Name: Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu przy użyciu qRT-PCR. Technika ta zapewnia wysoką dokładność i czułość w profilowaniu mikroRNA w różnych stanach patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Michelle Goody z Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) za redakcję szkicu tego manuskryptu.

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Jichi i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Jichi.
1. Pozorowana operacja
<ol>
	<li>Przygotuj następujące przedmioty: izofluran, arkusz korkowy, krem do depilacji, chusteczki laboratoryjne, szalkę Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), nylon 4-0, pęsetę, nożyczki chirurgiczne, waciki i 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6.</li>
	<li>Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Następnie nałóż krem do depilacji na brzuch myszy. Po kilku minutach zetrzyj krem do depilacji chusteczką laboratoryjną nasączoną PBS.</li>
	<li>Wstrzyknij 70% etanolu do brzucha myszy, a następnie umieść mysz na arkuszu korka w pozycji leżącej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.</li>
	<li>Zwilż dwa waciki PBS, a następnie ostrożnie odciągnij jelita na bok. Umieść zwilżone waciki, aby zidentyfikować lewą nerkę i moczowód.</li>
	<li>Zamknij błonę otrzewną, a następnie zamknij nacięcie nylonem 4-0.</li>
</ol>
2. Operacja UUO
<ol>
	<li>Przygotuj następujące przedmioty: izofluran, arkusz korkowy, krem do depilacji, chusteczki laboratoryjne, szalkę Petriego z PBS, jedwab 4-0, nylon 4-0, strzykawkę 2,5 ml, waciki, pęsetę, nożyczki chirurgiczne i 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6.</li>
	<li>Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Następnie nałóż krem do depilacji na brzuch myszy. Po kilku minutach zetrzyj krem do depilacji chusteczką laboratoryjną nasączoną PBS.</li>
	<li>Wstrzyknij 70% etanolu w brzuch myszy myszy, a następnie umieść mysz w pozycji leżącej na arkuszu korka.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę o pojemności 2,5 ml pod myszką. Weź dwa bawełniane waciki i zwilż je PBS. Ostrożnie odciągnij jelita na bok za pomocą pęsety i umieść zwilżone waciki odpowiednio, aby zidentyfikować lewy moczowód. Za pomocą pęsety podnieś lewą nerkę.</li>
	<li>Za pomocą jedwabiu 4-0 podwiązać lewy moczowód w dwóch miejscach oddalonych od siebie o ok. 1 cm. Przeciąć moczowód w środkowym punkcie dwóch podwiązania, a następnie użyć nylonowych szwów 4-0, aby zamknąć błonę otrzewną i nacięcie.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek nerek
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, izofluran, arkusz korka, 70% etanol, szalkę Petriego z PBS, pęsetę i nożyczki chirurgiczne.</li>
	<li>Znieczulij mysz 1,5% izofluranem i utrzymuj na poziomie 1,5%. Wstrzyknij 70% etanolu do jego brzucha i połóż mysz na arkuszu korka w pozycji leżącej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.</li>
	<li>Podnieś błonę otrzewnową za pomocą pęsety. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj boczne nacięcie na górnej krawędzi błony otrzewnej i kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber.</li>
	<li>Następnie zidentyfikuj lewą nerkę, refluksuj ją za pomocą PBS, aż nerka zmieni kolor na żółto-biały, aby wypłukać krew z naczyń, i usuń nerkę, przecinając lewą tętnicę nerkową i żyłę nożyczkami chirurgicznymi. Umieść nerkę na szalce Petriego i dokładnie umyj ją PBS.</li>
	<li>Pokrój nerkę na próbki 10 mg za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety (10 mg to odpowiedni rozmiar do następnego kroku). Umieść każdy kawałek nerki w osobnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zamknij nakrętkę probówki.</li>
	<li>Przenieś każdą probówkę do mikrowirówki do ciekłego azotu i utrzymuj probówki w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania przed użyciem.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja całkowitego RNA z próbek nerek
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml, 100% etanol, chloroform, homogenizator krzemowy, lód, mieszalnik wirowy, biopolimerowe kolumny wirowe w probówkach zbiorczych 2,0 ml11,12, kolumny wirujące zakotwiczone w membranie w probówkach zbiorczych 2,0 ml12,13, odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do przemywania zawierający guanidynę i etanol (bufor do przemywania 1), bufor do płukania zawierający etanol (bufor do przemywania 2) i woda wolna od RNaz.</li>
	<li>Umieścić próbkę nerki 10 mg w homogenizatorze silikonowym. Dodać 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny do homogenizatora.</li>
	<li>Przygotuj homogenizator, a następnie powoli dociśnij/przekręć tłuczek homogenizatora do próbki nerki, aby homogenizować próbkę. Powtarzać prasowanie/skręcanie, aż próbka nerki całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy na bazie fenolu/guanidyny.</li>
	<li>W celu dalszej homogenizacji próbki należy przenieść homogenizowany lizat (w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml) do biopolimerowej kolumny wirowej.</li>
	<li>Wirować homogenizowany lizat o masie 14 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść wytrącony lizat do nieużywanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Połączyć lizat w probówce ze 140 μl chloroformu, a następnie szczelnie zamknąć nakrętkę probówki. Aby wymieszać lizat i chloroform, odwróć probówkę 15 razy. 
	UWAGA: Chloroform może być używany bez kaptura.</li>
	<li>Inkubować każdą próbkę przez 2–3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirować każdą próbkę w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Nie naruszając osadu, przenieś supernatant (który zwykle ma ~300 μl) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 1,5-krotność jego objętości (zwykle ~450 μl) 100% etanolu. Wiruj mieszaninę przez 5 sekund.</li>
	<li>Załadować 700 μl próbki na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 x g przez 15 s. Wyrzuć wytrącony lizat do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dokładnie przepłukać próbkę, dodając 700 μl buforu płuczącego 1 do zakotwiczonej w membranie kolumny wirowej w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 x g przez 15 s. Wyrzuć wytrącony lizat do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Załadować 500 μl buforu płuczącego 2 na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml w celu usunięcia śladowych ilości. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 x g przez 15 s. Wylać wytrącony lizat do probówki zbiorczej. 
	UWAGA: Zakotwiczona w błonie kolumna wirowa może oddzielać RNA i DNA.</li>
	<li>Ponownie wykonaj krok 4.11.</li>
	<li>Ponownie obracać zakotwiczoną w membranie kolumnę wirującą w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml przy 15 000 x g przez 1 minutę. Wyrzuć wytrącony lizat z probówki zbiorczej.</li>
	<li>Przenieś zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Rozpuść całkowite RNA, dodając do kolumny 30 μl wody wolnej od RNaz. Zamknij nasadkę kolumny i odczekaj 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie obracaj kolumnę w temperaturze 15 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść całkowitą ilość próbki zawierającej całkowite RNA do nowej probówki do mikrowirówki. Umieść każdą z probówek na lodzie i zmierz stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometrii.</li>
	<li>Probówki z próbkami należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania przed użyciem.</li>
</ol>
5. Synteza cDNA z odwrotną transkrypcją całkowitego RNA
UWAGA: Wytyczne MIQE (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) zostały wydane, aby zachęcić do lepszych praktyk eksperymentalnych i pomóc w uzyskaniu wiarygodnych i jednoznacznych wyników19. W tym protokole cDNA jest syntetyzowane z 1,0 μg oczyszczonego całkowitego RNA w dwuetapowej procedurze przy użyciu odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, ośmiodołkowe probówki paskowe z nakrętkami, nakrętka każdej probówki z ośmioma paskami, woda destylowana, lód, zestaw do odwrotnej transkryptazy (patrz Tabela Materiałów)14,15 w stanie stopionym, termocykler i mieszalnik wirowy.</li>
	<li>Uruchom termocykler.</li>
	<li>Przygotuj roztwór mieszanki wzorcowej: Dodaj 2,0 μl mieszanki odwrotnej transkryptazy (dołączonej do zestawu) i 2,0 μl 10-krotnej mieszanki kwasów nukleinowych do 4,0 μl 5-krotnego buforu hi-spec (aby uzyskać łącznie 8,0 μl mieszanki głównej na probówkę).</li>
	<li>Umieścić 8,0 μl roztworu mieszanki głównej do każdej probówki z ośmiodołkową probówką paskową.</li>
	<li>Dostosuj całkowitą gęstość RNA. Aby wyizolować 1,0 μg całkowitego RNA z próbek nerek w 12 μl wody wolnej od RNaz, przenieś odpowiednią ilość całkowitego RNA do wody destylowanej, korzystając z danych dotyczących gęstości zmierzonych zgodnie z opisem w kroku 4.15. 
	UWAGA: Jeśli występuje jakiekolwiek zanieczyszczenie DNA, zanieczyszczone DNA zostanie poddane koamplifikacji w qRT-PCR.</li>
	<li>Umieścić 12 μl podwielokrotności całkowitego RNA w każdej probówce i zamknąć nakrętkę probówki. Odwirować probówkę przez 15 x.</li>
	<li>Umieścić probówkę w termocyklerze i inkubować próbkę przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Następnie natychmiast inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C w celu syntezy cDNA.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji przenieś cDNA do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozcieńcz cDNA dziesięć razy (1:10) wodą destylowaną. Wirować i odwirowywać probówkę przez 5 sekund.</li>
	<li>Rozcieńczone cDNA należy tymczasowo przechowywać na lodzie i przed użyciem przenieść próbki do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
6. qRT-PCR miRNA
UWAGA: Użyliśmy metody interkalatora do przeprowadzenia qRT-PCR miRNA. Użyto starterów dla RNA U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml, mieszalnik wirowy, 96-dołkową płytkę reakcyjną do qRT-PCR, folię adhezyjną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, aplikator folii samoprzylepnej, 96-dołkowy wirnik wirówki, startery specyficzne dla miRNA, przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym oraz zestaw do PCR na bazie zielonego barwnika (patrz Tabela Materiałów)14,15 zawierający 2x mieszankę główną PCR i 10x uniwersalny starter.</li>
	<li>Po wymieszaniu ich w 1,5 ml probówkach mikrowirówek, zmieszaj następujące elementy: 6,25 μl wody destylowanej, 1,25 μl każdego 5 μM startera miRNA rozpuszczonego w wodzie wolnej od nukleaz, 12,5 μl 2× mieszanki głównej PCR i 2,5 μl 10x uniwersalnego startera.</li>
	<li>Przygotuj zsyntetyzowane cDNA zgodnie z opisem w kroku 5 i rozpuść je. Wirować i odwirowywać cDNA przez 5 s.</li>
	<li>Umieścić 22,5 μl podwielokrotności odczynnika (utworzonego zgodnie z opisem w kroku 6.2) w każdym dołku płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Umieść 2,5 μl porcji cDNA w każdym dołku płytki.</li>
	<li>Za pomocą aplikatora folii samoprzylepnej mocno przymocuj folię samoprzylepną do płytki 96-dołkowej. Odwirować płytkę z 96-dołkowym wirnikiem wirówki o sile 1 000 x g przez 30 s, aby ustabilizować reakcje na dnie każdej studzienki.</li>
</ol>
7. Cykl PCR
<ol>
	<li>Uruchom system PCR w czasie rzeczywistym i umieść utworzoną płytkę zgodnie z opisem w kroku 6.6. w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Następnie ustaw właściwości eksperymentu; Zidentyfikuj nazwę eksperymentu. Wybierz następujące: "96-dołkowy (0,2 ml)" jako typ eksperymentu systemu, "Porównawczy CT (ΔΔCT)" jako metodę oznaczania ilościowego, "Zielone odczynniki SYBR" jako odczynniki do wykrywania sekwencji docelowej i "standardowy" jako przebieg systemu.</li>
	<li>Przypisz nazwę do próbki i docelowego miRNA, a następnie przypisz nazwę do próbki i docelowego miRNA w każdym dołku. Próbki powinny być przypisane w dwóch egzemplarzach w celu uzyskania odpowiednich danych potwierdzających wyniki. Należy wybrać próbkę referencyjną i kontrolę endogenną, a następnie wybrać wartość "brak" dla barwnika, który ma być użyty jako bierne odniesienie. Upewnij się, że ustawiłeś ujemną odwrotną transkryptazę i kontrolę bez matrycy dla ekspresji miRNA, aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe odczynników.</li>
	<li>Upewnij się, że objętość reakcji jest ustawiona na "20 μl", a warunki cykliczne PCR są ustawione na 95 °C przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 70 °C przez 30 s.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu qRT-PCR użyj oprogramowania systemowego do analizy danych qRT-PCR. Upewnij się, że linia progowa, która jest automatycznie wybierana przez oprogramowanie, jest odpowiednia dla każdej studzienki.</li>
	<li>Sprawdź wartość cyklu progowego (CT) endogennej kontroli i docelowego miRNA analizowanego w każdej próbce. Wartość CT jest określana przez przecięcie krzywej wzmocnienia i linii progowej. W niniejszym badaniu użyliśmy RNU6-2 jako endogennej kontroli docelowego poziomu ekspresji miRNA i zastosowaliśmy metodę ΔΔCT do określenia względnego poziomu ekspresji każdego docelowego miRNA20.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li>
<li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li>
<li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147(2018).</li>
<li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+liver+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li>
<li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645(2014).</li>
<li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+hepatic+miRNA+expression%2C+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li>
<li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192(2018).</li>
<li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+role+of+miR-19a%2F19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802(2019).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li>
<li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94(2014).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly%28T%29%2C+a+specific+oligo%28dT%29+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536(2012).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li>
<li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP+homologous+protein+%28CHOP%29+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li>
<li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improvement+of+the+2%5E%28-delta+delta+CT%29+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatics+Bioinformatics+and+Biomathematics%22%5BJournal%5D)">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li>
<li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
<li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li>
<li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+about+a+microarray+experiment+%28MIAME%29-toward+standards+for+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisany powyżej protokół z qRT-PCR z powodzeniem określił poziomy ekspresji docelowych miRNA. Ocena wyekstrahowanych miRNA jest ważna przy dążeniu do uzyskania miarodajnych danych qRT-PCR, a w celu potwierdzenia jakości miRNA przed wykonaniem qRT-PCR, należy sprawdzić stosunek absorbancji przy 260 nm do absorbancji przy 280 nm za pomocą spektrofotometru. Jeżeli za pomocą qRT-PCR nie można uzyskać pojedynczej amplifikacji PCR o oczekiwanej długości i temperaturze topnienia lub monomodalnej krzywej topnienia, może dojść do...

MikroRNA (miRNA) — krótkie, niekodujące RNA, które powodują degradację i hamowanie transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA)1 — wykazano, że regulują ekspresję różnych mRNA, które odgrywają kluczową rolę zarówno w fizjologii, jak i chorobie (np. zapaleniu, zwłóknieniu, zaburzeniach metabolicznych i raku). Niektóre z miRNA mogą być zatem kandydatami na nowe biomarkery i cele terapeutyczne dla różnych chorób2,3,4,5. Chociaż opisano profile ekspresji miRNA w narządach i tkankach myszy, w tym mózgu, sercu, płucach, wątrobie i nerkach6,7,8,9,10, nie ma standardowych metod ekstrakcji i oceny miRNA w nerkach myszy ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek.
Zaprojektowaliśmy protokół do niezawodnego oczyszczania i wykrywania ekspresji miRNA w nerkach myszy ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek. Protokół składa się z pięciu głównych kroków, które są następujące. (1) 8-tygodniowe samce myszy C57BL / 6 są podzielone na grupy myszy, które przechodzą pozorowaną operację (kontrole) i myszy, które są poddawane operacji zapewniającej jednostronną niedrożność moczowodu (UUO), która jest związana ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek. (2) Próbki nerek są ekstrahowane od myszy pozorowanych i mysz UUO, homogenizowane oddzielnie w homogenizatorze silikonowym, a następnie przenoszone do systemu rozdrabniania biopolimerów na kolumnie wirowej mikrowirówki<klasa sup = "xref">11,<klasa sup = "xref">12. (3) Całkowity RNA zawierający miRNA jest ekstrahowany z próbek nerek za pomocą kolumny wirowej opartej na błonie krzemionkowej12,13. (4) Korzystając z tego wyekstrahowanego całkowitego RNA, komplementarne DNA (cDNA) jest syntetyzowane z całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy, polimerazy poli(A) i startera oligo-dT14,15. (5) Ekspresje miRNA są oceniane za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) przy użyciu barwnika interkalacyjnego 14,15.
Ten protokół jest oparty na badaniach, które uzyskały znaczące ekstrakcje i oceny miRNA w różnych tkankach11,12,13,14,15, a system rozdrabniania biopolimerów zastosowany w protokole okazał się oczyszczać wysokiej jakości, całkowite RNA z tkanek w 2006 roku12. Ponadto wcześniejsze badania potwierdziły dokładność i czułość aspektów protokołu (tj. syntezy cDNA z odwrotną transkryptazą, polimerazą poli(A) i starterami oligo-dT z wyekstrahowanego całkowitego RNA) do oznaczania ekspresji miRNA metodą qRT-PCR z barwnikiem interkalacyjnym 14,15. Ponieważ nowy protokół ma zalety w postaci prostoty, oszczędności czasu i redukcji błędów technicznych, protokół może być stosowany w badaniach, które wymagają dokładnej i czułej identyfikacji profilu miRNA w nerkach myszy. Co więcej, protokół może być stosowany do badań nad wieloma stanami patologicznymi.
Następnie opisujemy określanie profili ekspresji miRNA u myszy z UUO, co jest związane ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek. U ludzi zwłóknienie śródmiąższowe nerek jest powszechną i ważną cechą zarówno przewlekłej choroby nerek, jak i schyłkowej niewydolności nerek, niezależnie od ich etiologii16,17. To zwłóknienie śródmiąższowe nerek jest związane z postępem niewydolności nerek i charakteryzuje się zwiększoną ekspresją składników macierzy zewnątrzkomórkowej w przestrzeniach śródmiąższowych (np. kolagenu, fibronektyny i aktyny α mięśni gładkich)17,18.

<table><tbody><tr><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor do płukania 2</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Bufor do płukania 1</td><td></td></tr><tr><td>Tokyo Laboratory Animals Science</td><td>Nie przypisano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-dołkowa płytka</td><td></td>reakcyjna</tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Folia samoprzylepna do 96-dołkowej płytki</td><td></td></tr> <tr><td>reakcyjnejQiagen</td><td>MS00001701</td><td>5'-UUAAUGCUAAUUGUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00065141</td><td>5'-UUACACUCCAGUGGUGUGGGGU-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUUGUAGAGGG-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>217004</td><td>Spin zakotwiczony w membranie kolumna w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml</td> Qiagen 218161 Zestaw do odwrotnej transkryptazy Qiagen 218073 Zestaw do PCR na bazie zielonego barwnika Qiagen 79654 Biopolimerowe kolumny wirowe w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml Qiagen 79306 Odczynnik do lizy na bazie fenolu/guanidyny Thermo Fisher Scientific 4472380 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym</td> Thermo Fisher Scientific 4472380 Oprogramowanie przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 Nieujawnione Takara Bio 9790B Homogenizator krzemowy ASKUL GA04SW JAKO JEDEN ER1004NA45-KF2,62 -<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Zobacz materiał 9968-32</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> TGL

ilościowa ocena ekspresji mikrorna pcr w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MikroRNA (miRNA) to jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA, które zazwyczaj regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym poprzez wiązanie się z częściowo komplementarnymi miejscami docelowymi w nietranslowanym regionie 3' (UTR) informacyjnego RNA (mRNA), co zmniejsza translację i stabilność mRNA. Profile ekspresji miRNA w różnych narządach i tkankach myszy zostały zbadane, ale standardowe metody oczyszczania i oznaczania ilościowego miRNA w nerkach myszy nie były dostępne. Opracowaliśmy skuteczną i wiarygodną metodę ekstrakcji i oceny ekspresji miRNA w nerce myszy ze zwłóknieniem śródmiąższowym nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Protokół wymagał pięciu kroków: (1) stworzenia myszy z pozorowaną i jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO); (2) ekstrakcja próbek nerek od myszy UUO; (3) ekstrakcja całkowitego RNA, w tym miRNA, z próbek nerek; (4) komplementarna synteza DNA (cDNA) z odwrotną transkrypcją z miRNA; oraz (5) qRT-PCR przy użyciu cDNA. Korzystając z tego protokołu, z powodzeniem potwierdziliśmy, że w porównaniu z kontrolami ekspresja miRNA-3070-3p była znacznie zwiększona, a ekspresja miRNA-7218-5p i miRNA-7219-5p była znacznie zmniejszona w nerkach mysiego modelu zwłóknienia śródmiąższowego nerek. Protokół ten można wykorzystać do określenia ekspresji miRNA w nerkach myszy z UUO.

Model UUO u myszy stworzono poprzez podwiązanie lewego moczowodu zgodnie z opisem21 u 8-tygodniowych samców myszy o masie 20–25 g. Moczowody całkowicie zamknięto za pomocą podwójnego podwiązania nicią jedwabną 4-0. Przed operacją oraz codziennie przez 2 dni po zabiegu podawano lek przeciwbólowy (meloksykam 5 mg/kg w zastrzyku podskórnym). W 8. dniu po operacji pobrano nerki, opłukano je w PBS, wycięto i przechowywano w ciekłym azocie do dalszych analiz. Jako grupę kontrolną wykorzystano myszy podd...

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Metoda ta umożliwia zapewnienie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z szerokim zakresem stanów patologicznych, takich jak zwłóknienie nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia profilowanie ekspresji mikroRNA z dużą dokładnością i czułością dzięki zastosowaniu prostego procesu, który oszczędza czas i zapobiega błędom technicznym. Aby wykonać pozorowaną operację, użyj nożyczek chirurgicznych i pęsety, aby wykonać nacięcie w skórze na brzuchu i przeciąć mięsień i błonę otrzewnową od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber.Zwilż dwa bawełniane waciki PBS i ostrożnie odciągnij jelita na bok. Umieść zwilżone waciki, aby zidentyfikować lewą nerkę i moczowód. Zamknij błonę otrzewną, a następnie nacięcie nylonem 4-0.Aby wykonać jednostronną niedrożność cewki moczowej lub UUO, wykonaj nacięcie w skórze na brzuchu i przetnij mięsień i błonę otrzewną, jak pokazano w przypadku pozorowanej operacji. Umieść strzykawkę o pojemności 2,5 mililitra pod myszką. Zwilż dwa bawełniane waciki PBS, a następnie ostrożnie pociągnij jelita na bok pęsetą i umieść waciki, aby zidentyfikować lewy moczowód.Użyj pęsety, aby podnieść lewą nerkę. Użyj jedwabiu 4-0, aby podwiązać lewy moczowód w dwóch miejscach oddalonych od siebie o około jeden centymetr. Przeciąć moczowód w środkowym punkcie dwóch podwiązania, a następnie użyć nylonowych szwów 4-0, aby zamknąć błonę otrzewnową i nacięcie.Po przecięciu błony otrzewnej, jak wykazano wcześniej, podnieś ją pęsetą i nożyczkami chirurgicznymi wykonaj boczne nacięcie przy górnej krawędzi, a następnie kontynuuj nacięcie wzdłuż najniższej krawędzi żeber. Zidentyfikuj lewą nerkę i refluksuj ją za pomocą PBS, aż nerka zmieni kolor na żółto-biały. Usuń nerkę, przecinając lewą tętnicę nerkową i żyłę nożyczkami chirurgicznymi i umieść ją na szalce Petriego, a następnie dokładnie umyj PBS.Pokrój nerkę na około 10-miligramowe próbki za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety, umieść każdy kawałek nerki we własnej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki i zamknij nakrętkę probówki. Umieść próbkę nerki w homogenizatorze silikonowym i dodaj 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenylu/guanidyny. Powoli dociśnij i przekręć tłuczek homogenizatora do próbki nerki, aby ją homogenizować.Powtarzać prasowanie i skręcanie, aż próbka całkowicie rozpuści się w odczynniku do lizy. Aby dalej homogenizować próbkę, przenieś homogenizowany lizat do biopolimerowej kolumny wirowej i wiruj go z prędkością 14 000 razy G przez trzy minuty, a następnie przenieś wytrącony lizat do nieużywanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Połącz lizat w probówce ze 140 mikrolitrami chloroformu i szczelnie zamknij probówkę.Aby wymieszać lizat i chloroform, odwróć probówkę 15 razy. Inkubować próbki przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirować je w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nie naruszając osadu, przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i dodaj 1,5-krotność jego objętości 100% etanolu.Mieszaj mieszaninę przez pięć sekund. Załaduj 700 mikrolitrów próbki na zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Zamknij nasadkę kolumny i obracaj kolumnę z prędkością 15 000 razy G przez 15 sekund, a następnie wyrzuć wytrącony lizat do probówki zbiorczej.Dokładnie umyć próbkę, dodając 700 mikrolitrów pierwszego buforu płuczącego do zakotwiczonej w membranie kolumny wirowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Następnie powtórzyć wirowanie i wyrzucić probówkę zbiorczą. Powtórz pranie dwa razy z 500 mikrolitrami buforu do mycia, dwa na pranie.Po ostatnim praniu obracać zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową w dwumililitrowej probówce zbiorczej o temperaturze 15 000 razy G przez jedną minutę i wyrzucić wytrącony lizat. Przenieś zakotwiczoną w membranie kolumnę wirową do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Rozpuść całkowite RNA, dodając do kolumny 30 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, zamknij nasadkę kolumny i pozostaw na pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie obracaj kolumnę z prędkością 15 000 razy G przez jedną minutę. Przenieść próbkę zawierającą całkowite RNA do nowej probówki mikrowirówkowej na lodzie i zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometrii. Przygotować roztwór wzorcowy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodać osiem mikrolitrów do każdej probówki z ośmiodołkowego paska probówki.Po dostosowaniu całkowitej gęstości RNA umieść 12-mikrolitrową porcję całkowitego RNA w każdej probówce i zamknij nakrętkę. Wirować probówki przez 15 sekund. Umieść probówki w termocyklerze i inkubuj je przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po zakończeniu natychmiast inkubuj je przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza w celu syntezy cDNA. Przenieś cDNA do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i rozcieńcz ją 10 razy wodą destylowaną. Wirować i wirować probówkę przez pięć sekund, a następnie przeprowadzić ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Protokół ten został wykorzystany do stworzenia mysiego modelu jednostronnej niedrożności cewki moczowej poprzez podwiązanie lewego moczowodu u ośmiotygodniowych samców myszy o wadze od 20 do 25 gramów. Moczowody były całkowicie zablokowane przez podwójne podwiązanie szwami jedwabnymi 4-0. Nerki pobrano osiem dni po operacji.Dane qRT-PCR z mikroRNA wykazały, że poziom mikroRNA 3070-3p był znacznie podwyższony, a poziomy mikroRNA, 7218-5p i mikroRNA 7219-5p były zmniejszone w nerkach myszy UUO w porównaniu z kontrolami. Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby powtarzać skręcanie próbki nerki, aż do całkowitego rozpuszczenia w odczynniku do lizy na bazie fenylu/guanidyny, aby uzyskać dobrą ekstrakcję RNA.

quantitative-real-time-pcr-evaluation-microrna-expressions-mouse

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film pokazuje procedurę generowania modelu myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu. Zabieg polega na przecięciu jednego z moczowodów myszy w celu utrudnienia przepływu moczu.

Mysi model jednostronnej niedrożności moczowodu: zabieg chirurgiczny mający na celu zablokowanie przepływu moczu z nerki w modelach mysich

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Mysi model nieodwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) jest prezentowany razem z modelem odwracalnego UUO, w którym niedrożność moczowodu jest łagodzona przez zespolenie przerwanego moczowodu z pęcherzem moczowym. Modele te umożliwiają badanie stanu zapalnego i bliznowacenia nerek, a także przebudowy tkanek.

Mysi model nieodwracalnej i odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Obecny protokół opisuje krok po kroku, powtarzalny model jednostronnej niedrożności moczowodu.

Niedojrzały mysi model odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu

Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.

Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek

Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje, które umożliwią badaczom wykonanie odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu u myszy przy użyciu ustandaryzowanego modelu, który umożliwia analizę długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużonej niedrożności moczowodu.

Mysi model do oceny długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużającej się jednostronnej niedrożności moczowodu

Poznaj metodę ilościowej oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu przy użyciu qRT-PCR. Technika ta zapewnia wysoką dokładność i czułość w profilowaniu mikroRNA w różnych stanach patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

Przeglądaj więcej filmów