Name: Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę pomiaru wiązania ATP z receptorami w czasie rzeczywistym przy użyciu FRET i fluorescencyjnie znaczonych białek. Technika ta umożliwia precyzyjne monitorowanie dynamiki receptorów w środowisku komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Raulowi Terronowi Exposito za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały sfinansowane przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BB/R002517/1; MCP i FMA) oraz Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

<ol><li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li>
<li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases%3A+excitement+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li>
<li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNG+and+HCN+channels%3A+two+peas%2C+one+pod%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li>
<li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strict+coupling+between+CFTR%27s+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1%3A+A+Mechanistic+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li>
<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li>
<li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K%28%2B%29+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103(2019).</li>
<li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K%2B+channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775(2020).</li>
<li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li>
<li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li>
<li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+%27cell+cortices%27+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li>
<li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase%2FtRNA+expression+and+engineered+eRF1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li>
<li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562(2015).</li>
<li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li>
<li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding%2C+gating%2C+affinity+and+efficacy%3A+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li>
<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li>
<li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li>
<li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7(2003).</li>
<li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li>
<li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K%28V%29+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K%28%2B%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li>
<li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li>
<li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li>
<li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li>
<li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876(2017).</li>
<li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1%2C+P2X3%2C+and+heteromeric+P2X2%2F3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li>
<li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opracowaliśmy metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych w czasie rzeczywistym z nienaruszonymi białkami błonowymi. Nasza metoda opiera się na kilku innych uznanych technikach, w tym znakowaniu białek za pomocą ANAP przy użyciu tłumienia kodonu bursztynowego stop12, odsłaniania komórek14 i fluorometrii zaciskowej napięcia / PCF 19,20,21,22,23,24,25. Synteza tych podejść pozwala na pomiar wiązań nukleotydów z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Rzeczywiście, w naszej poprzedniej pracy byliśmy w stanie rozróżnić różne miejsca wiązania na tym samym kompleksie białkowym przy użyciu tego podejścia10,11. Co ważne, technika ta może być bezpośrednio zastosowana do niewielkich ilości białka w środowisku komórkowym w warunkach zachowania funkcji białka. Zastosowanie naszej metody wiązania w połączeniu z bezpośrednim, elektrofizjologicznym odczytem prądów kanałów jonowych pozwala nam uzyskać bogaty wgląd w molekularne podstawy bramkowania kanału11.
Ponieważ spektrometry są niestandardowym sprzętem laboratoryjnym, intensywność ANAP może być również monitorowana we względnej izolacji za pomocą filtrów pasmowo-przepustowych. Rysunek 5B przedstawia właściwości spektralne dwóch takich filtrów. Filtr pasmowo-przepustowy 470/10 nm skutecznie odsiewa sygnał fluorescencji od TNP-ATP i dobrze pokrywa się ze szczytową fluorescencją ANAP. Jednak szczytowa przepuszczalność tego filtra wynosi tylko około 50%, co może utrudnić uzyskanie dobrych sygnałów z membran (lub w wyciętych łatach membranowych pod cęgami napięciowymi). Inną opcją jest filtr pasmowo-przepustowy 460/60 nm. W porównaniu z filtrem 470/10 nm filtr 460/60 nm i stopa piku emisji TNP-ATP pokrywają się nieco bardziej. Jednak pasmo 460/60 nm ma przepuszczalność 90-95% w szerokim zakresie piku ANAP, co powinno zwiększyć sygnał emisji fluorescencji.
ANAP jest wrażliwym na środowisko fluoroforem 12,26,27. Emisja szczytowa i wydajność kwantowa różnią się w zależności od miejsca włączenia do białka będącego przedmiotem zainteresowania i mogą się zmieniać, gdy białko zmienia konformację. Takie zmiany byłyby natychmiast widoczne na podstawie widm emisyjnych, ale nie byłyby tak oczywiste, gdy intensywność ANAP jest mierzona za pomocą filtrów. W każdym przypadku wymagane są odpowiednie kontrole w celu wykazania, że sygnał fluorescencji nie zmienia się z powodu zmian w środowisku lokalnym wokół ANAP po związaniu nukleotydów. Eksperymenty kontrolne z nieznakowanymi nukleotydami mogą pomóc w sprawdzeniu, czy wszelkie zmiany intensywności ANAP są wynikiem FRET między nukleotydami ANAP i TNP. Nukleotydy TNP mogą wiązać się niespecyficznie z błonami pochodzącymi z komórek nietransfekowanych (albo z błoną plazmatyczną, albo z natywnymi białkami błonowymi)10. Określamy ilościowo wiązanie jako zmniejszenie fluorescencji dawcy, ponieważ sygnał ten jest specyficzny dla znakowanego kanału. Zalecamy jednak przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów kontrolnych dla każdej pary agonista/receptor, na przykład mutacji miejsca wiązania nukleotydu, jeśli jest znane, w celu sprawdzenia, czy zmiana fluorescencji donora jest rzeczywiście wynikiem bezpośredniego wiązania z znakowanym receptorem11. Na koniec zaleca się pracę z konstruktami, które oprócz znacznika ANAP zawierają znacznik białka fluorescencyjnego. Pomaga to odróżnić znakowaną fluorescencję receptora od tła/autofluorescencji. Fluorescencję tła można odróżnić od ANAP na podstawie piku i kształtu widm emisyjnych10, ale takie oznaczenia mogą być bardzo trudne, gdy używane są tylko zestawy filtrów. Dodatkowo, komórki i niezadaszone błony eksprymujące receptory fluorescencyjne można zidentyfikować za pomocą znacznika białka fluorescencyjnego bez konieczności wzbudzania ANAP i ryzyka nadmiernego fotowybielania.
W wielu naszych zapisach PCF zaobserwowaliśmy silny ujemny pik w naszych widmach przy wysokich stężeniach TNP-ATP (Figura 4C). Ten ujemny szczyt jest artefaktem naszego protokołu odejmowania tła. Rysunek 4D przedstawia obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne pipety punktowej wystawionej na działanie 1 mM TNP-ATP. Widoczny jest cień na końcówce pipety, wynikający z wykluczenia TNP-ATP z objętości ścianek pipety, który jest najbardziej widoczny w płaszczyźnie ostrości. Obraz widmowy na rysunku 4E pokazuje ciemne pasmo, odpowiadające temu cieniowi. Gdy obszar powyżej lub poniżej tego ciemnego pasma jest używany do odejmowania tła, tworzy ujemny szczyt. Co ważne, pik ten wystąpił w zakresie długości fal odpowiadającym emisji TNP-ATP i nie wpłynął na nasze pomiary wygaszania ANAP.
Głównym ograniczeniem naszych eksperymentów było uzyskanie odpowiedniej ekspresji błony plazmatycznej konstruktów znakowanych ANAP do pomiaru fluorescencji. Ogólnie rzecz biorąc, łatwiej było uzyskać wysokiej jakości widma z membran niezadaszonych niż z PCF, ze względu na ich większy rozmiar i naszą zdolność do szybkiego skanowania całej czaszy z membranami bez dachu, w przeciwieństwie do PCF, gdzie łaty można uzyskać tylko pojedynczo. W naszych eksperymentach dane z membran bez dachu i eksperymentów z PCF były podobne, ale nie równoważne (Figura 6)11. Nie ma jednak a priori powodu, dla którego miałoby to być uniwersalne spostrzeżenie, ponieważ białka w pipecie z plastrem mogą być w innym stanie funkcjonalnym niż te w błonach bez dachu.
W tym przypadku podjęto próby maksymalizacji ekspresji naszych konstruktów znakowanych ANAP, w szczególności obniżając temperaturę hodowli komórkowej do 33 °C 10,11,16. Z naszego doświadczenia wynika, że próba zidentyfikowania miejsc w białku, w których ANAP byłby konserwatywną substytucją, nie zawsze skutkowała konstruktami o dobrej ekspresji. Odnieśliśmy większy sukces w systematycznym skanowaniu całych regionów białkowych w poszukiwaniu miejsc inkorporacji ANAP i badaniach przesiewowych kandydatów na ekspresję powierzchniową10. System znakowania ANAP działa również w oocytach Xenopus laevis, co pozwala na wycinanie znacznie większych płatów błony, zwiększając w ten sposób sygnał do szumu 26,27,28.
Podczas gdy oczekuje się, że większe poziomy ekspresji spowodują jaśniejsze sygnały, minimalna liczba kanałów wymagana do pomiaru fluorescencji zależy od kilku czynników, w tym jasności fluoroforu, stopnia fotowybielania, intensywności światła wzbudzającego i płaszczyzny ostrości. Teoretycznie szacunki można by dokonać poprzez skorelowanie intensywności fluorescencji i prądu kanału, jak wykazano wcześniej 28,29. Jednak wiarygodność takich szacunków wymaga pewnej wiedzy na temat przewodności pojedynczego kanału i otwartego prawdopodobieństwa kanału. Oprócz czynników wymienionych powyżej, na sygnał fluorescencyjny będą miały również wpływ kanały związane z pęcherzykami lub odcinkami błony plazmatycznej przyklejonymi do szkła pipety, które nie są pod napięciem clamp.
Metoda ta jest łatwo przystosowana do badania innych kanałów jonowych wrażliwych na nukleotydy. CFTR jest strukturalnie podobny do dodatkowej podjednostki receptora sulfonylomocznika KATP 30,31. Podobnie jak KATP, CFTR bramkowanie jest kontrolowane przez wiązanie nukleotydów, co czyni go oczywistym przyszłym celem naszej metody7. Purynergiczne receptory P2X to kanały jonowe bramkowane zewnątrzkomórkowym ATP9. TNP-ATP działa jako antagonista receptorów P2X32,33. Dlatego nie będzie przydatny do badania aktywacji P2X, chociaż może być stosowany w testach konkurencji z agonistami P2X. Alternatywnie, do badania aktywacji można zastosować inne fluorescencyjne pochodne ATP o wystarczającym nakładaniu się widma z emisją ANAP. Alexa-647-ATP jest fluorescencyjnym agonistą receptora P2X34. Obliczone R0 między Alexa-647 a ANAP wynosi ~85 A, co oznacza, że bezpośrednie wiązanie z P2X powinno spowodować znaczne wygaszenie ANAP wbudowanego w kanał. Jednak tak długie R0 spowoduje również wygaszanie z Alexa-647-ATP związane z sąsiednimi podjednostkami i zwiększa prawdopodobieństwo, że niespecyficzne wiązanie nukleotydów spowoduje FRET. Ponieważ miejsce wiązania liganda w receptorach P2X jest zewnątrzkomórkowe, pomiary wiązania byłyby wykonywane na nienaruszonych komórkach, w zacisku napięciowym całej komórki lub w łatach błonowych na zewnątrz. Nasza metoda może być również rozszerzona o badanie wiązania i aktywacji elektrogennych i nieelektrogenicznych transporterów i pomp, które zależą od ATP w swoim cyklu reakcji, a także receptorów P2Y sprzężonych z białkiem G. Wreszcie, mimo że opracowaliśmy tę metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), to samo podejście można zastosować do badania wiązania z praktycznie każdym receptorem, dla którego zidentyfikowano odpowiedni, fluorescencyjny ligand.

Kilka ważnych klas białek jest bezpośrednio regulowanych przez wiązanie ligandów. Obejmują one zarówno rozpuszczalne enzymy, jak i białka osadzone w błonie, w tym receptorowe kinazy tyrozynowe, receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) i kanały jonowe. GPCR i kanały stanowią odpowiednio ~34% i ~15% wszystkich obecnych celów leków1,2. W związku z tym istnieje znaczne zainteresowanie biochemiczne, a także medyczne opracowywaniem metod, które zapewniają mechanistyczny wgląd w interakcje ligand-receptor. Tradycyjne metody pomiaru wiązania ligandów, w tym znakowanie fotopowinowactwem i badania wiązania radioligandów, wymagają dużych ilości częściowo oczyszczonego białka i są zwykle wykonywane w niefizjologicznych warunkach i skalach czasowych. Idealna metoda wymagałaby jedynie niewielkich ilości białka, mogłaby być wykonywana na nienaruszonych białkach ulegających ekspresji w środowisku komórkowym lub błonowym, mogłaby być monitorowana w czasie rzeczywistym i byłaby kompatybilna z bezpośrednimi odczytami funkcji białek.
Förster resonance energy transfer (FRET) to metoda, która wykrywa bliskość między dwiema fluorescencyjnie oznaczonymi cząsteczkami3. FRET występuje, gdy wzbudzony fluorofor donorowy przekazuje energię w sposób nieradiacyjny do cząsteczki akceptora (zwykle innego fluoroforu). Transfer energii powoduje wygaszenie emisji fluorescencji donora i uwrażliwienie emisji akceptora (jeśli akceptorem jest fluorofor). Wydajność transferu zależy od6-tej potęgi odległości między dawcą a akceptorem. Ponadto dawca i akceptor muszą znajdować się w pobliżu (zwykle mniej niż 10 nm), aby wystąpił FRET. W związku z tym FRET można wykorzystać do pomiaru bezpośredniego wiązania między znakowanym fluorescencyjnie receptorem białkowym a fluorescencyjnym ligandem.
Kilka różnych białek jest regulowanych lub aktywowanych przez wiązanie wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych nukleotydów adeninowych (ATP, ADP, AMP, cAMP). Wiele białek transportowych wymaga hydrolizy ATP w swoim cyklu reakcji, w tym transportery kasetowe wiążące ATP i ATPazy typu P, takie jak Na+/K+ pump4,5. Kanały K+ wrażliwe na ATP (KATP), transbłonowy regulator przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i kanały regulowane cyklicznymi nukleotydami to wszystkie kanały jonowe, które są bramkowane przez wiązanie wewnątrzkomórkowych nukleotydów adeninowych, dzięki czemu są wyjątkowo wrażliwe na zmiany w metabolizmie komórkowym i transdukcji sygnału6,7,8. Purynergiczne receptory P2X i P2Y reagują na zmiany w zewnątrzkomórkowym ATP, które może być uwalniane jako neuroprzekaźnik lub w wyniku uszkodzenia tkanki9. Opracowaliśmy test oparty na fret do pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z białkami błonowymi w czasie rzeczywistym. Wcześniej zastosowaliśmy tę metodę do badania wiązania nukleotydów z kanałami KATP10,11.
Aby zmierzyć wiązanie nukleotydów za pomocą FRET, interesujące nas białko musi najpierw zostać oznaczone fluoroforem. Znacznik fluorescencyjny musi być umieszczony w białku będącym przedmiotem zainteresowania w sposób specyficzny dla danego miejsca, tak aby znajdował się wystarczająco blisko miejsca wiązania liganda, aby wystąpił FRET, ze szczególną ostrożnością w celu zapewnienia, że znacznik nie wpływa na ogólną strukturę i funkcję białka. Aby to osiągnąć, stosujemy technikę opracowaną przez Chatterjee i wsp., wykorzystującą bursztynową supresję kodonu stop do wprowadzenia fluorescencyjnego niekanonicznego aminokwasu (l-3-(6-acetylonaftaleno-2-ylamino)-2-aminopropionowego; ANAP) w żądanej witrynie12. Mierzymy wiązanie nukleotydów jako FRET między białkiem znakowanym ANAP a fluorescencyjnymi pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych (TNP) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Widmo emisyjne dla ANAP pokrywa się z widmem absorbancji nukleotydów TNP, co jest warunkiem niezbędnym do wystąpienia FRET (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Poniżej przedstawiamy dwa różne rodzaje eksperymentu z wiązaniem. W pierwszym przypadku wiązanie nukleotydów z wewnątrzkomórkową stroną kanałów KATP znakowanych ANAP mierzy się w komórkach, które zostały odłupane przez sonikację, pozostawiając przylegające fragmenty błony plazmatycznej na szklanym szkiełku nakrywkowym10,11,13,14.
W drugiej metodzie, wiązanie nukleotydów z kanałami KATP znakowanymi przez ANAP jest mierzone w łatce membranowej pod zaciskiem napięcia, co pozwala na jednoczesny pomiar prądów jonowych i fluorescencji. Łącząc te dwa eksperymentalne podejścia, zmiany w wiązaniach mogą być bezpośrednio skorelowane ze zmianami w funkcji kanału11. Omówiono typowe wyniki, potencjalne pułapki i analizę danych.

<table><tbody><tr><td>Kolba poddana hodowli tkankowej T75</td><td>StarLab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>0,1% w/v poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>30 mm szkiełka szklane z pokrywką borokrzemianową</td><td>VWR</td><td>631-0174</td><td></td></tr><tr><td>35 mm sterylne naczynia bez obróbki</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-3340</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szklana pokrywa dolna naczynie</td><td>WPI</td><td>FD35-PDL-100</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE select (tryozyna)</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Odczynnik Trypsyna/EDTA</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórki</td><td>ATTC</td><td>CRL-3216</td><td>Stosowany między przejściami 5-30</td></tr><tr><td>ANAP-TFA</td><td>AsisChem</td><td>ASIS-0014</td><td>Rozpuszczony w 30 mM NaOH do końcowego stężenia 1 mM</td></tr><tr><td>plazmid ekspresji pANAP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #48696</td><td>Koduje parę syntetaz tRNA/tRNA do ekspresji białka</td></tr><tr><td>peRF1-E55D znakowanego ANAP</td><td>Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Wielka Brytania)</td><td>Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td><td>Koduje dominująco-ujemny eukariotyczny czynnik uwalniania rybosomów</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2300</td> Lipopolyplex</tr><tr><td>Grubościenne kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Aparat Harvarda</td><td>GC150F-15</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamino-5-maleimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94506</td><td></td></tr><tr><td>TNP-ATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-221L</td><td>Dostarczany na 10 mM w wodzie</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60x zanurzenie w wodzie (1.4 NA)</td><td>Głowica</td> LED o dużej mocy <td>MRD07602</td> Nikon LED4D245 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>385/490/565/625 nm</td></tr><tr><td>Czterokanałowy sterownik LED</td><td>ThorLabs</td><td>DC4100</td><td></td></tr><tr><td>390/18 nm filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego</td><td>ThorLabs</td><td>MF390-18</td><td>Do wzbudzenia ANAP</td></tr><tr><td>Długoprzepustowy filtr emisyjny 400 nm</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0400</td><td>Do obrazowania widm ANAP</td></tr><tr><td>416 nm krawędziowy dichroiczny</td><td>ThorLabs</td><td>MD416</td><td>Do obrazowania widm ANAP</td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 460/60 nm</td><td>ThorLabs</td><td>MF460-60</td><td>Sugerowany filtr szerokopasmowo-przepustowy do obrazowania fluorescencji ANAP (rysunek 4B)</td></tr> <tr><td>Filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 470/10 nm</td><td>ThorLabs</td><td>FB470-10</td><td>Sugerowany filtr wąskopasmowo-przepustowy do obrazowania fluorescencji ANAP (rysunek 4B)</td></tr> <tr><td>Filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 531/40</td><td>Brightline</td><td>FF01-531/40-25</td><td>Do wzbudzenia białka fluorescencyjnego pomarańczowego (OFP)</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowego 540/25 nm</td><td>Chroma</td><td>D540/25X</td><td>Do wzbudzenia tetrametylorodamino-5-maleimidu (TMRM)</td></tr><tr><td>562 nm krawędzi dichroicznej</td><td>Semrock</td><td>FF562-Di03</td><td>Do obrazowania fluorescencji OFP</td></tr><tr><td>565 nm krawędzi dichroicznej</td><td>Chroma</td><td>565DC</td><td>Do obrazowania TMRM fluorescencja</td></tr><tr><td>593/40 nm filtr wzbudzenia pasmowo-przepustowy</td><td>Brightline</td><td>FF01-387/11-25</td><td>Do obrazowania fluorescencji OFP</td></tr><tr><td>605/55 nm pasmowo przepustowe filtr emisyjny</td><td>Chroma</td><td>D605/55M</td><td>Do obrazowania fluorescencji TMRM</td></tr><tr><td>Spektrometr obrazowania IsoPlane-160</td><td>Princeton Instruments</td><td>Kamera 400BR_eXcelon IsoPlane-160</td><td></td></tr><tr><td>PIXIS</td><td>Princeton Instruments</td><td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Axopatch 200B</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digitizer Axopatch 200B-2</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Sonics</td><td>& Sonics & Materiały</td><td>VC-50</td><td>Do zdejmowania dachu</td></tr><tr><td>Cyfrowa pompa perystaltyczna REGLO</td><td>Ismatec</td><td>ISM 832</td><td>Do perfuzji kąpielowej</td></tr><tr><td>System perfuzji mikroobjętościowej</td><td>ALA Instrumenty naukowe</td><td>ALA &mu; Flow-8</td><td>Do perfuzji TNP-ATP</td></tr><tr><td>pClamp 10.6.2</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>Rejestracja i analiza prądów</td></tr><tr><td>Lightfield 5.20.1507</td><td>Princeton Instruments</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazów i widm</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>Python 3.8.1</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td>Do analizy danych</td></tr></tbody></table>

pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Opracowaliśmy metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z nienaruszonymi, funkcjonalnymi receptorami transbłonowymi w środowisku komórkowym lub błonowym. Metoda ta łączy ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnym niekanonicznym aminokwasem ANAP i FRET między ANAP a fluorescencyjnymi (trinitrofenylowymi) pochodnymi nukleotydów. Przedstawiamy przykłady wiązania nukleotydów z kanałami jonowymi KATP znakowanymi ANAP, mierzonymi w niezadaszonych błonach plazmatycznych i wyciętych łatach błonowych wywróconych na lewą stronę pod zaciskiem napięciowym. Ten ostatni pozwala na jednoczesne pomiary wiązania ligandów i prądu kanału, bezpośredni odczyt funkcji białka. Przetwarzanie i analiza danych są szeroko omawiane, wraz z potencjalnymi pułapkami i artefaktami. Metoda ta dostarcza bogatych informacji mechanistycznych na temat zależnego od ligandu bramkowania kanałów KATP i może być łatwo zaadaptowana do badania innych białek regulowanych nukleotydami lub dowolnego receptora, dla którego można zidentyfikować odpowiedni ligand fluorescencyjny.

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Ponieważ ATP jest ważnym przekaźnikiem komórkowym, opracowaliśmy metodę, która pozwala nam z dużą precyzją mierzyć wiązanie ATP z jego receptorami. Korzystając z FRET między pochodnymi nukleotydów a białkami znakowanymi fluorescencyjnie, możemy monitorować wiązanie nukleotydów z nienaruszonymi receptorami funkcjonalnymi w czasie rzeczywistym i z doskonałą rozdzielczością przestrzenną. Używamy tej metody, aby zrozumieć wpływ metabolizmu komórkowego na wrażliwy na ATP kanał potasowy, który jest związany z niektórymi postaciami cukrzycy.Aby przeprowadzić eksperyment z membraną bez dachu, najpierw użyj kleszczy, aby rozbić mały fragment z szkiełka nakrywkowego z transfekowanymi komórkami i przepłukać fragment PBS. Jeśli szkiełko nakrywkowe jest wstępnie pokryte polilizyną, umieść fragment na dnie 35-milimetrowej naczynia zawierającej dwa mililitry PBS i przytrzymaj trzymilimetrowy sonograf sondy sonicznej trzy do pięciu milimetrów nad próbką, pulsujący z mocą 50 watów i amplitudą od 20 do 40% przez 200 do 500 milisekund, aby odblokować ogniwa. Jeżeli szkiełka nakrywkowe nie są wstępnie pokryte, po spłukaniu PBS, zanurzyć fragment w probówce zawierającej 0,1% poli-L-lizyny na około 30 sekund przed odkrycia komórek za pomocą krótkiej sonikacji, jak pokazano.Przenieś soniczny fragment do 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem zawierającego dwa mililitry roztworu do kąpieli i zamontuj naczynie na odwróconym mikroskopie wyposażonym w obiektyw o wysokim otworze numerycznym 60x zanurzenie w wodzie. Sprawdź, czy port kamery mikroskopu jest połączony ze spektrografem połączonym szeregowo z kamerą CCD o wysokiej czułości i użyj pompy perystaltycznej do perfuzji komory kąpieli z buforem przy natężeniu przepływu od 0,5 do jednego mililitra buforu na minutę. Aby zidentyfikować niezadaszone fragmenty membrany wyrażające kanał oznaczony ANAP, należy wyświetlić próbkę, aby zlokalizować membrany z kanałami fluorescencyjnymi.Częściowo zazębić maskę spektrometru między portem kamery w mikroskopie a spektrografem. Cień maski pojawi się na obrazie z kamery. Uzyskaj jasne pole i obraz fluorescencyjny odsłoniętej membrany, aby umożliwić wybór obszaru zainteresowania do analizy.Zbliż końcówkę systemu perfuzji mikroobjętościowej do niezadaszonej membrany. Aby uzyskać obraz fluorescencji ANAP, należy wzbudzić membranę diodą LED o długości 385 nanometrów przez filtr wzbudzenia pasma przepustowego 390/18 nanometra i dichroik krawędziowy 416 nanometrów, zbierając emitowane światło przez 400-nanometrowy filtr emisyjny długoprzepustowy. Włącz maskę spektrometru i upewnij się, że emitowane światło jest przepuszczane.Wyrównaj obszar zainteresowania ze szczeliną maski spektrometru. Włączyć siatki spektrometru. Po umieszczeniu siatek światło załamywane przez spektrometr będzie rzutowane na chip kamery CCD w celu uzyskania obrazów spektralnych.Obrazy zachowają informacje przestrzenne w wymiarze Y. Wymiar X zostanie zastąpiony długością fali. Podczas perfuzji z roztworem buforowym wolnym od nukleotydów należy uzyskać jedną lub więcej ekspozycji od 0,1 do dziesięciu sekund w celu dalszej korekcji i normalizacji danych zebranych przez pozostałą część eksperymentu.Następnie zastosuj zakres stężeń TNP ATP w roztworze kąpieli, aby ustalić krzywą stężenie-odpowiedź, perfaktorując każdy roztwór przez co najmniej jedną minutę, aby zapewnić osiągnięcie stanu ustalonego i uzyskać ekspozycję dla każdego stężenia. Po każdym stężeniu należy przepłukać TNP ATP roztworem kąpieli wolnej od nukleotydów przez co najmniej jedną minutę przed uzyskaniem obrazu ekspozycji po zabiegu. Aby przeprowadzić eksperyment fluorometryczny z klamrą krosową, najpierw wyciągnij pipety z grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji od 1,5 do 2,5 megaoma po napełnieniu roztworem pipety.Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami do szklanego naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego dwa mililitry roztworu do kąpieli i zamontuj naczynie na odwróconym mikroskopie. Przeprowadź fuzję komory kąpieli roztworem do kąpieli i zidentyfikuj komórkę wyrażającą kanały znakowane ANAP. Zastosuj delikatne nadciśnienie do pipety z plastrem i umieść pipetę w komorze kąpielowej.Dociśnij pipetę do membrany komórki i zastosuj delikatne ssanie, aby uzyskać gigaomowe uszczelnienie. Aby usunąć plaster, należy szybko odsunąć uchwyt pipety od załatanej komórki. Zbliżyć końcówkę pipety do plastra bliżej końcówki systemu perfuzyjnego i sprawdzić, czy plaster znajduje się w szczelinie maski spektrometru.Następnie zastosuj TNP ATP i zbierz widma obrazu. Na tych obrazach można zaobserwować typowy niezadaszony fragment błony z komórki HEK293T wykazującej ekspresję wrażliwych na ATP kanałów potasowych oznaczonych pomarańczowym białkiem fluorescencyjnym. Na tym obrazie spektralnym kanałów potasowych wrażliwych na ATP znakowanych ANAP w niezadaszonej membranie z komórki HEK293T wystawionej na działanie pięciu mikromolowych TNP ATP można zaobserwować dwa regiony o wysokiej intensywności, które odpowiadają szczytowej emisji ANAP i TNP ATP.Widmo końcowe można uzyskać, odejmując uśrednione widmo tła od uśrednionego obszaru widma zainteresowania. Tutaj można zaobserwować zmniejszenie szczytowej fluorescencji ANAP po wielokrotnych ekspozycjach. Szczyt fluorescencji z kilku ekspozycji przy braku TNP ATP został dopasowany do pojedynczego rozpadu wykładniczego.Dane te zostały następnie wykorzystane do skorygowania artefaktów fotowybielania. W tym miejscu pokazano reprezentatywne obrazy spektralne z niezadaszonej membrany uzyskanej z komórki wykazującej ekspresję kanałów potasowych wrażliwych na ATP znakowane ANAP w przypadku braku i obecności TNP ATP. Obserwacja skorygowanych widm emisyjnych ujawnia wyraźną separację między emisją fluorescencyjną donorową i akceptorową.Na tym rysunku pokazano reprezentatywne prądy i widma z oznaczonych przez ANAP kanałów potasowych wrażliwych na ATP z typowego eksperymentu fluorometrycznego z zaciskiem krosowym. Widma emisyjne są korygowane pod kątem tła i bielenia, jak pokazano dla membran niezadaszonych. Uważaj na kontrolki, aby sprawdzić, czy sygnał fluorescencyjny jest specyficzny dla twojego receptora.Upewnij się, że Twoja obfitość jest szybka, wydajna i kompletna, a ekspozycje powinny być jak najkrótsze. Ta metoda odpowiada na pytania dotyczące zajętości receptorów i jej związku z funkcją. Inne techniki FRET stosowane z podobną konfiguracją mogą badać indukowane przez ligand zmiany potwierdzające w receptorze.

measuring-nucleotide-binding-to-intact-functional-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj metodę pomiaru wiązania ATP z receptorami w czasie rzeczywistym przy użyciu FRET i fluorescencyjnie znaczonych białek. Technika ta umożliwia precyzyjne monitorowanie dynamiki receptorów w środowisku komórkowym.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów