Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Cześć. To jest mały północny protokół RNA. Jest to pochodna protokołu pierwotnie zoptymalizowanego przez dr Rashida Akbergenowa.

W tej metodzie można bardzo precyzyjnie i w bardzo wysokiej rozdzielczości wykryć małe RNA o długości od 20 do 24 nukleotydów. Protokół jest w zasadzie zmodyfikowaną formą tradycyjnej analizy północnej, ale tutaj procent akrylamidu jest dość wysoki i wynosi 15 procent. Ten północny może być używany do wykrywania już znanego małego RNA, mikro RNA lub innego zestawu małego RNA, gdy sekwencja jest znana, lub może być używany do potwierdzenia obfitości małego RNA pochodzącego ze zbiorów danych sekwencjonowania nowej generacji.

Zaletą tej metody jest to, że można nie tylko patrzeć na obfitość mikro RNA, ale także na obfitość prekursorów, na przykład mikro RNA mogą pominąć prekursor o długości około 30 do kilkuset nukleotydów, który może być również wykryty jednocześnie, wraz z mikro RNA. Protokół jest bardzo prosty, bardzo bezpośredni, ale należy być bardzo ostrożnym podczas wykonywania niektórych krytycznych kroków, które są wymienione na końcu tego protokołu. Aby przygotować 10 ml mieszanki żelowej, dodaj 4,8 grama mocznika, 3,75 ml 40% roztworu akrylamidu i 1 ml świeżo przygotowanego 10X TBE, pH 8,2 i delikatnie wymieszaj roztwór.

Całkowicie rozpuść mocznik, podgrzewając mieszaninę w łaźni wodnej, aż roztwór będzie klarowny. Uzupełnić objętość do 10 ml przy użyciu sterylnej wody MilliQ i schłodzić mieszaninę żelu do temperatury pokojowej. Umyj wymagane urządzenie detergentem, delikatnie je wyszoruj, aby usunąć resztki KZM i akrylamidu.

Następnie spłucz je wodą MilliQ i pozostaw do wyschnięcia. Zmontuj szklaną płytkę razem, upewnij się, że obie są na tym samym poziomie. Połóż je mocno na gąbce.

Do mieszanki żelowej dodaj 8 mikrolitrów TEMED i 80 mikrolitrów 10% świeżo przygotowanego APS. Delikatnie wymieszaj i wlej mieszankę żelową na zmontowane płytki. Upewnij się, że żel nie przecieka.

Ostrożnie umieść grzebień. Pozostaw żel do polimeryzacji przez około 45 minut. Po polimeryzacji żelu należy usunąć szklane płytki z zespołu.

Umyj szklane płytki wodą MilliQ. I umieść je w kasecie biegowej. Umieść kasetę jezdną wewnątrz zbiornika.

Wlać świeżo przygotowany 1X TBE, pH 8,2. Ostrożnie wyjmij grzebień. Dokładnie umyć dołki żelu, pipetując bufor.

Ten etap usuwa osady mocznika ze studzienki i ułatwia równomierny przepływ RNA po żelu. Zamknij pokrywę aparatu i wstępnie uruchom pusty żel pod napięciem 80 V przez 30 minut, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków z buforu. W celu przygotowania 10 ml barwnika ładującego należy odważyć 5 mg błękitu bromofenolowego, 5 mg cyjanolu ksylenowego, dodać 10 ml odjoinizowanego formamidu i dobrze wymieszać.

Podziel barwnik i przechowuj w temperaturze 4 stopni do dalszego wykorzystania. Podwielokrotność 10 mikrogramów całkowitego RNA do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że jakość RNA, czyli

stosunek 260:230 jest większa lub bliższa dwóm. Umieść probówkę w regulatorze speedVac i wysusz próżniowo próbki. Ponownie zawiesić wysuszone próbki RNA w 8 mikrolitrach barwnika ładującego.

Podgrzewać próbki w temperaturze 98 stopni przez dwie minuty. Schłodzić je przez minutę w temperaturze pokojowej. Schłodzone próbki RNA należy przemieszać wirowo, aby zapewnić prawidłową re-zawiesinę w barwniku ładującym.

Zakręć rurkami. Powtórz kroki podgrzewania, chłodzenia i wirowania trzy razy, aby uzyskać swobodnie płynący RNA. Zatrzymaj wstępny bieg żelu.

Przed załadowaniem próbki należy dokładnie umyć studzienki, aby usunąć osady mocznika znajdujące się wewnątrz studzienek. Podgrzewaj ponownie zawieszone próbki RNA w temperaturze 98 stopni przez jedną minutę. Załaduj gorące próbki do studzienek za pomocą końcówek kapilarnych.

Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zakończ ładowanie wszystkich próbek i załóż pokrywę. Uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez trzy godziny lub do momentu, gdy błękit bromofenolowy całkowicie zniknie.

Do transferu użyj dodatnio naładowanej membrany nylonowej. Przytnij go do wymiarów szklanej płyty. Oznacz membranę w prawym górnym rogu.

Delikatnie umieść membranę na powierzchni sterylnej wody MilliQ, upewnij się, że etykieta jest skierowana w dół, przodem do powierzchni wody. Weź czystą tacę i przygotuj kanapkę z żelem do elektrotransferu. Umieść szarą stronę kasety w dół.

Wlej 1X TBE nieco powyżej poziomu kasety. Wstępnie zwilż wkładkę z włókna w 1X TBE i ściśnij ją, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przytnij dwa kawałki bibuły do rozmiaru podkładki z włókna.

Zwilż kawałek bibuły w 1X TBE i umieść go na podkładce z włókna. Usuń pęcherzyki powietrza, tocząc plastikową pipetę po papierze. Zwilż wstępnie kolejny kawałek bibuły w 1X TBE i połóż go na kasecie.

Przewróć się, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Teraz zestaw kanapkowy jest gotowy do elektrotransferu. Po zakończeniu elektroforezy zatrzymaj bieg i zdejmij pokrywę z aparatu.

Wyjmij kasetę biegową z konfiguracji. Wyjmij szklane płytki z kasety jezdnej. Ostrożnie wyjmij żel z zespołu.

Połóż go na bibule tak, aby pierwsza załadowana próbka RNA znajdowała się po prawej stronie. Delikatnie zanurz wstępnie nasączoną membranę w 1X TBE i umieść ją na żelu, stroną skierowaną do oznaczonej strony w dół. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany i żelu.

Delikatnie przewróć na bok, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Zanurz jeden kawałek bibuły w 1X TBE i połóż go na membranie. Usuń pęcherzyki powietrza.

Umieść kolejny kawałek bibuły i usuń pęcherzyki powietrza. Uzupełnij kanapkę, kładąc podkładkę z włókna na zespole. Mocno zamknij kasetę.

Umieść kasetę trans-blot w module. Napełnij zbiornik 1X TBE, pH 8,2, aż do znaku bibuły. Zamknij pokrywę aparatu i przenieś pod napięciem 10 V przez noc w temperaturze 4 stopni lub w chłodnym pomieszczeniu.

Utrzymuj środek sieciujący UV w gotowości i ustaw go na 1200, tuż przed zakończeniem elektrotransferu. Po zakończeniu przenoszenia wyjmij kasetę z modułu. Umieść wilgotną membranę na arkuszu A4, kładąc zaznaczoną stroną do góry.

Połącz RNA z błoną przez naświetlanie światłem UV o długości 254 nanometrów o prędkości 120 milidżuli. Usieciowana plama może być przechowywana w temperaturze czterech stopni lub używana do hybrydyzacji. Zaprojektuj sondę, która jest całkowicie komplementarna w stosunku do małego RNA, które ma zostać wykryte.

Oznacz końcówkę sondy na jej pięciu głównych końcach za pomocą enzymu PNK i połącz składniki, jak pokazano. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Po 30 minutach inkubacji za pomocą kolumn G-25 oddzielić nieznakowane sondy od mieszaniny reakcyjnej.

Aby poprawić etykietowanie sondy, przygotuj kolumnę G-25 przed użyciem. Umieść blot, RNA stroną do góry, w butelce do hybrydyzacji. Przed użyciem energicznie wymieszać bufor hybrydyzacyjny.

Dodaj do środka 10 ml buforu do hybrydyzacji i umieść butelkę do hybrydyzacji w piecu do hybrydyzacji, utrzymuj w temperaturze 35 stopni z rotacją. Wykonuj wstępną hybrydyzację przez 20 do 30 minut. Po wstępnej hybrydyzacji wyjmij butelkę z piekarnika.

Delikatnie dodaj oznakowaną sondę do buforu hybrydyzacyjnego. Upewnij się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Inkubuj blot w piekarniku w temperaturze 35 stopni z obrotem przez 12 godzin.

Po hybrydyzacji usuń bufor hybrydyzacyjny z butelki. Wykonaj szybkie płukanie plam za pomocą bufora do płukania-I. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia nadmiaru roztworu hybrydyzacyjnego z plam.

Dalej inkubować bloty w temperaturze 35 stopni przez 30 minut, używając buforu do płukania I. Wykonaj kolejne pranie przy użyciu buforu II w temperaturze 35 stopni przez 30 minut. Po umyciu blot umieść go w pokrywie hybrydyzacyjnej, usuń nadmiar buforu i zamknij.

Umieść go w kasecie i wystaw na 12 godzin na ekranie fosfodonu wolnym od promieniowania. Wykryj sygnał hybrydyzacji za pomocą biomolekularnego imagera tajfunu i przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania ImageJ. W celu hybrydyzacji blot z innymi sondami należy wykonać kroki usuwania powłoki, jak pokazano na ilustracji.

Dzięki tej technice można oszacować obfitość mikro RNA, a także jego długość. Na tym obrazie można wykryć ekspresję mikro RNA 397 we wszystkich próbkach. W tej plamie obfitość pierwszej próbki wynosi około 5 odczytów na milion, zgodnie z danymi sekwencjonowania nowej generacji, co sugeruje, że nasza technika może również wykryć mniej obfite mikro RNA.

Ponadto, korzystając z oprogramowania do kwantyfikacji ImageJ, można określić ilościowo ekspresję mikro 397 wśród próbek. Tutaj użyliśmy U6 i mikro RNA 168 jako kontroli obciążenia. Opowiem o kilku kluczowych krokach, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentu.

Upewnij się, że używasz dobrej jakości RNA do przygotowania próbki. Podczas suszenia próżniowego próbek należy unikać ich nadmiernego suszenia. Ponowna zawiesina RNA w barwniku ładującym ma kluczowe znaczenie.

Upewnij się, że przygotowałeś swobodnie płynącą próbkę. Należy zachować ostrożność podczas ładowania żelu. Studzienki z żelem muszą zostać umyte, a próbka musi zostać załadowana do studzienek w linii prostej.

Podczas elektrotransferu niezbędne jest rozprowadzenie membrany w wodzie, tuż przed zanurzeniem jej w 1X TBE, co poprawia transfer. Hybrydyzacja blot musi być wykonana w temperaturze 35 stopni. Utrzymuj temperaturę pieca do hybrydyzacji.

W przypadku wielokrotnego stosowania plam membrany należy przechowywać w temperaturze 4 stopni. Powinny być utrzymywane w stanie wilgotnym w 2X SSE. W przeciwieństwie do innych metod opartych na PCR, metoda ta zapewnia kwantyfikację ekspresji, a także określenie wielkości mikro RNA.