Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

Metoda ta umożliwia zapewnienie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z szerokim zakresem stanów patologicznych, takich jak zwłóknienie nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia profilowanie ekspresji mikroRNA z dużą dokładnością i czułością dzięki zastosowaniu prostego procesu, który oszczędza czas i zapobiega błędom technicznym. Aby wykonać pozorowaną operację, użyj nożyczek chirurgicznych i pęsety, aby wykonać nacięcie w skórze na brzuchu i przeciąć mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.

Zwilż dwa bawełniane waciki PBS i ostrożnie odciągnij jelita na bok. Umieść zwilżone waciki, aby zidentyfikować lewą nerkę i moczowód. Zamknij błonę otrzewną, a następnie nacięcie nylonem 4-0.

Aby wykonać jednostronną niedrożność cewki moczowej lub UUO, wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewną, jak pokazano w przypadku pozorowanej operacji. Umieść strzykawkę o pojemności 2,5 mililitra pod myszką. Zwilż dwa bawełniane waciki PBS, a następnie ostrożnie pociągnij jelita na bok pęsetą i umieść waciki, aby zidentyfikować lewy moczowód.

Użyj pęsety, aby podnieść lewą nerkę. Użyj jedwabiu 4-0, aby podwiązać lewy moczowód w dwóch miejscach oddalonych od siebie o około jeden centymetr. Przeciąć moczowód w środkowym punkcie dwóch podwiązania, a następnie użyć nylonowych szwów 4-0, aby zamknąć błonę otrzewnową i nacięcie.

Po przecięciu błony otrzewnej, jak wykazano wcześniej, podnieś ją pęsetą i nożyczkami chirurgicznymi wykonaj boczne nacięcie przy górnej krawędzi, a następnie kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber. Zidentyfikuj lewą nerkę i refluksuj ją za pomocą PBS, aż nerka zmieni kolor na żółto-biały. Usuń nerkę, przecinając lewą tętnicę nerkową i żyłę nożyczkami chirurgicznymi i umieść ją na szalce Petriego, a następnie dokładnie umyj PBS.

Pokrój nerkę na około 10-miligramowe próbki za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety, umieść każdy kawałek nerki we własnej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki i zamknij nakrętkę probówki. Umieść próbkę nerki w homogenizatorze silikonowym i dodaj 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenylu/guanidyny. Powoli dociśnij i przekręć tłuczek homogenizatora do próbki nerki, aby ją homogenizować.

Powtarzać prasowanie i skręcanie, aż próbka całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy. Aby dalej homogenizować próbkę, przenieś homogenizowany lizat do biopolimerowej kolumny wirowej i wiruj go z prędkością 14 000 razy G przez trzy minuty, a następnie przenieś wytrącony lizat do nieużywanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Połącz lizat w probówce ze 140 mikrolitrami chloroformu i szczelnie zamknij probówkę.

Aby wymieszać lizat i chloroform, odwróć probówkę 15 razy. Inkubować próbki przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirować je w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nie naruszając osadu, przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i dodaj 1,5-krotność jego objętości 100% etanolu.

Mieszaj mieszaninę przez pięć sekund. Załaduj 700 mikrolitrów próbki na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 razy G przez 15 sekund, a następnie wyrzuć wytrącony lizat do probówki zbiorczej.

Dokładnie umyć próbkę, dodając 700 mikrolitrów pierwszego buforu płuczącego do zakotwiczonej w membranie kolumny wirowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Następnie powtórzyć wirowanie i wyrzucić probówkę zbiorczą. Powtórz pranie dwa razy z 500 mikrolitrami buforu do mycia, dwa na pranie.

Po ostatnim praniu obracać zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w dwumililitrowej probówce zbiorczej o temperaturze 15 000 razy G przez jedną minutę i wyrzucić wytrącony lizat. Przenieś zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Rozpuść całkowite RNA, dodając do kolumny 30 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, zamknij nasadkę kolumny i pozostaw na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie obracaj kolumnę z prędkością 15 000 razy G przez jedną minutę. Przenieść próbkę zawierającą całkowite RNA do nowej probówki mikrowirówkowej na lodzie i zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometrii. Przygotować roztwór wzorcowy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodać osiem mikrolitrów do każdej probówki z ośmiodołkowego paska probówki.

Po dostosowaniu całkowitej gęstości RNA umieść 12-mikrolitrową porcję całkowitego RNA w każdej probówce i zamknij nakrętkę. Wirować probówki przez 15 sekund. Umieść probówki w termocyklerze i inkubuj je przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu natychmiast inkubuj je przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza w celu syntezy cDNA. Przenieś cDNA do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i rozcieńcz ją 10 razy wodą destylowaną. Wirować i wirować probówkę przez pięć sekund, a następnie przeprowadzić ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.

Protokół ten został wykorzystany do stworzenia mysiego modelu jednostronnej niedrożności cewki moczowej poprzez podwiązanie lewego moczowodu u ośmiotygodniowych samców myszy o wadze od 20 do 25 gramów. Moczowody były całkowicie zablokowane przez podwójne podwiązanie szwami jedwabnymi 4-0. Nerki pobrano osiem dni po operacji.

Dane qRT-PCR z mikroRNA wykazały, że poziom mikroRNA 3070-3p był znacznie podwyższony, a poziomy mikroRNA, 7218-5p i mikroRNA 7219-5p były zmniejszone w nerkach myszy UUO w porównaniu z kontrolami. Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby powtarzać skręcanie próbki nerki, aż do całkowitego rozpuszczenia w odczynniku do lizy na bazie fenylu/guanidyny, aby uzyskać dobrą ekstrakcję RNA.