Name: Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę generowania dojrzałych połączeń nerwowo-mięśniowych z ludzkich iPSC w ciągu miesiąca. Protokół umożliwia modelowanie chorób neuromięśniowych i badanie przesiewowe leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Sakurai za uprzejme udostępnienie 201B7MYOD. Badania nad mikroskopią elektronową były wspierane przez Keiko Okamoto-Furuta i Haruyasu Kohda (Wydział Badań Mikroskopowych Elektronów, Centrum Badań Anatomicznych, Podyplomowa Szkoła Medyczna, Uniwersytet w Kioto). Przeciwciało monoklonalne zostało opracowane przez HHMI/Columbia University, uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank, utworzonego przez National Institute Child Health and Human Development NIH i utrzymywanego na Wydziale Biologii Uniwersytetu Iowa. Dziękujemy również Shiori Oshimie, Kazuhiro Nakagawie i Eriko Matsui za analizę wektorów ruchu. Prace te były finansowane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI, granty o numerach 16H05352 i 20H03642 (dla MKS); Fundusz Badań nad Komórkami iPS (do CYL i MKS); Fundacja Badań Medycznych i Farmaceutycznych im. Mochidy Memorial (do MKS); Fundacja Naukowa Takeda (do MKS); oraz grant z Programu Badań nad Chorobami Nieuleczalnymi z wykorzystaniem komórek iPS specyficznych dla choroby, który był wspierany przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (17935400 dla CYL i MKS, a 17935423 dla MKS).

1. Przygotowanie płytek pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć ECM (patrz tabela materiałów) lodowatym 1x PBS do końcowego stężenia 2%.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml ECM do 49 ml 1x PBS w plastikowej tubie o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 1 szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na płytce 6-dołkowej. Dodaj 1,5 ml 2% ECM do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować płytkę studzienki z 2% ECM przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać ECM z płytki studzienki i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
</ol>
2. Zróżnicowanie iPSC w kierunku NMJ
<ol>
	<li>Wysiewać 4 x 105 iPSC na basenik na płytce 6-dołkowej przygotowanej w sekcji 1. Upewnij się, że komórki na szkiełku nakrywkowym są wstępnie osadzone w studzience. 
	UWAGA: W tym badaniu wykorzystano linię komórkową 201B7MYOD iPS, dar od laboratorium dr Sakurai'a15.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę z iPSC na 6 cm naczyniu hodowlanym i umyj iPSC raz za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu oddzielającego komórki do naczynia i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodaj 3 ml pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych (ES) do naczynia i delikatnie odpipetuj 3 razy.</li>
		<li>Zebrać supernatant, który zawiera odłączone iPSC, do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 160 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant, ponownie zawiesić iPSC w 3 ml pożywki dla komórek ES naczelnych z 10 μM Y27632 i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Rozcieńczyć iPSC pożywką z komórek ES naczelnych i 10 μM Y27632 do stężenia 2 x 105 komórek/ml. Dodać 2 ml iPSC na szkiełko nakrywkowe wstępnie osadzone w studzience opisanej w sekcji 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja iPSC do NMJ
	<ol>
		<li>W dniu 1, 24 godziny po wysianiu iPSC na płytkę 6-dołkową, usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 2 ml świeżej pożywki z komórek ES naczelnych zawierającej 1 μg/ml doksycykliny do każdego dołka.</li>
		<li>Zmienić pożywkę z 2 ml miogenicznej pożywki różnicującej (MDM) (Tabela 1) zawierającej 1 μg/ml doksycykliny (stężenie końcowe) do każdej studzienki. Odświeżaj podłoże codziennie od 2 do 10 dnia.</li>
		<li>Od 11 dnia zmieniaj pożywkę na 2 ml pożywki NMJ (Tabela 1) do każdego dołka. Odświeżaj pożywkę co 3-4 dni, a następnie do 30 dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj zróżnicowany NMJ za pomocą mikroskopii odwróconej fazy w 30 dniu. NMJ można wykorzystać do następującej analizy.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
<ol>
	<li>W 30 dniu odessać pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej. Utrwal kulturę NMJ, dodając 2 ml 4% paraformaldehydu do każdej studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć próbki 3 razy, dodając 2 ml 1x PBS do każdej studzienki (3 minuty na każde przemycie).</li>
	<li>Próbki należy przepuszczać 0,1% Tritonem/PBS przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Zablokować próbki 0,5% BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Próbki należy inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczenie przeciwciał jest następujące: wysepka 1 (1 μg/ml), łańcuch ciężki miozyny (MYH) (1/300), neurofilamenty (NF) (1 μg/ml), S-100 (1/300), białko pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2) (1 μg/ml), Tuj1 (1/1000).</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Próbki inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Stężenie zastosowanych przeciwciał drugorzędowych jest następujące: skoniugowane anty-mysie IgG 488 (0,1 μg/ml), anty-królicze IgG 488 sprzężone (0,1 μg/ml).</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Próbki należy inkubować z aBTX-647 (0,5 μg/ml) do barwienia AChR i z DAPI (1 μg/ml) do barwienia jądra.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Podnieść szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z płytki 6-dołkowej i umieścić je w 50% roztworze glicerolu/PBS na szkiełku mikroskopowym.</li>
</ol>
4. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
<ol>
	<li>Utrwalić kulturę NMJ za pomocą 4% paraformaldehydu i 1% aldehydu glutarowego przygotowanych w 0,1 M buforze fosforanu potasu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Próbki należy przemyć 3 razy, zanurzając je w 0,1 M buforze fosforanu potasu w temperaturze pokojowej (10 minut na każde przemycie).</li>
	<li>Odwodnić próbki przy rosnących stężeniach etanolu (dwukrotnie 50%, 70%, 90%, 95% i 100%). Zanurzyć próbki w każdym stężeniu etanolu na 10 minut.</li>
	<li>Wysuszyć próbki w suszarce w punkcie krytycznym (-30 °C, 0,1 Torr).</li>
	<li>Pokryć próbki powlekarką jonową Pt (platyna) (30 mA przez 3 min; grubość Pt wynosi około 20 nm).</li>
	<li>Obserwacje próbek za pomocą SEM przy napięciu 5 kV.</li>
</ol>
5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
<ol>
	<li>Użyj skrobaka do komórek, aby pobrać tkankę z płytki hodowlanej NMJ. Uformuj tkankę w małą kulkę (3 mm3) za pomocą żyletki i sklej przez żelowanie, aby utworzyć kawałek owinięty żelem. Utrwalić kawałek owinięty żelem za pomocą 2% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego przygotowanych w 0,1 M buforze fosforanu potasu w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemyć próbki 3 razy, zanurzając je w 0,1 M buforze fosforanu potasu (15 minut na każde przemycie) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Utrwalić próbki 1% tetratlenkiem osmu przygotowanym w podwójniedestylowanym H2Oprzez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie chemicznym.</li>
	<li>Powtórz krok 5.2.</li>
	<li>Odwodnić próbki przy rosnących stężeniach etanolu (dwukrotnie 50%, 70%, 90%, 95% i 100%). Zanurzyć próbki w każdym stężeniu etanolu na 10 minut.</li>
	<li>Odessać 100% etanol. Infiltrować próbki o rosnących proporcjach objętości żywicy epoksydowej do mieszanin 100% etanolu (1:3, 1:1 i 3:1). Delikatnie mieszaj każdą mieszaninę przy 10 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp mieszaninę epoksydowo-etanolową czystą żywicą epoksydową i delikatnie mieszaj przy 10 obr./min przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 4 godzinach odświeżyć żywicę epoksydową świeżą żywicą epoksydową i delikatnie mieszać z prędkością 10 obr./min przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zanurzyć próbki w kapsułkach do zatapiania ze świeżą żywicą epoksydową i utwardzić próbki w piecu w temperaturze 65 °C przez noc.</li>
	<li>Ultramikrotomia
	<ol>
		<li>Grubo przyciąć bloki próbki pod mikroskopem preparacyjnym, aby uzyskać prawidłową orientację.</li>
		<li>Drobno przyciąć grubo przycięte bloki szklanym nożem na ultramikrotomie, aby uzyskać gładkie powierzchnie.</li>
		<li>Przygotuj ultracienkie sekcje o długości 70 nm z dobrze przyciętych bloków za pomocą diamentowego noża. Odzyskaj ultracienkie sekcje za pomocą siatek miedzianych o siatkach 200 pokrytych formą węglową.</li>
		<li>Ultracienkie odcinki zawierające kratki zabarwić nasyconym octanem uranylu przygotowanym w podwójnie destylowanymH2Oprzez 30 minut i przemyć kratki 3 razy podwójnie destylowanymH2O(10 minut na każde pranie).</li>
		<li>Następnie porównaj ultracienkie skrawki z cytrynianem ołowiu Reynoldsa19 (2,5%) przez 5 minut i umyj przegotowanymH2Owstępnie schłodzonym do temperatury pokojowej 3 razy (10 minut na każde pranie). Umieść kilka granulek wodorotlenku sodu wokół obszaru barwienia, aby zapobiec wytrącaniu się CO2 na sekcjach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwować ultracienkie przekroje za pomocą TEM przy napięciu 70 kV.</li>
</ol>
6. Skurcze mięśni i kurara
<ol>
	<li>Aby wywołać skurcz rurki mięśniowej, dodaj 25 mM CaCl2 do pożywki hodowlanej w kroku 2.3. Ruch miotub można zaobserwować w ciągu 1\u20122 min.</li>
	<li>Umieść 6-dołkową płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu. Nagraj film ze skurczem miotubówki za pomocą mikroskopii żywych komórek.</li>
	<li>Aby zatrzymać skurcz rurki mięśniowej, dodaj kurarę do pożywki hodowlanej (300 ng/ml). Następnie nagraj film zgodnie z krokiem 6.2.</li>
	<li>Otwórz plik filmowy za pomocą oprogramowania do analizy wektorów ruchu, a następnie kliknij przycisk Analiza ruchu, aby przeanalizować film. 
	UWAGA: Skurcz myotubes jest pokazany jako grafika ruchu w czasie. Filmy są oznaczone kolorami, aby pokazać prędkość ruchu myotubes. Kolorowe błyszczące sygnały wskazują ruchy miotubes, gdzie kolor czerwony pokazuje najszybszą prędkość ruchu, a kolor niebieski pokazuje najwolniejszą prędkość ruchu.</li>
</ol>

<ol><li>Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHong%2C+IHK+%22eLS%22">eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Human+Neuromuscular+Junctions%3A+Some+Unanswered+Molecular+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183(2017).</li>
<li>Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-disease+comparison+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy+reveals+conservation+of+selective+vulnerability+but+differential+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).</li>
<li>Shigemoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+weakness+and+neuromuscular+junctions+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Geriatrics+%26+Gerontology+International%22%5BJournal%5D)">Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease.</a> Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).</li>
<li>Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Myasthenic+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">Congenital Myasthenic Syndromes.</a> GeneReviews. , (2016).</li>
<li>Faravelli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+derivation+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%3A+experimental+approaches+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).</li>
<li>Demestre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+characterisation+of+neuromuscular+junctions+between+hiPSC+derived+motoneurons+and+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+early+phenotype+at+the+neuromuscular+junction+of+spinal+muscular+atrophy+using+patient-derived+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).</li>
<li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+studying+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).</li>
<li>Uzel, S. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+the+formation+of+optically+excitable%2C+three-dimensional%2C+compartmentalized+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units.</a> Science Advances. 2 (8), 1501429(2016).</li>
<li>Santhanam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+phenotypic+human+neuromuscular+junction+model+for+dose+response+evaluation+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics.</a> Biomaterials. 166, 64-78 (2018).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Tanaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+reproducible+myogenic+differentiation+from+human+iPS+cells%3A+prospects+for+modeling+Miyoshi+Myopathy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro.</a> PLoS One. 8 (4), 61540(2013).</li>
<li>Furlan, A., Adameyko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+precursor%3A+a+neural+crest+cell+in+disguise%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise.</a> Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+Cell+Precursors%3B+Multipotent+Glial+Cells+in+Embryonic+Nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).</li>
<li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+functional+human+neuromuscular+junctions+model+the+pathophysiology+of+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases.</a> JCI Insight. 4 (18), (2019).</li>
<li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li>
<li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Connectivity+under+Optogenetic+Control+Allows+Modeling+of+Human+Neuromuscular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).</li>
<li>Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+Challenges+in+Modeling+Diseases+Involving+Spinal+Motor+Neuron+Degeneration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniejsze badania opisywały metody tworzenia NMJ in vitro z wyrafinowanymi metodami, które wymagają długotrwałej hodowli 8,10,12,13,20. Osiągnięcia te prowadzą do progresji NMJ in vitro. Jednak skomplikowane metodologie utrudniały dostęp do badań nad NMJ. Nasz protokół pozwala uniknąć kohodowli w celu wydajnego i solidnego generowania NMJ w jednym dołku. W naszym systemie indukcji zaobserwowano trzy typy komórek w NMJ, w tym miotuby, neurony ruchowe i komórki Schwanna18. Ponadto zweryfikowano dojrzałą morfologię i funkcję.
Opierając się na naszym poprzednim badaniu, początkowa gęstość komórek jest krytycznym czynnikiem tworzenia NMJ, a różne gęstości komórek indukują różną liczbę NMJ w kulturze18. Niska gęstość komórek (< 1 x 104 / cm2) indukowała małą liczbę neuronów, co jest niekorzystne dla tworzenia NMJ. Chociaż przygotowanie większej gęstości komórek zajęłoby znacznie więcej czasu i zasobów (> 1 x 105/cm2), zalecamy, aby gęstość komórek wynosiła od 1,5 x 104/cm2 do 5 x 104/cm2 przy użyciu naszego protokołu. NMJ generowany przez ten protokół jest niejednorodną tkanką z wieloma typami komórek, która jest bliższa naśladowaniu warunków fizjologicznych. Stwierdzono, że miorurki równomiernie rozmieszczają się na szalce hodowlanej, ale neurony ruchowe pojawiają się losowo, z czego zjawisko to powoduje nierównomierne rozmieszczenie NMJ w hodowli. Ten NMJ nadaje się do badań jakościowych zamiast analizy wymagającej jednorodnych systemów hodowli. Użyliśmy również innych linii komórkowych, eq., H9 (linia komórkowa ES)18 i A11 (linia komórkowa iPS, dane nie pokazane) do wygenerowania NMJ za pomocą tego protokołu. NMJ może być z powodzeniem generowany pod względem morfologii i funkcji. Niemniej jednak warunki hodowli muszą być zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych.
Chemicznie wywołany skurcz miotubek i hamowanie zależne od kurary potwierdziły, że nasz NMJ in vitro jest funkcjonalny i może być potencjalnie zastosowany do praktycznych testów. Spontaniczne skurcze mięśni obserwowano losowo po 3–4 tygodniach hodowli, ale można było tego uniknąć, wydłużając czas hodowli nawet do dwóchmiesięcy18.
Opublikowano różne strategie wytwarzania in vitro NMJ na różnych etapach dojrzewania, ale NMJ wytworzony in vitro w naszym systemie wykazał znaczną dojrzałość, ponieważ możemy zaobserwować przejście podjednostek gamma do epsilon AChR podczas hodowli18. Dojrzałość jest ważnym czynnikiem branym pod uwagę w modelowaniu choroby za pomocą NMJ21 in vitro. Podsumowując, NMJ in vitro ze zintegrowanymi komponentami strukturalnymi, dojrzałością i funkcją jest potencjalnie przydatny w rozwoju terapeutycznym.

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowana synapsa, która przekazuje sygnały z neuronów ruchowych do mięśni szkieletowych w celu kontrolowania dobrowolnych ruchów mięśni1,2. Synapsa ta składa się z części pre- i postsynaptycznych. W części presynaptycznej neuron ruchowy uwalnia acetylocholinę (ACh) z pęcherzyków synaptycznych przez egzocytozę. ACh jest uwalniany z pęcherzyków synaptycznych w celu przekroczenia szczeliny synaptycznej i związania się z AChR w części postsynaptycznej, aby wywołać potencjał czynnościowy do skurczu mięśni3,4. Każde uszkodzenie tej delikatnej struktury może powodować choroby NMJ, w tym rdzeniowy zanik mięśni (SMA), wrodzone zespoły miasteniczne (CMS), miastenię (MG)5,6,7, itd. Choroby te znacznie pogarszają jakość życia pacjentów i niestety nie mają skutecznych metod leczenia ze względu na brak zrozumienia patologicznego mechanizmu. W tym badaniu naszym celem było wygenerowanie ludzkiego NMJ in vitro z ludzkich iPSC w celu dokładnego modelowania choroby i badań przesiewowych związków terapeutycznych.
Poprzednie badania wykazały możliwość generowania in vitro NMJ za pomocą strategii współhodowli. Generowane są odpowiednio neurony ruchowe i miorurki szkieletowe. Te dwa typy komórek mogą być generowane z pierwotnych kultur tkanek ludzkich lub mysich lub indukowane z komórek macierzystych8,9,10,11, a następnie hodowane wspólnie w celu utworzenia NMJ. Dalsze zastosowania obejmują łączenie współhodowanego NMJ w mikroprzepływowe urządzenia 3D oraz wykorzystanie jednostek optogenetycznych do ilościowych testów funkcjonalnych12,13. Jednak strategie te wymagają długiego okresu hodowli i wymagają walki, aby uzyskać jednocześnie podstawowe składniki NMJ, albo neuron ruchowy, albo miorurkę szkieletową. Jeszcze jeden ważny składnik NMJ, komórka Schwanna, nie może być generowany w tych systemach hodowlanych. Zaawansowany system hodowli, który zawiera miotubę, neuron ruchowy i komórkę Schwanna, jest pożądany, ponieważ może zaoferować wiarygodny i solidny model do badań NMJ.
Różnicowanie miogeniczne 1 (MYOD1) jest dobrze znanym regulatorem miogennym dla miogenezy14. Skuteczna metoda różnicowania miogenicznego, w której zastosowano MYOD1 do wprowadzenia iPSC do miotubek, została opracowana w poprzednim badaniu15. W związku z tym indukowaliśmy miotube'y poprzez nadekspresję MYOD1 w iPSCs15 i wykazano wysoką skuteczność różnicowania miogenicznego. Co ciekawe, komórki neuronalne pojawiły się wraz z miotubami spontanicznie po 10 dniu. Pojawienie się komórek neuronalnych w kulturze miogennej skłoniło nas do opracowania strategii generowania NMJ in vitro w jednym naczyniu. Tutaj przedstawiamy strategię generowania NMJ poprzez nadekspresję MYOD1 w ludzkich iPSC w celu indukcji neuronów miogennych i ruchowych w tej samej naczyniu hodowlanej. Neurony ruchowe są indukowane spontanicznie przez kilka czynników neurotroficznych (GDNF, BDNF, NT3 itp.)8, a tymczasem komórki Schwanna mogą być również indukowane16,17. Poprzez interakcje między miotubami, neuronami ruchowymi i komórkami Schwanna, powstaje dojrzały NMJ18. Metoda ta może skutecznie generować funkcjonalny NMJ, umożliwiając potencjalne badanie mechanizmów patologicznych i badania przesiewowe związków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td><silny>Średni, czynniki wzrostu i odczynniki</td><td>Item</td><td>Marka</td><td>Cat. Numer</td></tr><tr><td></td><td>2-merkaptoetanol</td><td>Nacalai tesque</td><td>21418-42</td></tr><tr><td></td><td>B27, Gibco</td><td>Gibco</td><td>12587-001</td></tr><tr><td></td><td>BDNF</td><td>R & D Systems</td><td>248-BD</td></tr><tr><td></td><td>Roztwór do odłączania komórek, Accumax</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07921</td></tr><tr><td></td><td>Suszarka punktu krytycznego</td><td>Hitachi</td><td>ES-2030</td></tr><tr><td></td><td>Doksycyklina</td><td>Takara</td><td>631311</td></tr><tr><td></td><td>ECM, Matrigel (obniżony czynnik wzrostu)</td><td>Corning</td><td>356230</td></tr><tr><td></td><td>GDNF</td><td>R & D Systems</td><td>212-GD</td></tr><tr><td></td><td>Żelowanie, żel IP</td><td>Geno Staff</td><td>PG20-1</td></tr><tr><td></td><td>Powlekarka jonowa</td><td>JEOL</td><td>JEC3000FC</td></tr><tr><td></td><td>iPSC medium, mTeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td></tr><tr><td></td><td>KnockOut SR (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td></tr><tr><td></td><td>mikroskopia żywych komórek</td><td>Mikroskop Nikon</td><td>Eclipse Ti</td></tr><tr><td></td><td>MEM-alpha</td><td>Gibco</td><td>12571-071</td></tr><tr><td></td><td>Oprogramowanie do analizy wektorów ruchu</td><td>Sony</td><td>SI8000</td></tr><tr><td></td><td>N2, Gibco</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td></td><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td></tr><tr><td></td><td>NT3</td><td>R & D Systems</td><td>267-N3</td></tr><tr><td></td><td>Pożywka komórkowa ES naczelnych</td><td>ReproCell</td><td>RCHEMD001</td></tr><tr><td></td><td>SEM</td><td>Hitachi</td><td>S-4700</td></tr><tr><td></td><td>TEM</td><td>Hitachi</td><td>H7650</td></tr><tr><td></td><td>Y27632</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>253-00513</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała<</td><td>strong>Marka </td><td><silny>Kat. Liczba</mocny></td><td><silny>Rozcieńczenia</mocny></td></tr><tr><td></td><td>Sondy molekularne</td><td>B3545</td><td>0,5 ug/ml</td></tr><tr><td>Wysepka 1</td><td>DSHB</td><td>40,2D6</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Łańcuch ciężki miozyny (MYH)</td><td>MiliporeSigma</td><td>A4.1025</td><td>1/300</td></tr><tr><td>Neurofilamenty (NF)</td><td>MiliporeSigma</td><td>MAB5254</td><td>1/500</td></tr><tr><td>S-100</td><td>Abcam</td><td>ab14849</td><td>1/300</td></tr><tr><td>Białko pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2)</td><td>DSHB</td><td>SV2</td><td>1/50</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Covance</td><td>MMS435P</td><td>1/1000</td></tr></tbody></table>

połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowana synapsa, która przekazuje potencjały czynnościowe z neuronu ruchowego do mięśni szkieletowych w celu mechanicznego ruchu. Architektura struktury NMJ wpływa na funkcje neuronu, mięśnia i wzajemne interakcje. Wcześniejsze badania opisywały wiele strategii poprzez kokulturację neuronów ruchowych i miotubek w celu wytworzenia NMJ in vitro ze złożonym procesem indukcji i długim okresem hodowli, ale miały trudności z odtworzeniem dojrzałej morfologii i funkcji NMJ. Nasz system indukcji NMJ in vitro jest skonstruowany poprzez różnicowanie ludzkiego iPSC w jednej szalce hodowlanej. Poprzez przełączenie miogennej i neurogennej pożywki indukcyjnej na indukcję, otrzymany NMJ zawierał składniki pre- i postsynaptyczne, w tym neurony ruchowe, mięśnie szkieletowe i komórki Schwanna w miesięcznej hodowli. Test funkcjonalny NMJ wykazał również, że skurcz miotub może być wywołany przez Ca++, a następnie hamowany przez kurarę, inhibitor receptora acetylocholiny (AChR), w którym sygnał stymulujący jest przekazywany przez NMJ. To proste i solidne podejście z powodzeniem pozwoliło na uzyskanie złożonej struktury NMJ z funkcjonalną łącznością. Ten ludzki NMJ in vitro, ze swoimi zintegrowanymi strukturami i funkcją, ma obiecujący potencjał w zakresie badania mechanizmów patologicznych i badań przesiewowych związków.

Stosując naszą strategię różnicowania, w hodowli w 30. dniu zaobserwowano komponenty presynaptyczne i postsynaptyczne NMJ. Komponenty NMJ zostały indukowane i dobrze rozwinięte w pojedynczej studzience, a ich morfologia oraz lokalizacja w NMJ zostały wykazane za pomocą mikroskopii IF (Rysunek 1). Schemat blokowy na Rysunku 1A podsumowuje przebieg czasowy procesu różnicowania NMJ. Barwienie neurofilamentów (NF), pęcherzyków synaptycznych (SV2) i AChR (Rysunek 1B,C) wskazuje neurony. Pojedyncze obrazy barwień NF i SV2 przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1. Barwienie alfa-bungarotoksyną wskazuje AChR (Rysunek 1C). Obraz złożony pokazuje względne położenie neuronu ruchowego i AChR w NMJ (Rysunek 1D,E). Drugi zestaw barwień IF wskazuje neuron ruchowy za pomocą Tuj1 i Islet 1 (Rysunek 1G,H) oraz postsynaptyczne miotuby za pomocą ciężkiego łańcucha miozyny (Rysunek 1I). Komórki Schwanna w hodowli NMJ zostały również oznakowane przeciwciałem S-100 (Rysunek uzupełniający 2).
Aby dodatkowo potwierdzić tożsamość komponentów NMJ, zastosowano SEM do szczegółowej analizy morfologicznej. Morfologię dojrzałego NMJ z rozszerzonymi zakończeniami aksonów, aksonami i włóknami mięśniowymi przedstawiono na Rysunku 2A,B. Wykonano TEM w celu ujawnienia dojrzałej ultrastruktury komponentów NMJ, w tym presynaptycznego zakończenia aksonu z pęcherzykami synaptycznymi oraz części postsynaptycznej, oddzielonych szczeliną synaptyczną (Rysunek 2C‒E). Fałdy połączenia zaznaczono żółtą przerywaną linią, która wyznacza miejsce styku neuronu i włókien mięśniowych (Rysunek 2C). Dojrzałe zakończenia aksonów zawierające pęcherzyki synaptyczne pokazano na Rysunku 2D,E (żółte strzałki). Wyniki morfologiczne wykazują, że komponenty NMJ zostały prawidłowo indukowane i dojrzały.
Aby ocenić funkcję złącza neuromięśniowego (NMJ) in vitro, przeprowadzono analizę ruchu poprzez stymulację neuronu ruchowego za pomocą CaCl2 w celu wywołania skurczów miotub). Wyniki wykazały, że Ca2+ może wywoływać skurcze mięśni. Skurcze te mogły zostać przerwane przez kurarę. NMJ wykazało wyraźne sygnały ruchu, które zanikały po zastosowaniu kurary (Rysunek 3). Efekt ten potwierdza, że sygnały z neuronu ruchowego były przekazywane przez NMJ w celu wywołania skurczu mięśnia. Podsumowując, dane z mikroskopii IF, SEM i TEM zademonstrowały rozkład przestrzenny, morfologię i dojrzałość komponentów NMJ w złączu neuromięśniowym in vitro wytworzonym zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Analiza ruchu potwierdziła funkcjonalność NMJ in vitro, co wskazuje na jego potencjalne zastosowanie w opracowywaniu strategii terapeutycznych.
<img alt="Schemat różnicowania komórek macierzystych z obrazami fluorescencyjnymi pokazującymi wyniki miogenne i neurogenne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61396/61396fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat indukcji NMJ oraz obrazy IF hodowli NMJ.(A) Schemat przebiegu różnicowania NMJ. (B‒F) Detekcja komponentów NMJ, neurofilamentów (NF), pęcherzyków synaptycznych (SV2) i AChR. Białe strzałki w panelu D wskazują NMJ. (G‒K) Komponenty presynaptyczne i postsynaptyczne NMJ. Tuj1 i Islet1 wskazują neuron ruchowy, a ciężki łańcuch miozyny (MYH) wskazuje miotubę. a-BTX, alfa-bungarotoksyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikrografie elektronowe interfejsu neuron-mięsień przedstawiające zakończenia aksonalne, pęcherzyki synaptyczne, włókna mięśniowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61396/61396fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazy SEM i TEM dojrzałego NMJ. (A) Rozkład przestrzenny komponentów NMJ przedstawia zakończenie aksonalne zakotwiczone na powierzchni włókna mięśniowego (Mf). (B) Powiększenie NMJ pokazuje zakończenia aksonalne. (C) Ultrastruktura dojrzałego NMJ z presynaptycznym zakończeniem aksonalnym (czerwone groty strzałek) i pęcherzykami synaptycznymi (Sv), szczeliną synaptyczną (Sc) oraz częściami postsynaptycznymi (czerwone strzałki). Fałdy synaptyczne (jf) zostały zaznaczone żółtą linią przerywaną. Ax, akson. (D, E) Obrazy o dużym powiększeniu pokazują pęcherzyki synaptyczne w zakończeniach aksonalnych (żółte strzałki). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy ruchu przed i po podaniu kurary; ruch w funkcji czasu; wynik badania aktywności mięśni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61396/61396fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza skurczu miotubul w in vitro NMJ.Skurcze miotubul zostały wywołane roztworem 25 mM CaCl2 (linia zielona). Skurcze zostały zahamowane po zastosowaniu kurary (linia żółta). Prosimy również o zapoznanie się z Filmem uzupełniającym 1 oraz Filmem uzupełniającym 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Film uzupełniający 1: Skurcz miotubul wywołany Ca++. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/Suppl_movie_1_Before_add_curare.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film uzupełniający 2: Przedstawiono znacznie słabszy skurcz miotub przez leczenie kurarą. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/Suppl_movie_2_After_add_curare.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Obrazy pojedynczego barwienia neurofilamentów (NF, białe strzałki) w hodowli NMJ. Obrazy pojedynczego barwienia pęcherzyków synaptycznych (SV2, białe strzałki) w hodowli NMJ. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Komórki Schwanna znakowane przeciwciałem S-100 w hodowli NMJ. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396supfig02.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywka do różnicowania miogennego (MDM)</td>
			<td>MEM-alpha</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mM 2-ME</td>
			<td>1117μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Doksycyklina</td>
			<td>1μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>KSR</td>
			<td>56 ml (stężenie końcowe 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>łącznie</td>
			<td>560 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM 2-merkaptoetanolu</td>
			<td>2-merkaptoetanolo</td>
			<td>7μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>woda podwójnie destylowana</td>
			<td>993μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>całkowity</td>
			<td>1000μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka NMJ</td>
			<td>pożywka Neurobasal (NB)</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>B27</td>
			<td>1x (stężenie zapasu 50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BDNF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GDNF</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>N2</td>
			<td>1x (roztwór zapasowy 100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NT3</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pożywki.

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Ten ludzki system indukcji połączeń nerwowo-mięśniowych może być używany do indukowania tworzenia składników pre i postsynaptycznych, w tym neuronów ruchowych, mięśni szkieletowych i komórek Schwanna. Nie tylko można uzyskać dojrzałą, złożoną strukturę NMJ w pojedynczym naczyniu hodowlanym z pojedynczej początkowej populacji komórek, ale uzyskany NMJ ma również zdolność do kurczenia się. Metoda ta ma potencjał w badaniu chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak rdzeniowy zanik mięśni, oraz w badaniach przesiewowych związków terapeutycznych.Zróżnicowany NMJ jest bardzo grubą, złożoną tkanką i jest trudny do wizualizacji. Demonstrując procedurę, możemy poinstruować czytelników, jak identyfikować konkretne struktury. Umyj komórki trzema mililitrami PBS przed dodaniem jednego mililitra roztworu oddzielającego komórki do szalki Petriego.Po 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj trzy mililitry pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych do każdej studzienki i delikatnie pipetuj trzy razy, aby oddzielić komórki od szkiełek nakrywkowych. Następnie połącz odłączone supernatanty zawierające komórki macierzyste w 50-mililitrowej stożkowej probówce do odwirowania i ponownie zawieś osad komórek macierzystych w trzech mililitrach świeżej pożywki dla embrionalnych komórek macierzystych naczelnych uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK do liczenia. Następnie rozcieńczyć komórki do dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr pożywki uzupełnionej stężeniem inhibitora ROCK i zwrócić dwa mililitry komórek do każdego szkiełka nakrywkowego w każdym dołku sześciodołkowej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową.Po 24 godzinach zastąpić supernatant w każdym dołku dwoma mililitrami świeżej pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty dwoma mililitrami pożywki różnicującej uzupełnionej doksycykliną na dołek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 dni. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty dwoma mililitrami miogenicznej pożywki różnicującej uzupełnionej doksycykliną na studzienkę i zwrócić płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 10 dni.Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty dwoma mililitrami pożywki ze złączem nerwowo-mięśniowym na dołek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na 30 dni. Pod koniec inkubacji uwidocznij zróżnicowane połączenia nerwowo-mięśniowe za pomocą mikroskopii odwróconej. Aby wywołać skurcze rurki mięśniowej, dodaj 25 milimolowy chlorek wapnia do każdej studzienki zróżnicowanych komórek połączenia nerwowo-mięśniowego.W ciągu jednej do dwóch minut od zabiegu umieść płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu. Korzystając z mikroskopii żywych komórek, nagraj film ze skurczu rurki przez 20 sekund. Na końcu nagrania dodaj 300 nanogramów na mililitr kurary do pożywki hodowlanej i nagrywaj film przez kolejne 20 sekund przed otwarciem pliku filmowego w odpowiednim oprogramowaniu do analizy wektorów ruchu w celu analizy.W celu identyfikacji neuronów można przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne naczyń synaptycznych neurofilamentów i receptorów acetylocholiny. Neurony ruchowe można zidentyfikować za pomocą barwienia TUJ 1 i Islet 1, podczas gdy postsynaptyczne miorurki można zidentyfikować przez barwienie łańcucha ciężkiego miozyny. Komórki Schwanna można znakować przeciwciałem S-100.Na tych obrazach ze skaningowej mikroskopii elektronowej można zaobserwować morfologię dojrzałych połączeń nerwowo-mięśniowych z wyraźną wizualizacją rozszerzonych zakończeń aksonów, aksonów i włókien mięśniowych. Transmisyjna mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do wizualizacji dojrzałej ultrastruktury składników nerwowo-mięśniowych, w tym presynaptycznego zakończenia aksonu z pęcherzykami synaptycznymi i regionu postsynaptycznego, który jest oddzielony szczeliną synaptyczną. Fałdy połączeniowe wyznaczają połączenie między neuronem a włóknami mięśniowymi.Tutaj pokazano dojrzałe zakończenia aksonów, które zawierają pęcherzyki synaptyczne. Podsumowując, te cechy morfologiczne wskazują, że komponenty nerwowo-mięśniowe były dobrze indukowane i dojrzałe. Ocena funkcjonalna komórek ujawnia, że wyraźne sygnały ruchu połączeń nerwowo-mięśniowych mogą być indukowane przez chlorek wapnia i że skurcze te mogą być przerywane przez kurarę, co potwierdza, że sygnały neuronu ruchowego są przekazywane przez połączenie nerwowo-mięśniowe w celu wywołania skurczu mięśni.Gęstość wysiewu komórek wpływa na efektywność tworzenia NMJ. Można go modyfikować, aby dostosować się do protokołu, zgodnie z celami eksperymentalnymi. Ta hodowla połączeń nerwowo-mięśniowych zawiera wiele typów komórek, a składniki te można wykorzystać do badania interakcji między tymi komórkami podczas rozwoju połączenia nerwowo-mięśniowego lub w odpowiedzi na określone patologie chorobowe.

in-vitro-neuromuscular-junction-induced-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę generowania pobudzających neuronów korowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Po indukcji doksycykliny hiPSC wykazują nadekspresję neurogeniny-2, czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla neuronów. Dzięki zastosowaniu specyficznych pożywek i wspólnej hodowli z astrocytami, proces ten ułatwia różnicowanie się hiPSC w neurony z połączeniami synaptycznymi.

Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony na układach mikroelektrod

Ten eksperyment szczegółowo opisuje metodę generowania połączeń nerwowo-mięśniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wykorzystuje etapowy proces różnicowania w celu promowania rozwoju neuronów mięśniowych i ruchowych oraz tworzenia synaps, dając funkcjonalne połączenia nerwowo-mięśniowe.

Indukcja in vitro połączeń nerwowo-mięśniowych z modyfikowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Tutaj prezentujemy metodę dla ludzkiego modelu in vitro uszkodzenia rozciągającego w formacie 96-dołkowym w skali czasowej istotnej dla traumy uderzeniowej. Obejmuje to metody wytwarzania rozciągliwych płytek, ilościowego określania mechanicznej zniewagi, hodowli i uszkadzania komórek, obrazowania i analizy wysokiej zawartości w celu ilościowego określenia urazu.

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Ten protokół umożliwia szybką i efektywną konwersję indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej, poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych z indukowalnych wektorów piggyBac.

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Poznaj metodę generowania dojrzałych połączeń nerwowo-mięśniowych z ludzkich iPSC w ciągu miesiąca. Protokół umożliwia modelowanie chorób neuromięśniowych i badanie przesiewowe leków.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów