></tr><tr><td>starter miRNA-17-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00029274</td><td>5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG</td></tr><tr><td>miRNA-18a-5p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00031514</td><td>5'UAAGGUGCAUAGUGCAGAGAUAG</td></tr><tr><td>miRNA-212-3p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00003815</td><td>5'UAACAGUCUCCAGAGUCACGGCC</td></tr><tr><td>miRNA-21a-5p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'UGUCAGUUGUCAAAUACCCCA</td></tr><tr><td>miRNA-574-5p starter</td><td>Qiagen</td><td>MS00043617</td><td>5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej</td></tr><tr><td>miScript II RT zestaw</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Zielony zestaw PCR</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>QIA niszczarka</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>system rozdrabniania biopolimerów w mikrowirówce kolumna wirowa</td></tr><tr><td>QIAzol Odczynnik do lizy</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny</td></tr><tr><td>System QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Oprogramowanie w wersji 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>oprogramowanie do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Starter RNU6-2</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>nieujawnione</td></tr><tr><td>nożyczki chirurgiczne</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>B-2</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do klipsów naczyniowych</td><td>VITALITEC</td><td>1621420</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa metoda wykrywania mikrorna w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MikroRNA (miRNA) są zaangażowane w różne stany chorobowe i są skutecznymi biomarkerami do wczesnej diagnozy chorób i leczenia u myszy. Jednak standardowe protokoły oczyszczania miRNA i wykrywania ich ekspresji w nerkach myszy z ostrym uszkodzeniem nerek (AKI) nie zostały dobrze ugruntowane. W ramach tego badania opracowano skuteczny i prosty protokół oczyszczania i ilościowego oznaczania miRNA w nerkach mysiego modelu AKI indukowanego przez niedokrwienie nerek-reperfuzję przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Protokół ten składa się z pięciu etapów: 1) indukcji AKI przez niedokrwienie nerek-reperfuzję, 2) pobrania nerek, 3) oczyszczenia całkowitego RNA, w tym miRNA, z nerek, 4) syntezy cDNA przez odwrotną transkrypcję miRNA oraz 5) qRT-PCR w celu wykrycia ekspresji miRNA. Korzystając z tego protokołu, można wygenerować model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek z łagodnymi lub ciężkimi postaciami AKI. Dodatkowo, jeśli procedura jest przestrzegana prawidłowo, można uzyskać spójny model AKI z minimalnymi różnicami indywidualnymi. Ten test qRT-PCR wykazuje bardzo szeroki zakres dynamiki i umożliwia dyskryminację dojrzałych miRNA, które można dokładnie określić ilościowo z wysoką swoistością. Protokół ten może być wykorzystany do badania profilu ekspresji miRNA w nerkach AKI.

W niniejszej pracy zbadano profil ekspresji miRNA u myszy z AKI. Profil ekspresji miRNA był analizowany w różnych organach i tkankach myszy. MiRNA są istotnymi regulatorami potranskrypcyjnymi i są obecnie szeroko badane w celu charakterystyki wielu chorób, w tym AKI. MiRNA mają potencjał, aby pomóc w wyjaśnieniu stanów patologicznych i znaleźć zastosowanie w leczeniu AKI12. Głównymi przyczynami AKI są IRI, uszkodzenia nefrotoksyczne oraz sepsa. IRI nerek stanowi jeden z głównych czynników ryzyka r...

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Zmieniona ekspresja mikroRNA w AKI może być przydatna do biomarkerów i terapii. Protokół ten jest prosty i zapewnia stałe wyniki między laboratoriami. IRI nerki stanowi jeden z głównych czynników ryzyka AKI. Kwantyfikacja mikroRNA, które są zmieniane przez IRI, prowadzi do diagnozy. MikroRNA oczyszczone z próbki nerki nakłada się na inny układ. Uważnie monitoruj hipotermię, nawilżenie jelit i głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu. Dzieje się tak, ponieważ istnieje wiele technik manualnych, do których można się przyzwyczaić.[Narrator] Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca u nogi, umieść znieczuloną mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej. Po wykonaniu nacięcia brzucha w linii środkowej użyj bawełnianego wacika zwilżonego PBS, aby delikatnie wypchnąć jelito na lewą stronę dodatkowej jamy brzusznej, aby odsłonić prawą nerkę i moczowód i użyj kleszczy pod kątem, aby podnieść prawy moczowód. Podwiązać moczowód w dwóch miejscach za pomocą jedwabnych plecionych szwów 4-0, pozostawiając dłuższe wiązania na szew, który jest bliżej nerki, i przeciąć między szwami. Ostrożnie trzymając pozostały szew, tępo wypreparuj tkankę łączną i tłuszcz wzdłuż nerki i zidentyfikuj naczynie krwionośne, które nie jest tętnicami nerkowymi lub żyłami, które dostarczają krew do prawej nerki. Podwiązać naczynie, a gdy prawa nerka zostanie wystarczająco odłączona, podwiązać żyłę nerkową i tętnicę. Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego PBS delikatnie popchnij jelito w kierunku prawej strony dodatkowej jamy brzusznej, aby odsłonić lewą nerkę i przykryj jelito zwilżoną zasłoną. Po przygotowaniu lewej nerki, jak pokazano, zaciśnij tętnicę nerkową i żyłę w odległości jednego centymetra od nerki, aby wywołać niedokrwienie lewej nerki. Udane niedokrwienie można wizualnie potwierdzić poprzez stopniowe, równomierne ciemnienie tkanki nerkowej. Po potwierdzeniu niedokrwienia należy przywrócić tkankę jelitową do jamy brzusznej, uważając, aby uniknąć skrętu jelit, a także tymczasowo zamknąć i ułożyć skórę brzucha. Po 25 do 45 minutach zdejmij zacisk i upewnij się, że poprawia się reperfuzja przepływu krwi i kolor nerek. Po upewnieniu się, że jelito nie jest skręcone, wkroplić PBS dootrzewnowe i zamknąć mięśnie brzucha i skórę w dwóch warstwach za pomocą nylonowych szwów 4-0. 24 godziny po indukcji urazu niedokrwiennego ponownie otwórz nacięcie linii środkowej i użyj igły o rozmiarze 27, aby pobrać krew z żyły głównej dolnej. Wykonaj nacięcie w linii środkowej w ścianie klatki piersiowej i wprowadź igłę o rozmiarze 23 do lewej komory. Po potwierdzeniu przepływu zwrotnego do igły należy wykonać nacięcie w prawym płacie wątroby i wstrzyknąć 20 mililitrów PBS. Wątroba zmieni kolor na czerwony na różowy, potwierdzając, że odsączono wystarczającą ilość krwi. Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć lewą nerkę i umyć wyciętą tkankę w naczyniu z PBS. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć powięź nerkową bez wysuszania nerki i przeciąć nerkę na pół wzdłuż pionowej linii środkowej. W celu oczyszczenia mikroRNA umieść 30 miligramów zamrożonej próbki nerki w szklanym homogenizatorze zawierającym 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenyloguanidyny na lodzie i powoli i wielokrotnie przekręcaj tłuczek, aby całkowicie homogenizować próbkę. Gdy tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana, przenieś homogenizowany lizat do systemu rozdrabniania biopolimerów w kolumnie wirowej mikrowirówki w dwumililitrowej probówce zbiorczej i zbierz próbkę na dno probówki przez odwirowanie. Przenieść lizat do nowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 140 mikrolitrów chloroformu i mieszać probówkę przez odwrócenie przez 15 sekund z mocno dokręconą nakrętką. Po dwu- lub trzyminutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, należy osadzać próbkę przez odwirowanie i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 1,5 raza objętość 100% etanolu bez naruszania osadu. Mieszać próbkę przez pięć sekund przez wirowanie przed przeniesieniem 700 mikrolitrów próbki do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Po krótkim odwirowaniu odrzucić przepływowy płyn i przemyć próbkę dwa razy 500 mikrolitrami buforu płuczącego 2 w nowej kolumnie wirowej na bazie membrany krzemionkowej na każde płukanie, aby usunąć wszelkie ślady soli. Po drugim płukaniu ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej i po odrzuceniu przepływu przenieść kolumnę do nowej 1,5-mililitrowej probówki zbiorczej. Dodać 25 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do kolumny i inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed ponownym odwirowaniem próbki. Następnie przenieś 25-mikrolitrowy eluit zawierający mikroRNA do nowej mikroprobówki wirówkowej. W tym badaniu zbadano siedem mikroRNA, które uległy ekspresji u ludzi, a które były regulowane w górę w nerkach myszy z ostrym uszkodzeniem nerek. Stwierdzono, że poziomy sześciu mikroRNA były znacznie zwiększone w nerkach myszy z uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwienia w porównaniu z tymi u myszy pozorowanych przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, jak wykazano. Stężenie mocznika, azotu i kreatyniny w surowicy krwi oraz ostra martwica kanalików również uległy znacznemu zwiększeniu.Biomarkery do diagnozowania IRI i specyficznego leczenia AKI pozostają niejasne. Mam nadzieję, że badania nad mikroRNA posuną się naprzód i przyczynią się do diagnozowania i leczenia AKI.

a-quantitative-detection-method-for-micrornas-kidney-an-ischemic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Mysi model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego nerek opisany tutaj składa się z prawej nefrektomii, która zapewnia tkankę kontrolną i zaciskania lewej szypułki nerki w celu wywołania niedokrwienia, które powoduje ostre uszkodzenie nerek. Model ten wykorzystuje laparotomię w linii środkowej, w której wszystkie kroki są wykonywane przez jedno nacięcie.

Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienia nerek: mysi model urazu i regeneracji

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

W tym artykule przedstawiono model niedokrwiennej CKD z wykorzystaniem jednostronnego IRI nerki z kontralateralną nefrektomią wykonaną dzień przed pobraniem próbki; protokół ten umożliwia ocenę funkcjonalną opartą na surowicy, wysoką przeżywalność oraz powtarzalną patologię PREWKinek w ciągu 28 i 42 dni, zapewniając wszechstronną platformę do badań mechanistycznych i interwencyjnych.

Model myszy przejścia z ostrej do przewlekłej choroby nerek wywołanego niedokrwieniem nerek lub uszkodzeniem reperfuzyjnym

Do monitorowania zmian przepływu krwi mikronaczyniowej nerki podczas jednostronnej niedokrwienności nerki po resekcji prawej nerki u myszy zastosowano laserowy system obrazowania z kontrastem plamkowym (plamkowatym).

Perfuzja mikronaczyniowa monitorowana za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym podczas uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji u myszy

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Poznaj ilościową metodę wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki. Protokół wykorzystuje RT-qPCR do analizy ekspresji mikroRNA jako biomarkerów ostrego uszkodzenia nerek.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Przeglądaj więcej filmów