Name: Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę northern hybridization do wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin o długości 20-24 nukleotydów z wysoką rozdzielczością. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę ekspresji małych RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za dostęp do laboratorium radiacyjnego zapewnionego przez instytut goszczący i BRIT dla radioizotopów. Laboratorium PVS jest wspierane przez National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research i granty (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Szwajcarski/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) z Departamentu Biotechnologii rządu Indii. MP uznaje DBT-Research Associateship, DBT, rząd Indii.

1. Przygotowanie 15% denaturującego żelu poliakrylamidowego
<ol>
	<li>Zważyć i dodać 4,8 g mocznika, dodać 3,75 ml 40% roztworu akryloamidu: bisakryloamidu (19:1) i 1 ml 10x TBE pH 8,2 do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Rozpuścić mocznik w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C do klarownego roztworu.</li>
	<li>Uzupełnić objętość do 10 ml za pomocą świeżo autoklawowanej sterylnej wody i schłodzić mieszaninę żelu do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować świeży 10% (w/v) roztwór nadsiarczanu amonu.</li>
</ol>
2. Montaż szklanych płytek i jednostki do elektroforezy
<ol>
	<li>Umyj wszystkie urządzenia potrzebne do elektroforezy żelowej i elektrobibuły detergentem. Delikatnie wyszoruj je miękką gąbką, aby usunąć resztki buforu i akrylamidu, spłucz wodą i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Zmontuj obie szklane płytki razem i mocno umieść je na gąbce. Do tej konfiguracji użyj płyty o grubości 1 mm. Upewnij się, że płytki są na tym samym poziomie, aby uniknąć wycieków.</li>
	<li>Do 10 ml żelu dodać 8 μl TEMED i 80 μl świeżo przygotowanego 10% (w/v) roztworu nadsiarczanu amonu.</li>
	<li>Nie zwlekając, delikatnie wymieszaj i wlej to między zmontowane szklane płytki. Ostrożnie umieść grzebień. Na tym etapie należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Pozostawić żel do polimeryzacji przez około 45 minut.</li>
	<li>Umyj spolimeryzowany żel sterylną wodą przed umieszczeniem go w zestawie do biegania po żelu.</li>
	<li>Zamontuj płytki wewnątrz kasety jezdnej i delikatnie wyjmij grzebień.</li>
	<li>Wlać do zbiornika świeżo przygotowany sterylny 1x TBE, pH 8,2.</li>
	<li>Dokładnie umyć studzienki, pipetując bufor w celu usunięcia kryształków soli. Ten krok pomaga próbce RNA przebiegać równomiernie po żelu.</li>
	<li>Wykonaj rozruch wstępny przy napięciu 80 V przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie barwnika i próbek
<ol>
	<li>Na 10 ml barwnika ładującego żel odważyć 5 mg błękitu bromofenolowego, 5 mg cyjanolu ksylenowego, dokładnie dodać 10 ml dejonizowanego formamidu i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Porcję 10 μg całkowitego RNA do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i wysuszyć próbki za pomocą speedvac. Nie przesuszaj próbek.</li>
	<li>Zawiesić próbki RNA w 8 μl ładunku.</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 98 °C przez 2 minuty, schładzać przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, wirować i obracać próbki 3 razy. Ten krok jest niezbędny do prawidłowego ponownego zawieszenia, a to z kolei pomaga w równym załadowaniu próbek.</li>
</ol>
4. Elektroforeza żelowa
<ol>
	<li>Zatrzymaj bieg wstępny i umyj studzienki przed załadowaniem próbki.</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 98 °C przez 1 minutę i ładować gorące próbki do studzienki za pomocą końcówek kapilarnych. Włóż końcówkę do dna studzienki tak, aby próbka zajmowała jedną cienką warstwę w studzience.</li>
	<li>Pełne załadowanie wszystkich próbek. Dołącz do załadowania znacznika dekady RNA.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 80 V, aż niebieski barwnik bromofenolowy zniknie prawie całkowicie. Błękit bromofenolowy działa w temperaturze 10 pz w 15% denaturującym żelu akrylowym.</li>
</ol>
5. Przygotowanie do elektroblottingu
<ol>
	<li>Przytnij membranę N+nylon do wymiarów płyty szklanej i oznacz membranę w prawym górnym rogu ołówkiem HB.</li>
	<li>Delikatnie umieść membranę na powierzchni sterylnej wody, kierując się oznaczoną stroną w kierunku powierzchni wody. Namocz membranę przez 15 minut.</li>
	<li>Wytnij 4 kawałki bibuły I do wymiarów podkładki z włókna.</li>
	<li>Przygotuj kanapkę z żelem do umieszczenia szarej strony kasety w dół na czystej tacy.</li>
	<li>Wstępnie zwilż podkładkę z włókna i umieść ją na kasecie. Usuń pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wstępnie zwilż jeden kawałek bibuły w 1x TBE i umieść na podkładce z włókna. Usuń pęcherzyki powietrza, tocząc plastikową pipetę po papierze. Połóż kolejny kawałek wstępnie zwilżonej bibuły i usuń pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij żel z kasety biegowej i umieść go na zestawie kanapkowym, tak aby pierwsza załadowana próbka RNA znajdowała się w prawo.</li>
	<li>Delikatnie zanurz wstępnie nasączoną membranę w 1x TBE i umieść ją na żelu, stroną skierowaną do dołu. Rozwałkuj, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Zanurz kawałek bibuły, połóż go na membranie i usuń pęcherzyki powietrza. Zanurz kolejny kawałek bibuły, połóż go na kanapce i usuń pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Uzupełnij kanapkę, umieszczając wstępnie zwilżoną podkładkę z włókna na zestawie i mocno zamknij kasetę.</li>
	<li>Umieść kasetę z transblotem w module i napełnij 1x TBE, pH 8,2 do kreski bibuły.</li>
	<li>Przelew przy napięciu 10 V, przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po przeniesieniu umieść wilgotną membranę na arkuszu papieru i natychmiast usieciuj RNA z membraną poprzez napromieniowanie światłem UV o długości 254 nm (120 000 μdżuli/cm²). Usieciowana plama może być przechowywana w temperaturze 4 °C w celu dalszej hybrydyzacji.</li>
</ol>
6. Przygotowanie sondy znakowanej radioaktywnie
<ol>
	<li>Zaprojektuj sondę, która jest całkowicie komplementarna w stosunku do małego RNA, które ma być wykryte.</li>
	<li>Oznacz końcówkę sondy za pomocą ƳP32ATP (otrzymanego z BRIT) na jej końcu 5', łącząc składniki zgodnie z recepturą podaną w Tabeli 1.</li>
	<li>Inkubować powyższą mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Oddzielić nieoznakowany ƳP32ATP od sondy za pomocą kolumny Sephadex G-25 zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
7. Hybrydyzacja plamy
<ol>
	<li>Umieść skrzyżowaną usieciowaną plamę, RNA stroną skierowaną do góry w butelce do hybrydyzacji.</li>
	<li>Energicznie wymieszać ultraczuły bufor do hybrydyzacji, dodać do niego 10 ml i inkubować blot w piecu do hybrydyzacji utrzymywanym w temperaturze 35 °C, z rotacją.</li>
	<li>Wykonaj wstępną hybrydyzację przez 20 minut.</li>
	<li>Wyjmij butelkę z piekarnika i delikatnie dodaj opisaną sondę do buforu hybrydyzacyjnego.</li>
	<li>Hybrydyzować blot w temperaturze 35 °C, obracając się przez 12 godzin.</li>
	<li>Po hybrydyzacji ostrożnie przenieść roztwór hybrydyzacyjny do probówki o pojemności 15 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ponownego użycia.</li>
	<li>Wykonaj szybkie płukanie blot przez 2 minuty, aby usunąć nadmiar roztworu hybrydyzacyjnego, dodając 2x bufor SSC plus 0,5% SDS. Wyrzuć roztwór.</li>
	<li>Inkubować blot z 2x buforem SSC plus 0,5% SDS przez 35 °C, z rotacją przez 30 min.</li>
	<li>Ponownie przemyć blot 0,5x buforem SSC plus 0,5% SDS przez 35°C, obracając się przez 30 min.</li>
	<li>Umieść plamę w pokrywie hybrydyzacyjnej, usuń nadmiar buforu i zamknij go.</li>
	<li>Wystaw go na noc na ekran kamery z wolnym luminoforem w kasecie.</li>
	<li>Wykryj sygnał hybrydyzacji za pomocą obrazowania biomolekularnego i przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Usunąć blot poprzez inkubację w temperaturze 80 °C, z rotacją przez 30 minut z buforem 0,5 X SSC plus 0,1% SDS i 0,1 X buforem SSC plus 0,1% SDS przez 30 min.</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Metoda ta może być szeroko stosowana do wykrywania i kwantyfikacji małych RNA, w tym mniej obfitych miRNA. Protokół opisuje głównie etapy denaturacji całkowitego RNA w buforze ładującym, separacji wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, transferu RNA do membrany, sieciowania RNA na błonie i hybrydyzacji przy użyciu pożądanych radioznakowanych sond oligo.
Krytycznym krokiem w każdym eksperymencie z blottingiem jest użycie dobrej jakości RNA do przygotowania próbki. Przed załadowaniem żeli na...

Niedawne odkrycie małych regulatorowych RNA, mikroRNA, doprowadziło do badań nad ich zrozumieniem i ich rolą w roślinach i zwierzętach1. Długie prekursory miRNA są przetwarzane na dojrzałe miRNA od 21 do 24 nt przez HYL1 i specyficzne białka podobne do dicer2,3. 22 nt miRNA może zainicjować kaskadowe wyciszanie poprzez generowanie wtórnych siRNAs4. Badania wykazały rolę miRNA i drugorzędowych siRNA w rozwoju, losie komórek i reakcjach na stres5,6.
Hybrydyzacja północna jest metodą eksperymentalną rutynowo stosowaną do wykrywania specyficznych cząsteczek RNA. Ta metoda dostosowuje jej zastosowanie do wykrywania około 19 -24 nt długich małych RNA z puli całkowitych RNAs7. W tej demonstracji ilustrujemy zastosowanie tej techniki do wykrywania i kwantyfikacji miRNA. Metoda ta wykorzystuje znakowanie sond przy użyciu izotopów promieniotwórczych; w ten sposób poziomy miRNA w próbce można wykryć ze zwiększoną czułością. W przeciwieństwie do metod opartych na PCR, metoda ta zapewnia kwantyfikację ekspresji, a także określenie wielkości miRNA. W tym protokole pokazujemy kluczowe kroki, które poprawiają wykrywanie miRNA. Zmodyfikowaliśmy etapy blottingu i hybrydyzacji w celu uzyskania detekcji sygnału miRNA o wysokiej rozdzielczości. Technika ta może być również stosowana do wykrywania innych endogennych małych RNA, takich jak siRNA, tasi-drugorzędowe RNA i snoRNA.

<table><tbody><tr><td>40% roztwór akryloamidu i bisakryloamidu</td><td>Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła</td><td>Whatmann Bibuła I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania kapilar</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td></td><td>Ambion AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Eppendorff</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N + membrana nylonowa</td><td>GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do hybrydyzacji</td><td>Sigma</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Thermo Scientific</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>GE- Skaner Typhoon</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Ekran i kaseta PhosphorImager</td><td>GE healthcare</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Gilson, modele: P20 i P10</td><td>FA10002M, FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta plastikowa</td><td>Falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Aparat z żelem poliakrylamidowym</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 kolumna</td><td>GE healthcare</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Speed Vac</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa</td><td></td> Spinwin Tarsons 1010 <td></td> T4 (PNK)NEB M0201S <td></td></tr><tr><td>Aparat transblot</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> ULTRAHyb <td></td></tr><tr><td> Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fischer Scientific</td><td>15985</td><td></td></tr><tr><td>Środek sieciujący UVP</td><td></td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Tarsons</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen cyjanol</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza plam rna w celu wykrywania i kwantyfikacji mikrorna roślin

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MikroRNA (miRNA) to klasa endogennie wyrażanych, niekodujących, ~21 nt małych RNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów zarówno u roślin, jak i zwierząt. Większość miRNA działa jako ujemne przełączniki ekspresji genów ukierunkowanych na kluczowe geny. U roślin pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) są generowane przez polimerazę RNA II i tworzą różne długości stabilnych struktur pętli łodygowych zwanych pre-miRNA. Endonukleaza, podobna do Dicer-like1, przetwarza pre-miRNA w dupleksy miRNA-miRNA*. Jedna z nici z dupleksu miRNA-miRNA* jest wybierana i ładowana do białka Argonaute 1 lub jego homologów, aby pośredniczyć w rozszczepianiu docelowych mRNA. Chociaż miRNA są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi, ich wykrywanie często odbywa się za pomocą mniej niż optymalnych metod opartych na PCR, zamiast czułej analizy northern blot. Opisujemy prostą, niezawodną i niezwykle czułą metodę północną, która jest idealna do ilościowego oznaczania poziomów miRNA z bardzo wysoką czułością, dosłownie z każdej tkanki roślinnej. Dodatkowo metoda ta może być wykorzystana do potwierdzenia wielkości, stabilności i obfitości miRNA i ich prekursorów.

W niniejszej demonstracji wykryliśmy i określiliśmy poziom ekspresji miR397 w różnych tkankach indica ryż zmienna whiteponni (Rysunek 1). miR397 jest konserwatywnym miRNA o długości 22 nt. Ekspresję miR397 można wykryć we wszystkich badanych próbkach. Zgodnie z danymi sekwencjonowania nowej generacji, próbka 1 (tkanka siewki) wykazuje poziom miR397 na poziomie 5 odczytów na milion (rpm). Sygnał ten został wyraźnie wykryty, co wskazuje na bardzo wysoką czułość metody, która ...

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Cześć. To jest mały północny protokół RNA. Jest to pochodna protokołu pierwotnie zoptymalizowanego przez dr Rashida Akbergenowa.W tej metodzie można bardzo precyzyjnie i w bardzo wysokiej rozdzielczości wykryć małe RNA o długości od 20 do 24 nukleotydów. Protokół jest w zasadzie zmodyfikowaną formą tradycyjnej analizy północnej, ale tutaj procent akrylamidu jest dość wysoki i wynosi 15 procent. Ten północny może być używany do wykrywania już znanego małego RNA, mikro RNA lub innego zestawu małego RNA, gdy sekwencja jest znana, lub może być używany do potwierdzenia obfitości małego RNA pochodzącego ze zbiorów danych sekwencjonowania nowej generacji.Zaletą tej metody jest to, że można nie tylko patrzeć na obfitość mikro RNA, ale także na obfitość prekursorów, na przykład mikro RNA mogą pominąć prekursor o długości około 30 do kilkuset nukleotydów, który może być również wykryty jednocześnie, wraz z mikro RNA. Protokół jest bardzo prosty, bardzo bezpośredni, ale należy być bardzo ostrożnym podczas wykonywania niektórych krytycznych kroków, które są wymienione na końcu tego protokołu. Aby przygotować 10 ml mieszanki żelowej, dodaj 4,8 grama mocznika, 3,75 ml 40% roztworu akrylamidu i 1 ml świeżo przygotowanego 10X TBE, pH 8,2 i delikatnie wymieszaj roztwór.Całkowicie rozpuść mocznik, podgrzewając mieszaninę w łaźni wodnej, aż roztwór będzie klarowny. Uzupełnić objętość do 10 ml przy użyciu sterylnej wody MilliQ i schłodzić mieszaninę żelu do temperatury pokojowej. Umyj wymagane urządzenie detergentem, delikatnie je wyszoruj, aby usunąć resztki KZM i akrylamidu.Następnie spłucz je wodą MilliQ i pozostaw do wyschnięcia. Zmontuj szklaną płytkę razem, upewnij się, że obie są na tym samym poziomie. Połóż je mocno na gąbce.Do mieszanki żelowej dodaj 8 mikrolitrów TEMED i 80 mikrolitrów 10% świeżo przygotowanego APS. Delikatnie wymieszaj i wlej mieszankę żelową na zmontowane płytki. Upewnij się, że żel nie przecieka.Ostrożnie umieść grzebień. Pozostaw żel do polimeryzacji przez około 45 minut. Po polimeryzacji żelu należy usunąć szklane płytki z zespołu.Umyj szklane płytki wodą MilliQ. I umieść je w kasecie biegowej. Umieść kasetę jezdną wewnątrz zbiornika.Wlać świeżo przygotowany 1X TBE, pH 8,2. Ostrożnie wyjmij grzebień. Dokładnie umyć dołki żelu, pipetując bufor.Ten etap usuwa osady mocznika ze studzienki i ułatwia równomierny przepływ RNA po żelu. Zamknij pokrywę aparatu i wstępnie uruchom pusty żel pod napięciem 80 V przez 30 minut, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków z buforu. W celu przygotowania 10 ml barwnika ładującego należy odważyć 5 mg błękitu bromofenolowego, 5 mg cyjanolu ksylenowego, dodać 10 ml odjoinizowanego formamidu i dobrze wymieszać.Podziel barwnik i przechowuj w temperaturze 4 stopni do dalszego wykorzystania. Podwielokrotność 10 mikrogramów całkowitego RNA do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że jakość RNA, czyli stosunek 260:230 jest większa lub bliższa dwóm. Umieść probówkę w regulatorze speedVac i wysusz próżniowo próbki. Ponownie zawiesić wysuszone próbki RNA w 8 mikrolitrach barwnika ładującego.Podgrzewać próbki w temperaturze 98 stopni przez dwie minuty. Schłodzić je przez minutę w temperaturze pokojowej. Schłodzone próbki RNA należy przemieszać wirowo, aby zapewnić prawidłową re-zawiesinę w barwniku ładującym.Zakręć rurkami. Powtórz kroki podgrzewania, chłodzenia i wirowania trzy razy, aby uzyskać swobodnie płynący RNA. Zatrzymaj wstępny bieg żelu.Przed załadowaniem próbki należy dokładnie umyć studzienki, aby usunąć osady mocznika znajdujące się wewnątrz studzienek. Podgrzewaj ponownie zawieszone próbki RNA w temperaturze 98 stopni przez jedną minutę. Załaduj gorące próbki do studzienek za pomocą końcówek kapilarnych.Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zakończ ładowanie wszystkich próbek i załóż pokrywę. Uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez trzy godziny lub do momentu, gdy błękit bromofenolowy całkowicie zniknie.Do transferu użyj dodatnio naładowanej membrany nylonowej. Przytnij go do wymiarów szklanej płyty. Oznacz membranę w prawym górnym rogu.Delikatnie umieść membranę na powierzchni sterylnej wody MilliQ, upewnij się, że etykieta jest skierowana w dół, przodem do powierzchni wody. Weź czystą tacę i przygotuj kanapkę z żelem do elektrotransferu. Umieść szarą stronę kasety w dół.Wlej 1X TBE nieco powyżej poziomu kasety. Wstępnie zwilż wkładkę z włókna w 1X TBE i ściśnij ją, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przytnij dwa kawałki bibuły do rozmiaru podkładki z włókna.Zwilż kawałek bibuły w 1X TBE i umieść go na podkładce z włókna. Usuń pęcherzyki powietrza, tocząc plastikową pipetę po papierze. Zwilż wstępnie kolejny kawałek bibuły w 1X TBE i połóż go na kasecie.Przewróć się, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Teraz zestaw kanapkowy jest gotowy do elektrotransferu. Po zakończeniu elektroforezy zatrzymaj bieg i zdejmij pokrywę z aparatu.Wyjmij kasetę biegową z konfiguracji. Wyjmij szklane płytki z kasety jezdnej. Ostrożnie wyjmij żel z zespołu.Połóż go na bibule tak, aby pierwsza załadowana próbka RNA znajdowała się po prawej stronie. Delikatnie zanurz wstępnie nasączoną membranę w 1X TBE i umieść ją na żelu, stroną skierowaną do oznaczonej strony w dół. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany i żelu.Delikatnie przewróć na bok, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Zanurz jeden kawałek bibuły w 1X TBE i połóż go na membranie. Usuń pęcherzyki powietrza.Umieść kolejny kawałek bibuły i usuń pęcherzyki powietrza. Uzupełnij kanapkę, kładąc podkładkę z włókna na zespole. Mocno zamknij kasetę.Umieść kasetę trans-blot w module. Napełnij zbiornik 1X TBE, pH 8,2, aż do znaku bibuły. Zamknij pokrywę aparatu i przenieś pod napięciem 10 V przez noc w temperaturze 4 stopni lub w chłodnym pomieszczeniu.Utrzymuj środek sieciujący UV w gotowości i ustaw go na 1200, tuż przed zakończeniem elektrotransferu. Po zakończeniu przenoszenia wyjmij kasetę z modułu. Umieść wilgotną membranę na arkuszu A4, kładąc zaznaczoną stroną do góry.Połącz RNA z błoną przez naświetlanie światłem UV o długości 254 nanometrów o prędkości 120 milidżuli. Usieciowana plama może być przechowywana w temperaturze czterech stopni lub używana do hybrydyzacji. Zaprojektuj sondę, która jest całkowicie komplementarna w stosunku do małego RNA, które ma zostać wykryte.Oznacz końcówkę sondy na jej pięciu głównych końcach za pomocą enzymu PNK i połącz składniki, jak pokazano. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut. Po 30 minutach inkubacji za pomocą kolumn G-25 oddzielić nieznakowane sondy od mieszaniny reakcyjnej.Aby poprawić etykietowanie sondy, przygotuj kolumnę G-25 przed użyciem. Umieść blot, RNA stroną do góry, w butelce do hybrydyzacji. Przed użyciem energicznie wymieszać bufor hybrydyzacyjny.Dodaj do środka 10 ml buforu do hybrydyzacji i umieść butelkę do hybrydyzacji w piecu do hybrydyzacji, utrzymuj w temperaturze 35 stopni z rotacją. Wykonuj wstępną hybrydyzację przez 20 do 30 minut. Po wstępnej hybrydyzacji wyjmij butelkę z piekarnika.Delikatnie dodaj oznakowaną sondę do buforu hybrydyzacyjnego. Upewnij się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Inkubuj blot w piekarniku w temperaturze 35 stopni z obrotem przez 12 godzin.Po hybrydyzacji usuń bufor hybrydyzacyjny z butelki. Wykonaj szybkie płukanie plam za pomocą bufora do płukania-I. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia nadmiaru roztworu hybrydyzacyjnego z plam.Dalej inkubować bloty w temperaturze 35 stopni przez 30 minut, używając buforu do płukania I. Wykonaj kolejne pranie przy użyciu buforu II w temperaturze 35 stopni przez 30 minut. Po umyciu blot umieść go w pokrywie hybrydyzacyjnej, usuń nadmiar buforu i zamknij.Umieść go w kasecie i wystaw na 12 godzin na ekranie fosfodonu wolnym od promieniowania. Wykryj sygnał hybrydyzacji za pomocą biomolekularnego imagera tajfunu i przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania ImageJ. W celu hybrydyzacji blot z innymi sondami należy wykonać kroki usuwania powłoki, jak pokazano na ilustracji.Dzięki tej technice można oszacować obfitość mikro RNA, a także jego długość. Na tym obrazie można wykryć ekspresję mikro RNA 397 we wszystkich próbkach. W tej plamie obfitość pierwszej próbki wynosi około 5 odczytów na milion, zgodnie z danymi sekwencjonowania nowej generacji, co sugeruje, że nasza technika może również wykryć mniej obfite mikro RNA.Ponadto, korzystając z oprogramowania do kwantyfikacji ImageJ, można określić ilościowo ekspresję mikro 397 wśród próbek. Tutaj użyliśmy U6 i mikro RNA 168 jako kontroli obciążenia. Opowiem o kilku kluczowych krokach, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentu.Upewnij się, że używasz dobrej jakości RNA do przygotowania próbki. Podczas suszenia próżniowego próbek należy unikać ich nadmiernego suszenia. Ponowna zawiesina RNA w barwniku ładującym ma kluczowe znaczenie.Upewnij się, że przygotowałeś swobodnie płynącą próbkę. Należy zachować ostrożność podczas ładowania żelu. Studzienki z żelem muszą zostać umyte, a próbka musi zostać załadowana do studzienek w linii prostej.Podczas elektrotransferu niezbędne jest rozprowadzenie membrany w wodzie, tuż przed zanurzeniem jej w 1X TBE, co poprawia transfer. Hybrydyzacja blot musi być wykonana w temperaturze 35 stopni. Utrzymuj temperaturę pieca do hybrydyzacji.W przypadku wielokrotnego stosowania plam membrany należy przechowywać w temperaturze 4 stopni. Powinny być utrzymywane w stanie wilgotnym w 2X SSE. W przeciwieństwie do innych metod opartych na PCR, metoda ta zapewnia kwantyfikację ekspresji, a także określenie wielkości mikro RNA.

rna-blot-analysis-for-detection-quantification-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy northern blot, technikę hybrydyzacji do wykrywania i ilościowego oznaczania mikroRNA (miRNA) z całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanki roślinnej.

Northern Blot do wykrywania i ilościowego oznaczania specyficznego mikroRNA w całkowitym ekstrakcie RNA tkanki roślinnej

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Rurociąg bioinformatyczny, a mianowicie miRDeep-P2 (w skrócie miRDP2), z aktualnymi kryteriami miRNA roślin i przebudowanym algorytmem, mógłby dokładnie i efektywnie analizować transkryptomy mikroRNA u roślin, szczególnie dla gatunków o złożonych i dużych genomach.

Rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Prezentujemy nowy i w pełni zautomatyzowany potok miRNA, mirMachine, który 1) może dokładniej identyfikować znane i nowe miRNA oraz 2) jest w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny. Użytkownicy mogą teraz wykonać krótki skrypt przesyłania, aby uruchomić w pełni zautomatyzowany potok mirMachine.

mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj zmodyfikowaną metodę northern hybridization do wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin o długości 20-24 nukleotydów z wysoką rozdzielczością. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę ekspresji małych RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Przeglądaj więcej filmów