Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten ludzki system indukcji połączeń nerwowo-mięśniowych może być używany do indukowania tworzenia składników pre i postsynaptycznych, w tym neuronów ruchowych, mięśni szkieletowych i komórek Schwanna. Nie tylko można uzyskać dojrzałą, złożoną strukturę NMJ w pojedynczym naczyniu hodowlanym z pojedynczej początkowej populacji komórek, ale uzyskany NMJ ma również zdolność do kurczenia się. Metoda ta ma potencjał w badaniu chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak rdzeniowy zanik mięśni, oraz w badaniach przesiewowych związków terapeutycznych.

Zróżnicowany NMJ jest bardzo grubą, złożoną tkanką i jest trudny do wizualizacji. Demonstrując procedurę, możemy poinstruować czytelników, jak identyfikować konkretne struktury. Umyj komórki trzema mililitrami PBS przed dodaniem jednego mililitra roztworu oddzielającego komórki do szalki Petriego.

Po 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj trzy mililitry pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych do każdej studzienki i delikatnie pipetuj trzy razy, aby oddzielić komórki od szkiełek nakrywkowych. Następnie połącz odłączone supernatanty zawierające komórki macierzyste w 50-mililitrowej stożkowej probówce do odwirowania i ponownie zawieś osad komórek macierzystych w trzech mililitrach świeżej pożywki dla embrionalnych komórek macierzystych naczelnych uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK do liczenia. Następnie rozcieńczyć komórki do dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr pożywki uzupełnionej stężeniem inhibitora ROCK i zwrócić dwa mililitry komórek do każdego szkiełka nakrywkowego w każdym dołku sześciodołkowej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową.

Po 24 godzinach zastąpić supernatant w każdym dołku dwoma mililitrami świeżej pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty dwoma mililitrami pożywki różnicującej uzupełnionej doksycykliną na dołek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 dni. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty dwoma mililitrami miogenicznej pożywki różnicującej uzupełnionej doksycykliną na studzienkę i zwrócić płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 10 dni.

Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty dwoma mililitrami pożywki ze złączem nerwowo-mięśniowym na dołek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na 30 dni. Pod koniec inkubacji uwidocznij zróżnicowane połączenia nerwowo-mięśniowe za pomocą mikroskopii odwróconej. Aby wywołać skurcze rurki mięśniowej, dodaj 25 milimolowy chlorek wapnia do każdej studzienki zróżnicowanych komórek połączenia nerwowo-mięśniowego.

W ciągu jednej do dwóch minut od zabiegu umieść płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu. Korzystając z mikroskopii żywych komórek, nagraj film ze skurczu rurki przez 20 sekund. Na końcu nagrania dodaj 300 nanogramów na mililitr kurary do pożywki hodowlanej i nagrywaj film przez kolejne 20 sekund przed otwarciem pliku filmowego w odpowiednim oprogramowaniu do analizy wektorów ruchu w celu analizy.

W celu identyfikacji neuronów można przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne naczyń synaptycznych neurofilamentów i receptorów acetylocholiny. Neurony ruchowe można zidentyfikować za pomocą barwienia TUJ 1 i Islet 1, podczas gdy postsynaptyczne miorurki można zidentyfikować przez barwienie łańcucha ciężkiego miozyny. Komórki Schwanna można znakować przeciwciałem S-100.

Na tych obrazach ze skaningowej mikroskopii elektronowej można zaobserwować morfologię dojrzałych połączeń nerwowo-mięśniowych z wyraźną wizualizacją rozszerzonych zakończeń aksonów, aksonów i włókien mięśniowych. Transmisyjna mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do wizualizacji dojrzałej ultrastruktury składników nerwowo-mięśniowych, w tym presynaptycznego zakończenia aksonu z pęcherzykami synaptycznymi i regionu postsynaptycznego, który jest oddzielony szczeliną synaptyczną. Fałdy połączeniowe wyznaczają połączenie między neuronem a włóknami mięśniowymi.

Tutaj pokazano dojrzałe zakończenia aksonów, które zawierają pęcherzyki synaptyczne. Podsumowując, te cechy morfologiczne wskazują, że komponenty nerwowo-mięśniowe były dobrze indukowane i dojrzałe. Ocena funkcjonalna komórek ujawnia, że wyraźne sygnały ruchu połączeń nerwowo-mięśniowych mogą być indukowane przez chlorek wapnia i że skurcze te mogą być przerywane przez kurarę, co potwierdza, że sygnały neuronu ruchowego są przekazywane przez połączenie nerwowo-mięśniowe w celu wywołania skurczu mięśni.

Gęstość wysiewu komórek wpływa na efektywność tworzenia NMJ. Można go modyfikować, aby dostosować się do protokołu, zgodnie z celami eksperymentalnymi. Ta hodowla połączeń nerwowo-mięśniowych zawiera wiele typów komórek, a składniki te można wykorzystać do badania interakcji między tymi komórkami podczas rozwoju połączenia nerwowo-mięśniowego lub w odpowiedzi na określone patologie chorobowe.