Dostarczanie hipertermii nanocząstek magnetycznych in vitro i in vivo za pomocą specjalnie zaprojektowanego systemu dostarczania
2 lipca 2020
Ten protokół przedstawia techniki i metodologię niezbędne do dokładnego dostarczania hipertermii magnetycznych nanocząstek przy użyciu zaawansowanego systemu dostarczania i monitorowania.
Metoda ta jest istotna, ponieważ zapewnia najbardziej niezawodny i powtarzalny sposób leczenia hipertermią nanocząstek magnetycznych w modelach przedklinicznych. Technika ta pozwala na precyzyjne i spójne dostarczanie hipertermii nanocząstek poprzez dokładne monitorowanie i kontrolowanie lokalnego środowiska, fizjologii zwierząt i dawki termicznej. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że ogrzewanie nanocząstek musi pozostać ograniczone do tkanki docelowej.
Niezbędne jest stosowanie obfitej i odpowiedniej termometrii, aby zapewnić odtwarzalność i bezpieczeństwo. 24 godziny po posianiu komórek czerniaka myszy B16 F10 dodaje się nanocząstki magnetyczne do końcowego stężenia trzech miligramów jonów na mililitr. Upewnij się, że nanocząstki są równomiernie rozmieszczone w całej studzience, tworząc wcześniej roztwór podstawowy pożywki i nanocząstek magnetycznych.
48 godzin po dodaniu nanocząsteczek dodaj 0,5 mililitra trypsyny do każdego leczonego studzienki i delikatnie zakręć płytką. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki są odłączone. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki do każdej studzienki i zbierz wszystkie komórki do 1,5 mililitrowych probówek, używając wyraźnie oznaczonej oddzielnej probówki dla każdej studzienki.
Obracaj probówki w temperaturze 60 G przez dwie do trzech minut, aby granulować komórki. Następnie umieść rurki w przekładce wypełnionej wodą w wężownicy. Ustaw temperaturę łaźni wodnej, aby utrzymać paletę mediów i komórek na poziomie 37 stopni Celsjusza.
Skonfiguruj oddzielne światłowodowe sondy temperatury, aby monitorować temperaturę w rurze i łaźni wodnej. Włącz agregat chłodniczy i sprawdź, czy płyn chłodzący przepływa przez wężownicę. Następnie włącz źródło zasilania i dostosuj procent maksimum do żądanego pola.
Uruchom 14-zwojową cewkę elektromagnetyczną zasilaną przez generator o mocy 10 kilowatów przy 165 kilohercach i 23.87 kiloamperach na metr. Traktuj komórki do momentu osiągnięcia wcześniej ustalonej dawki termicznej w protokole. Po poddaniu działaniu należy ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce w probówkach i ponownie umieścić je na nowych, wyraźnie oznaczonych płytkach sześciodołkowych.
Po znieczuleniu myszy oczyść guz chusteczką nasączoną alkoholem. Wstrzyknij nanocząstki magnetyczne do guza na trzy godziny przed leczeniem AMF. Po trzech godzinach ponownie znieczulij mysz i sprawdź, czy nie ma reakcji na odruchy prostujące.
Zdejmij kolczyk lub inne metalowe przedmioty z myszy i delikatnie umieść nasmarowaną światłowodową sondę temperatury w jej odbycie. Umieścić cewnik w guzie. Wyjąć igłę.
Następnie przetnij cewnik, aby nie wystawał zbyt mocno z guza. Włóż do cewnika światłowodową sondę temperatury z trzema czujnikami, która ochroni czujniki. Przyklej sondę doodbytniczą i wewnątrznowotworową do ogona zwierzęcia.
Umieść mysz w 50-mililitrowej rurce, która powinna mieć otwór w pobliżu głowicy, do którego można podłączyć i dostarczyć znieczulenie. Umieść rurkę w konfiguracji cewki i ponownie podłącz znieczulenie. Umieść światłowodową sondę temperatury luźno w rurze, aby zmierzyć temperaturę otoczenia.
Następnie włącz agregat chłodniczy i upewnij się, że płyn chłodzący jest w cyrkulacji. Sprawdź, czy oprogramowanie komputerowe wyświetla różne temperatury i rozpocznij rejestrację, aby umożliwić wyświetlenie obliczeń CEM43 w czasie rzeczywistym, w miejscu, w którym wymagana dawka CEM43 powinna być wcześniej określona. Włącz magnes przy niskim procencie mocy i upewnij się, że światłowodowe sondy temperatury rejestrują zmiany temperatury.
Krótko mówiąc, że temperatura ciała zwierzęcia pozostaje na poziomie 38 stopni Celsjusza, regulując ją za pomocą klimatyzowanego płaszcza powietrznego. Dostosuj natężenie pola magnetycznego, zmieniając moc, która kontroluje poziom temperatury w guzie. Wyłączyć AMF po osiągnięciu żądanej dawki.
Wyjmij rurkę z cewki i wyjmij mysz z rurki. Następnie wyłącz agregat chłodniczy. Wyjmij sondy i cewniki, a jeśli to konieczne, oznacz zwierzę nowym metalowym kolczykiem.
Monitoruj mysz podczas rekonwalescencji po znieczuleniu, upewniając się, że wraca do normalnego zachowania i że nie ma żadnych komplikacji. W przypadku hipotermii in vivo konieczne jest umieszczenie jak największej liczby światłowodowych sond temperatury w strategicznych lokalizacjach w celu oceny skuteczności i bezpieczeństwa w czasie rzeczywistym. Sondy te umożliwiają rejestrację temperatury przez cały czas trwania eksperymentu, co pozwala na dokładną historię dozymetryczną i termiczną.
Krzywe wygenerowane podczas eksperymentu in vivo są pokazane tutaj, podkreślając zdolność do ścisłego monitorowania temperatury i dostosowywania systemu do utrzymywania temperatury guza w pożądanym zakresie. Wykresy wulkanów pokazują geny o zróżnicowanej ekspresji po leczeniu hipertermią magnetycznych nanocząstek in vitro i in vivo, demonstrując, w jaki sposób techniki molekularne mogą być wykorzystane do monitorowania efektów hipertermii. Dokładne monitorowanie temperatury guza, temperatury wnętrza zwierzęcia i dawki termicznej jest niezbędne do spójnego dostarczania leczenia.
Po hipertermii można przeprowadzić różne analizy, aby zrozumieć efekt i mechanizm leczenia. A inne terapie mogą być wdrożone w celu uzyskania większego efektu terapeutycznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia techniki i metodologię niezbędną do precyzyjnego przeprowadzania hipertermii z wykorzystaniem nanocząstek magnetycznych, przy użyciu zaawansowanego systemu podawania i monitorowania. Metoda ta ma istotne znaczenie, ponieważ zapewnia najbardziej niezawodny i powtarzalny sposób realizacji terapii hipertermią z użyciem nanocząstek magnetycznych w modelach przedklinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Terapia termiczna
Wprowadzenie
- Precyzyjne i spójne dostarczanie hipertermii nanocząsteczkowej.
- Dokładny monitoring i kontrola lokalnego środowiska oraz fizjologii zwierząt.
- Znaczenie termometrii dla powtarzalności i bezpieczeństwa.
- Zastosowanie w modelach przedklinicznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody przeprowadzania hipertermii z użyciem nanocząsteczek magnetycznych.
- Zapewnienie bezpieczeństwa i powtarzalności procesu leczenia.
- Ograniczenie nagrzewania wyłącznie do tkanki docelowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie nanocząstek magnetycznych o stężeniu trzech miligramów jonu na mililitr.
- Równomierne rozmieszczenie nanocząstek w dołkach hodowli komórkowych.
- Zastosowanie roztworu zapasu medium i nanocząstek.
- Monitorowanie dawki termicznej podczas zabiegu.
Główne wyniki
- Skuteczne przeprowadzenie hipertermii z użyciem nanocząsteczek magnetycznych.
- Stabilne nagrzewanie ograniczone do tkanek docelowych.
- Powtarzalność wyników w kolejnych próbach.
- Efektywne monitorowanie środowiska lokalnego i fizjologii zwierząt.
Wnioski
- Protokół oferuje solidną metodę hipertermii nanocząsteczkowej.
- Zapewnia bezpieczeństwo i skuteczność w zastosowaniach przedklinicznych.
- Podkreśla znaczenie termometrii w procesie leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hipertermia z użyciem nanocząstek magnetycznych (mNPH) umożliwia precyzyjne dawkowanie termiczne w przedklinicznych modelach onkologicznych, wspierając walidację celu poprzez kontrolowaną ablację guza oraz podprogowe efekty immunomodulacyjne. System monitorowania temperatury w czasie rzeczywistym w wielu punktach oraz dozymetria oparta na wskaźniku CEM43 zapewniają ilościowe, powtarzalne wyniki, które są kluczowe dla redukcji ryzyka mechanistycznego oraz pewności prognostycznej w zakresie okien terapeutycznych. Zdolność ta pozwala na przeniesienie wyników in vitro na skuteczność in vivo, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go we wczesnych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczanie określonych dawek termicznych w celu modulacji mikrośrodowiska guza i odpowiedzi immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Ogranicza ogrzewanie do tkanki docelowej dzięki termometrii światłowodowej, co zmniejsza efekty pozatarczowe i poprawia swoistość testu.
- Wartość prognostyczna: Ilościowo określa efekty biologiczne w gradientach temperatura-czas, wspierając modelowanie zależności dawka-odpowiedź w celu priorytetyzacji celów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych (np. komórek czerniaka B16 F10) ze zestandaryzowanym poborem nanocząstek w celu uzyskania spójnej odpowiedzi na hipertermię.
- Wartość operacyjna: Wykorzystanie roztworów stokowych i protokołów równomiernej dystrybucji w celu zapewnienia powtarzalności wyników pomiędzy dołkami i płytkami.
- Gotowość do analizy: Generowanie danych objętościowej dawki termicznej (CEM43) kompatybilnych z przesiewaniem wysokoprzepustowym (high-content screening) i analityką następczą.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera płynne przejście z hodowli komórkowych in vitro do modeli nowotworowych in vivo z wykorzystaniem identycznych formulacji nanocząsteczek i monitoringu.
- Znaczenie dla choroby: Ma zastosowanie w mysich modelach czerniaka, umożliwiając ocenę zmian w ekspresji genów indukowanych przez hipertermię (np. wykresy wulkaniczne) jako potencjalnych biomarkerów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Śledzenie dawki termicznej w czasie rzeczywistym pozwala na kontrolowaną pod kątem bezpieczeństwa eskalację oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego przed badaniami nad terapią skojarzoną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Pozycjonuje mNPH jako technologię umożliwiającą przejście od walidacji celu do optymalizacji związku wiodącego, w której precyzja dawki termicznej dostarcza informacji dla screeningu fenotypowego i badań nad mechanizmem działania.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie stresu termicznego z różnicową ekspresją genów i modulacją odporności.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki termiczne (np. CEM43) do porównywania formulacji nanocząstek i parametrów polowych.
- Analityka: Zapewnia krzywe temperatury w czasie rzeczywistym oraz molekularne profile po opracowaniu (np. wykresy wulkaniczne) do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Utrzymuje spójność w dawkowaniu i monitorowaniu nanocząstek od poziomu komórek po zwierzęta, wspierając ciągłość przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Projekt systemu umożliwia szybką konwersję między układami ex vivo, in vitro i in vivo, maksymalizując wykorzystanie platformy w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez korelację precyzyjnych dawek termicznych z efektami molekularnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje podawanie hipertermii za pomocą skalibrowanych cewek solenoidowych, chłodnic i sond światłowodowych w różnych ośrodkach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zdefiniowanie skutecznych okien termicznych, które równoważą efektywność i bezpieczeństwo tkanek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów nanoterapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o powtarzalne profile ablacji termicznej.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie przygotowania nanocząsteczek, dosymetrii termicznej oraz postępowania ze zwierzętami podczas procedur in vivo.
- Wymagane jest specjalistyczne oprzyrządowanie, w tym generatory o mocy 10 kW, cewki solenoidalne z 14 zwojami, chłodnice oraz wielopunktowy system monitorowania temperatury za pomocą światłowodów.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie stężenia nanocząsteczek (3 mg jon/mL), protokołów dystrybucji oraz metod obliczania CEM43.
- Konieczne jest uwzględnienie adaptacji do różnych modeli nowotworowych, konstrukcji nanocząsteczek oraz parametrów pola (165 kHz, 23,87 kA/m).
- Uwzględniono ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba rozbudowanej termometrii w celu zapobiegania nagrzewaniu tkanek poza obszarem docelowym oraz zapewnienia regulacji temperatury głębokiej zwierząt.
