Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym
11 marca 2021
Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.
Ponieważ ATP jest ważnym przekaźnikiem komórkowym, opracowaliśmy metodę, która pozwala nam z dużą precyzją mierzyć wiązanie ATP z jego receptorami. Korzystając z FRET między pochodnymi nukleotydów a białkami znakowanymi fluorescencyjnie, możemy monitorować wiązanie nukleotydów z nienaruszonymi receptorami funkcjonalnymi w czasie rzeczywistym i z doskonałą rozdzielczością przestrzenną. Używamy tej metody, aby zrozumieć wpływ metabolizmu komórkowego na wrażliwy na ATP kanał potasowy, który jest związany z niektórymi postaciami cukrzycy.
Aby przeprowadzić eksperyment z membraną bez dachu, najpierw użyj kleszczy, aby rozbić mały fragment z szkiełka nakrywkowego z transfekowanymi komórkami i przepłukać fragment PBS. Jeśli szkiełko nakrywkowe jest wstępnie pokryte polilizyną, umieść fragment na dnie 35-milimetrowej naczynia zawierającej dwa mililitry PBS i przytrzymaj trzymilimetrowy sonograf sondy sonicznej trzy do pięciu milimetrów nad próbką, pulsujący z mocą 50 watów i amplitudą od 20 do 40% przez 200 do 500 milisekund, aby odblokować ogniwa. Jeżeli szkiełka nakrywkowe nie są wstępnie pokryte, po spłukaniu PBS, zanurzyć fragment w probówce zawierającej 0,1% poli-L-lizyny na około 30 sekund przed odkrycia komórek za pomocą krótkiej sonikacji, jak pokazano.
Przenieś soniczny fragment do 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem zawierającego dwa mililitry roztworu do kąpieli i zamontuj naczynie na odwróconym mikroskopie wyposażonym w obiektyw o wysokim otworze numerycznym 60x zanurzenie w wodzie. Sprawdź, czy port kamery mikroskopu jest połączony ze spektrografem połączonym szeregowo z kamerą CCD o wysokiej czułości i użyj pompy perystaltycznej do perfuzji komory kąpieli z buforem przy natężeniu przepływu od 0,5 do jednego mililitra buforu na minutę. Aby zidentyfikować niezadaszone fragmenty membrany wyrażające kanał oznaczony ANAP, należy wyświetlić próbkę, aby zlokalizować membrany z kanałami fluorescencyjnymi.
Częściowo zazębić maskę spektrometru między portem kamery w mikroskopie a spektrografem. Cień maski pojawi się na obrazie z kamery. Uzyskaj jasne pole i obraz fluorescencyjny odsłoniętej membrany, aby umożliwić wybór obszaru zainteresowania do analizy.
Zbliż końcówkę systemu perfuzji mikroobjętościowej do niezadaszonej membrany. Aby uzyskać obraz fluorescencji ANAP, należy wzbudzić membranę diodą LED o długości 385 nanometrów przez filtr wzbudzenia pasma przepustowego 390/18 nanometra i dichroik krawędziowy 416 nanometrów, zbierając emitowane światło przez 400-nanometrowy filtr emisyjny długoprzepustowy. Włącz maskę spektrometru i upewnij się, że emitowane światło jest przepuszczane.
Wyrównaj obszar zainteresowania ze szczeliną maski spektrometru. Włączyć siatki spektrometru. Po umieszczeniu siatek światło załamywane przez spektrometr będzie rzutowane na chip kamery CCD w celu uzyskania obrazów spektralnych.
Obrazy zachowają informacje przestrzenne w wymiarze Y. Wymiar X zostanie zastąpiony długością fali. Podczas perfuzji z roztworem buforowym wolnym od nukleotydów należy uzyskać jedną lub więcej ekspozycji od 0,1 do dziesięciu sekund w celu dalszej korekcji i normalizacji danych zebranych przez pozostałą część eksperymentu.
Następnie zastosuj zakres stężeń TNP ATP w roztworze kąpieli, aby ustalić krzywą stężenie-odpowiedź, perfaktorując każdy roztwór przez co najmniej jedną minutę, aby zapewnić osiągnięcie stanu ustalonego i uzyskać ekspozycję dla każdego stężenia. Po każdym stężeniu należy przepłukać TNP ATP roztworem kąpieli wolnej od nukleotydów przez co najmniej jedną minutę przed uzyskaniem obrazu ekspozycji po zabiegu. Aby przeprowadzić eksperyment fluorometryczny z klamrą krosową, najpierw wyciągnij pipety z grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji od 1,5 do 2,5 megaoma po napełnieniu roztworem pipety.
Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami do szklanego naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego dwa mililitry roztworu do kąpieli i zamontuj naczynie na odwróconym mikroskopie. Przeprowadź fuzję komory kąpieli roztworem do kąpieli i zidentyfikuj komórkę wyrażającą kanały znakowane ANAP. Zastosuj delikatne nadciśnienie do pipety z plastrem i umieść pipetę w komorze kąpielowej.
Dociśnij pipetę do membrany komórki i zastosuj delikatne ssanie, aby uzyskać gigaomowe uszczelnienie. Aby usunąć plaster, należy szybko odsunąć uchwyt pipety od załatanej komórki. Zbliżyć końcówkę pipety do plastra bliżej końcówki systemu perfuzyjnego i sprawdzić, czy plaster znajduje się w szczelinie maski spektrometru.
Następnie zastosuj TNP ATP i zbierz widma obrazu. Na tych obrazach można zaobserwować typowy niezadaszony fragment błony z komórki HEK293T wykazującej ekspresję wrażliwych na ATP kanałów potasowych oznaczonych pomarańczowym białkiem fluorescencyjnym. Na tym obrazie spektralnym kanałów potasowych wrażliwych na ATP znakowanych ANAP w niezadaszonej membranie z komórki HEK293T wystawionej na działanie pięciu mikromolowych TNP ATP można zaobserwować dwa regiony o wysokiej intensywności, które odpowiadają szczytowej emisji ANAP i TNP ATP.
Widmo końcowe można uzyskać, odejmując uśrednione widmo tła od uśrednionego obszaru widma zainteresowania. Tutaj można zaobserwować zmniejszenie szczytowej fluorescencji ANAP po wielokrotnych ekspozycjach. Szczyt fluorescencji z kilku ekspozycji przy braku TNP ATP został dopasowany do pojedynczego rozpadu wykładniczego.
Dane te zostały następnie wykorzystane do skorygowania artefaktów fotowybielania. W tym miejscu pokazano reprezentatywne obrazy spektralne z niezadaszonej membrany uzyskanej z komórki wykazującej ekspresję kanałów potasowych wrażliwych na ATP znakowane ANAP w przypadku braku i obecności TNP ATP. Obserwacja skorygowanych widm emisyjnych ujawnia wyraźną separację między emisją fluorescencyjną donorową i akceptorową.
Na tym rysunku pokazano reprezentatywne prądy i widma z oznaczonych przez ANAP kanałów potasowych wrażliwych na ATP z typowego eksperymentu fluorometrycznego z zaciskiem krosowym. Widma emisyjne są korygowane pod kątem tła i bielenia, jak pokazano dla membran niezadaszonych. Uważaj na kontrolki, aby sprawdzić, czy sygnał fluorescencyjny jest specyficzny dla twojego receptora.
Upewnij się, że Twoja obfitość jest szybka, wydajna i kompletna, a ekspozycje powinny być jak najkrótsze. Ta metoda odpowiada na pytania dotyczące zajętości receptorów i jej związku z funkcją. Inne techniki FRET stosowane z podobną konfiguracją mogą badać indukowane przez ligand zmiany potwierdzające w receptorze.
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Korzystając z rezonansu Förestera (FRET) między pochodnymi nukleotydów i białkami oznaczonymi fluorekcją, badacze mogą monitorować wiązanie nukleotydów z funkcjonalnymi receptorami z dużą precyzją.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Komórkowa
- Biofizyka
Tło
- ATP jest kluczowym komórkowym przekaznikiem zaangażowanym w różne szlaki sygnałowe.
- Zrozumienie wiązania ATP z jego receptorami jest niezbędne do badania metabolizmu komórkowego.
- Kanał potasowy zależny od ATP jest związany z niektórymi formami cukrzycy.
- Techniki pomiarowe w czasie rzeczywistym zwiększają zrozumienie dynamiki receptorów.
Cel Badań
- Opracowanie metody pomiaru wiązania ATP z receptorami w czasie rzeczywistym.
- Zbadanie wpływu metabolizmu komórkowego na kanały potasowe zależne od ATP.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu prowadzenia eksperymentów w środowisku komórkowym.
Wykorzystane Metody
- Pomiar FRET przy użyciu pochodnych nukleotydów trinitropenylowych.
- Odsłanianie fragmentów błon z transfekowanych komórek.
- Wykorzystanie mikroskopii o wysokiej liczbie apertury dla obrazowania.
- Flurometry z wykorzystaniem metody patch-clamp do analizy aktywności receptorów.
Główne Wyniki
- Pomyślny pomiar dynamiki wiązania ATP w czasie rzeczywistym.
- Identyfikacja odsłoniętych fragmentów błon wyrażających kanały oznaczonymi fluorekcją.
- Ustalenie krzywych odpowiedzi na stężenie dla TNP ATP.
- Obserwowano wyraźne rozdzielenie emisji fluorescencyjnych dawcy i akceptora.
Wnioski
- Opracowana metoda umożliwia precyzyjny monitoring interakcji receptorów ATP.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia roli ATP w metabolizmie komórkowym.
- Niniejszy protokół można zastosować do dalszych badań nad dynamiką i funkcją receptorów.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This method enables real-time quantification of nucleotide binding to functional membrane proteins, providing mechanistic insights into ligand-dependent gating that can inform target validation for nucleotide-regulated receptors. By integrating binding measurements with functional readouts such as ion channel current, it supports de-risking of therapeutic hypotheses in discovery programs targeting metabolic and neurological disorders. The approach is adaptable to other receptors with suitable fluorescent ligands, offering a reusable platform for assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time occupancy of nucleotide-binding sites on intact, functional receptors to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Enables direct correlation of ligand binding with protein function via simultaneous current measurement in excised patches.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving ligand-dependent gating dynamics of targets like KATP channels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative concentration-response curves using TNP ATP derivatives to establish binding affinity and potency.
- Reproducibility: Uses standardized unroofed membrane and patch-clamp fluorometry setups to minimize variability across experiments.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging and spectral analysis for multi-condition testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to ATP-sensitive potassium channels implicated in certain forms of diabetes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges binding kinetics to functional outcomes, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic Insight: Reveals how nucleotide binding modulates channel activity, informing structure-function relationships in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing binding-function correlation data.
- Discovery Biology: Tests target engagement and pathway modulation by measuring nucleotide binding in native-like membrane environments.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding data suitable for hit confirmation and SAR development.
- Analytics: Produces corrected emission spectra and binding isotherms that enable comparison of ligand efficacy and potency.
- Translational Research: Links binding events to functional readouts in disease-relevant systems such as metabolically active cells.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other nucleotide-regulated proteins or receptors with compatible fluorescent ligands, supporting platform-level investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on ligand-receptor interactions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes real-time binding measurements with spatial and temporal resolution in intact membranes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement with functional correlation.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on binding kinetics and functional impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular tagging with non-canonical amino acids like ANAP and FRET-based detection.
- Depends on instrumentation including spectrograph-equipped microscopes, high-sensitivity CCD cameras, and microvolume perfusion systems.
- Necessitates standardization of membrane preparation (unroofed or excised patches) and buffer conditions across teams.
- Adaptation to other systems requires identification of suitable fluorescent nucleotide derivatives and compatible protein tags.
- Potential limitations include photobleaching artifacts and the need for careful controls to ensure signal specificity, as noted in the data treatment section.
