Charakterystyka makroreologiczna śluzu grabi skrzelowej w tołpyga, Hypophthalmichthys molitrix
10 lipca 2020
Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania charakterystyki reologicznej śluzu znajdującego się na grabiach skrzelowych (GR) karasia srebrzystego. Właściwości lepkosprężyste śluzu GR, uzyskane przez pomiar modułów lepkości, magazynowania i strat, są oceniane dla pozornej granicy plastyczności, aby zrozumieć mechanizm podawania filtra w GR.
Znaczenie tego protokołu polega na tym, że pozwala on na dokładną charakterystykę reologiczną nienewtonowskich płynów biologicznych, takich jak śluz, zwłaszcza gdy dostępne są tylko bardzo małe objętości próbek. Technika ta ułatwia scharakteryzowanie pozornej granicy plastyczności i lepkosprężystości płynów biologicznych o złożonej strukturze, takich jak śluz grabienia skrzeli. Metoda ta umożliwia oszacowanie granicy plastyczności śluzu grabiarza skrzelowego oraz ułatwia charakterystykę reologiczną i opracowanie protokołu podobnych płynów biologicznych, takich jak wydzieliny ludzkie, zwierzęce i roślinne.
Procedurę z Kartikiem Bulusu zademonstruje Samantha Racan, doktorantka z naszego laboratorium. Aby przygotować około dwóch mililitrów 100 miligramów na mililitr stężonego roztworu śluzu rybiego, wykonaj seryjne rozcieńczanie dwóch mililitrów o stężeniu 400 miligramów na mililitr, dodając dwukrotnie wodę dejonizowaną w stosunku jeden do dwóch. Umieścić fiolkę z roztworem śluzu na wytrząsarce, aż roztwór zostanie odpowiednio zhomogenizowany i wszelkie zbrylenia się cząstek śluzu zostaną złagodzone.
Aby skalibrować reometr, uruchom oprogramowanie sterujące reometrem i wybierz zakładki kalibracji i przyrządu. Kliknij przycisk kalibracja i kalibracja, aby upewnić się, że wartości kalibracji mieszczą się w granicach 10% od siebie, a następnie kliknij przycisk akceptuj. Obróć wałek na górze reometru, aby zainstalować geometrię kąta stożka.
Oprogramowanie wykryje średnicę 40 milimetrów, jeden stopień, minutę zero, geometrię kąta stożka 11 sekund. Aby przeprowadzić kalibrację geometrii reometru, kliknij przycisk Kalibracja w obszarze bezwładność, a następnie kliknij przycisk Kalibruj. Kliknij przycisk Akceptuj, aby zaakceptować kalibrację.
Kliknij opcję Kalibracja w obszarze Tarcie i kliknij przycisk Kalibruj. Kliknij przycisk Akceptuj, aby zaakceptować kalibrację. Wartości kalibracji bezwładności geometrii i tarcia powinny być rejestrowane w odpowiednich jednostkach.
Aby przeprowadzić inicjalizację zerowej przerwy, kliknij przycisk Przerwa w opcjach. W wyskakującym okienku ustaw siłę osiową na jeden niuton i kliknij OK, a następnie kliknij ikonę zerowej przerwy. Inicjalizacja jest zakończona, gdy siła osiowa doświadczana przez geometrię staje się większa lub równa jednemu Newtonowi, gdy styka się z płytką Peltiera.
Aby upewnić się, że odstęp reometru jest wyzerowany tak, aby jego pozycja odniesienia była dokładna, użyj strzałek w górę i w dół, aby podnieść geometrię do dowolnej wysokości. Ekran sterowania na przyrządzie reometrycznym i panel sterowania oprogramowania sterującego przyrządu reometru będą wyświetlać wysokość szczeliny. Aby przeprowadzić eksperyment reologiczny i liniowy zakres lepkosprężystości interesującego nas roztworu śluzu, należy załadować około 300 mikrolitrów roztworu śluzu rybiego do jednomililitrowej końcówki pipety i załadować roztwór na płytkę Peltiera.
Naciśnij ikonę przejścia do przycięcia odstępu, aby opuścić geometrię na płytkę Peltiera. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar roztworu śluzu, przykładając małą prędkość kątową do silnika, a następnie klikaj ikony zatrzymania i stosowania, aż wartość momentu obrotowego osiągnie minimum. Aby przeprowadzić eksperymenty z amplitudą oscylacji, w menu procedur w zakładce eksperymenty należy ustawić oscylację i amplitudę oraz ustawić temperaturę na 22 stopnie Celsjusza.
Ustaw czas namaczania na 120 sekund i sprawdź temperaturę. Ustaw częstotliwość na jeden herc, moment obrotowy na 10 do 10 000 mikroniutonometrów, a punkty na dekadę na 10. Następnie kliknij ikonę wstawiania zduplikowanego kroku.
Zmień amplitudę na częstotliwość. Ustaw temperaturę na 22 stopnie Celsjusza i ustaw czas namaczania na zero sekund. Ustaw procent odkształcenia na jeden.
W menu przemiatania logarytmicznego ustaw częstotliwość na 20 do 1 herca, a liczbę punktów na dekadę na 10. Aby skonfigurować procedurę zamiatania przepływu, kliknij ikonę wstawiania zduplikowanego kroku, a następnie zmień oscylację na przepływ i wybierz zamiatanie, aby ustawić temperaturę na 22 stopnie Celsjusza i ustawić czas wygrzewania na zero sekund. Ustaw szybkość ścinania na 1 do 10 000 na sekundę, a punkty na dekadę na 10 i zaznacz pole wykrywania w stanie ustalonym.
Naciśnij ikonę przejścia do szczeliny geometrycznej, aby obniżyć geometrię do wstępnie ustawionej odpowiedniej szczeliny dla określonej geometrii, a następnie kliknij start w oprogramowaniu instrumentu i obserwuj ruch geometrii stożka. Wykres w czasie rzeczywistym, który informuje o utracie modułów przechowywania, zostanie wygenerowany przez reometr w oknie głównym po osiągnięciu czasu wygrzewania temperatury. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać zakładkę zmiennych wykresu i ustaw oś x wykresu na procent odkształcenia oscylacyjnego, aby wyświetlić interesujące Cię dane.
Aby wyświetlić dane dotyczące częstotliwości kątowej, kliknij prawym przyciskiem myszy przemiatanie częstotliwości i wybierz polecenie Wyślij do nowego wykresu. Aby wyświetlić dane dotyczące lepkości pozornej w funkcji naprężenia ścinającego w czasie rzeczywistym, kliknij prawym przyciskiem myszy przemiatanie przepływu i wybierz wyślij do nowego wykresu, a następnie zapisz plik zawierający zarówno procedurę eksperymentalną, jak i wyniki, w natywnym formacie pliku oprogramowania sterującego reometrem po zakończeniu eksperymentu. W celu analizy graficznej wyeksportuj dane reologiczne śluzu do arkusza kalkulacyjnego i uruchom dodatkowe kody dla pozornej lepkości dla różnych szybkości odkształcania przy ścinaniu i modułu strat, modułu przechowywania i kąta fazowego dla różnych naprężeń oscylacyjnych, aby wygenerować wykresy wyników.
Jak zaobserwowano w danych amplitudy oscylacji dynamicznych, moduł magazynowania stężenia 200 miligramów na mililitr zmniejszył się i przekroczył moduł strat w zakresie naprężeń. Dane dotyczące kąta fazowego dla tego stężenia wykazały stałe przejście do lepkosprężystej cieczy z przejściowym obszarem granic plastyczności. Dane dotyczące modułu dla stężenia 400 miligramów na mililitr wykazały zjawisko plastyczności z punktem przecięcia między modułami przechowywania i straty, które wystąpiło przy pozornej granicy plastyczności około 0,27 paskala.
Dane dotyczące kąta fazowego dla stężenia 400 miligramów na mililitr wykazały ostre przejście do lepkosprężystej cieczy z punktem skrzyżowania na poziomie około 0,27 paskala. Jak zaobserwowano w danych dotyczących stałej szybkości ścinania, stężenie 100 miligramów na mililitr wykazywało przeważnie stałą lepkość poza wyróżnionymi obszarami ograniczeń instrumentu, znikomy płaski obszar i zachowanie podobne do płynu Newtona. Stężenie 200 miligramów na mililitr wykazało zachowanie nienewtonowskie ze wzrostem szybkości ścinania i skłonnością do ustępowania z wyraźnym płaskim obszarem.
Stężenie 400 miligramów na mililitr jest najbliższe składowi śluzu skrzeli grabi, wykazując wyraźną zmianę stanu śluzu z żelowego na płyn rozrzedzający ścinanie po uzyskaniu około 0,27 paskala. Jak opisano w manuskrypcie protokołu, ważne jest, aby określić procentową wartość odkształcenia oscylacyjnego w liniowym reżimie lepkosprężystym śluzu grabiarza skrzelowego przed uruchomieniem dynamicznych przemiatania. Nasz protokół może być wykorzystany do ustalenia pozornej granicy plastyczności lepkich i żelopodobnych płynów biologicznych i może być rozszerzony o testy sczepiania i odrywania w celu pełnej charakterystyki przyczepności materiałów podobnych do śluzu.
Protokół ten toruje drogę do badań hydrodynamicznych zasilania filtrów materiałami podobnymi do śluzu, tworzenia modeli analitycznych oraz rozwoju technologii przepływu krzyżowego i filtracji membranowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę reologicznej charakterystyki śluzu z tyczek skrzelowych karpia srebrzystego. Ocenia on właściwości wiskoelastyczne śluzu z tyczek skrzelowych w celu zrozumienia mechanizmu żerowania filtracyjnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Reologia
Wstęp
- Charakterystyka nienewtonowskich płynów biologicznych jest kluczowa dla zrozumienia ich funkcji.
- Śluz z sit rakiowych odgrywa istotną rolę w mechanizmie żywienia karasia srebrzystego.
- W przypadku małych objętości próbek niezbędne są dokładne techniki pomiarowe.
- Metodę tę można zastosować do różnych płynów biologicznych.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę szacowania granicy plastyczności i lepkosprężystości śluzu z rakek skrzelowych.
- Aby ułatwić charakterystykę reologiczną podobnych płynów biologicznych.
- Aby pogłębić zrozumienie mechanizmów filtracyjnego odżywiania się organizmów wodnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie stężonego roztworu śluzu rybiego poprzez rozcieńczanie seryjne.
- Homogenizacja roztworu śluzu przy użyciu wytrząsarki.
- Pomiar lepkości oraz modułów magazynowania i strat.
- Ocena pozornego granicznego naprężenia ścinania śluzu.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia dokładną charakterystykę reologiczną śluzu z sit żebrowych skrzeli.
- Właściwości wiskoelastyczne zostały pomyślnie zmierzone przy użyciu niewielkich objętości próbek.
- Metodę można dostosować do innych płynów biologicznych.
- Skutecznie oszacowano naprężenie graniczne.
Wnioski
- Metoda ta jest cenna w badaniach nienewtonowskich płynów biologicznych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie właściwości śluzu w procesie filtracyjnego odżywiania.
- Protokół ten można zastosować do różnych wydzielin biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie właściwości reologicznych płynów biologicznych, takich jak śluz, ma wartość prognostyczną w modelowaniu wydajności filtracji oraz mechanizmów adhezji w zastosowaniach biofarmaceutycznych. Charakterystyka granicy płynięcia oraz zachowania wiskoelastycznego umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka podczas oceny systemów dostarczania leków przez błony śluzowe lub bioinspirowanych technologii filtracji. Niniejszy protokół wspiera wczesny etap walidacji celu poprzez ustanowienie relacji struktura-funkcja w złożonych płynach biologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów adhezji i transportu cząstek zapośredniczonych przez śluz, które mają znaczenie dla funkcji bariery śluzówkowej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych danych dotyczących naprężenia granicznego i modułu, co pozwala na weryfikację hipotez dotyczących filtracji zapośredniczonej przez glikoproteiny.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Dostarcza standaryzowanych odczytów reologicznych (lepkość, moduły magazynujący/strat), umożliwiających porównywanie formulacji opartych na mucynach w różnych stężeniach.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalne protokoły charakterystyki biologicznych płynów o małej objętości z wykorzystaniem reometrii rotacyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ekstrapolację zachowania śluzu na wydzieliny ludzkie, zwierzęce lub roślinne w celu modelowania biodostępności międzygatunkowej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia adaptację protokołu dla testów adhezji i odrywania (tack/peel assays) w celu oceny właściwości adhezyjnych błony śluzowej w systemach dostarczania leków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których charakterystyka biofizyczna płynów biologicznych dostarcza informacji niezbędnych do wyboru celu oraz opracowania projektu formulacji.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób właściwości strukturalne śluzu wpływają na wychwytywanie i translokację cząstek w analogach organizmów filtrujących.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie analizy poprzez znormalizowane pomiary oscylacyjne i przepływowe w celu wykrycia punktów granicznych oraz zachowania rozrzedzania ścinaniem.
- Analityka: Generuje dane dotyczące lepkości pozornej, punktu przecięcia modułów oraz kąta fazowego w celu porównania stanów wiskoelastycznych podczas ścinania.
- Badania translacyjne: Łączy reologię śluzu ryb z ssaczymi systemami śluzowymi poprzez wspólne nienewtonowskie zachowanie rozrzedzania ścinaniem.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do charakteryzacji biologicznych produktów wydzielniczych, mucyn lub hydrożelowych nośników leków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie adhezji i transportu zapośredniczonego przez śluz dzięki określaniu granicy płynięcia i profilowaniu wiskoelastycznemu.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane etapy przygotowania próbek, kalibracji i pomiarów zapewniają powtarzalność wyników w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad celami śluzówkowymi poprzez ilościowe określenie właściwości bariery płynów biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację systemów dostarczania z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o progi penetracji i adhezji w śluzie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi reometru, jego kalibracji oraz interpretacji danych lepkosprężystych.
- Metoda zależy od dostępności reometru rotacyjnego z geometrią stożek-płytka i kontrolą temperatury.
- Konieczna jest standaryzacja procedur ekstrakcji, rozcieńczania i homogenizacji śluzu pomiędzy zespołami.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych wymaga walidacji progów granicy płynięcia oraz liniowych zakresów lepkosprężystości.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czułość przy małych próbkach oraz możliwość zakłóceń spowodowanych przez cząstki w surowym śluzie.
