Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Protokół ten przedstawia elastyczny przepływ pracy PCR z wieloma kropelkami, który umożliwia precyzyjne różnicowe zliczanie leukocytów w oparciu o epigenetyczne markery metylacji. Ta elastyczność może ułatwić przełożenie mdPCR na zastosowanie kliniczne. Metoda ta zapewnia wyniki, które są bardzo zbliżone do wyników uzyskanych przy użyciu metod barwienia immunofluorescencyjnego.

Jednak w przeciwieństwie do barwienia immunofluorescencyjnego, ta metoda nie wymaga świeżych próbek krwi ani kosztownych przeciwciał. W diagnostyce hematologicznej leukocyty różnicowe mogą służyć jako wskaźniki spektrum chorób, w tym infekcji, stanów zapalnych, niedokrwistości i białaczki, i są uważane za wczesny prognostyczny biomarker raka. Procedurę zademonstruje wraz z Abdelrahmanem Elmanzalawym Christina Nassif, specjalista techniczny z naszego zespołu w Centrum Badań nad Wyrobami Medycznymi NRC.

Rozpocznij od dokładnego wymieszania 20 mikrolitrów kinazy białkowej K i 400 mikrolitrów buforu wiążącego lizę zawierającego kulki magnetyczne ze świeżo rozmrożonymi ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej w 100 mikrolitrach PBS. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną do dwóch minut przed wyjęciem supernatantu. Po wyjęciu rurki z magnesu ponownie zawiesić kompleks kulek DNA w 600 mikrolitrach pierwszego buforu do mycia, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane kulki.

Umieść probówkę z powrotem na magnesie, aby umożliwić usunięcie supernatantu, przed umyciem komórek w 600 mikrolitrach drugiego buforu do przemywania wody, jak pokazano powyżej. Po usunięciu supernatantu pozostaw probówkę do wyschnięcia na magnesie na powietrzu przez jedną minutę przed dodaniem 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do probówki z dokładnym wymieszaniem. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną do dwóch minut, aby oddzielić kulki magnetyczne od naliczonego DNA i przenieś oczyszczony roztwór DNA do nowej probówki.

W celu konwersji wodorosiarczynu oczyszczonego DNA należy przenieść 20 mikrolitrów próbki DNA do probówki PCR i dodać do probówki 130 mikrolitrów odczynnika konwersyjnego. Po dokładnym wymieszaniu na krótko odwiruj zawartość probówki i amplifikuj DNA na termocyklerze. Pod koniec cyklu dodać 600 mikrolitrów buforu wiążącego do kolumny chromatografii jonowej umieszczonej w probówce zbiorczej i dodać DNA do kolumny.

Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać i odwiruj przez 30 sekund z pełną prędkością. Wyrzuć zebrany przepływ i dodaj 100 mikrolitrów buforu do płukania do kolumny. Odwirować kolumnę i ponownie odrzucić przepływ, jak pokazano.

Dodać 200 mikrolitrów buforu odsulfonacyjnego do kolumny na 15-20 minutową inkubację w temperaturze pokojowej, przed odwirowaniem próbki i odrzuceniem przepływu, jak pokazano. Następnie przemyj kolumnę dwa razy 200 mikrolitrami buforu do płukania na pranie. Po drugim płukaniu przenieś kolumnę do nowej 1,5 mililitrowej probówki zbiorczej i dodaj 100 mikrolitrów wody klasy PCR do membrany kolumny.

Następnie eluować DNA przez odwirowanie kolumny przez jedną minutę z pełną prędkością. W celu wytworzenia kropelek należy zmieszać jeden mikrolitr DNA przekształconego w wodorosiarczyn ze świeżo przygotowaną mieszanką główną sondy w probówce do PCR i zebrać próbkę przez krótkie odwirowanie. Użyj złączek szczytowych, aby podłączyć jednorazowe rurki płynowe do dwóch precyzyjnych szklanych strzykawek o objętości 250 mikrolitrów.

I wstępnie napełnij jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 250 mikrolitrami oleju nośnikowego zawierającego 5% środka powierzchniowo czynnego flouro, a jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 50 mikrolitrami oleju nośnikowego. Po załadowaniu obu strzykawek załaduj 100 mikrolitrów mieszanki PCR do strzykawki z olejem nośnikowym i umieść kropelkowe urządzenie mikroprzepływowe na stoliku pionowego mikroskopu świetlnego wyposażonego w szybką kamerę. W celu obserwacji i rejestracji tworzenia się kropel w czasie rzeczywistym, należy umieścić ampułkostrzykawki na programowalnej pompie strzykawkowej i użyć złączki szczytowej ze złączkami, aby połączyć rurki strzykawek z rurkami odpowiednich kanałów wlotowych urządzenia mikroprzepływowego kropelkowego.

Umieść rurkę od wylotu generatora kropel do wnętrza 0,5 mililitrowej probówki do PCR i dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej do dwóch mikrolitrów na minutę, aby umożliwić ustabilizowanie się wielkości kropli przed zebraniem powstałej emulsji. Powoli i ostrożnie zebrać emulsję z górnej części probówki i przenieść 75 mikrolitrów roztworu do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów w celu przeprowadzenia cykli termicznych. Następnie upewnij się, że zawartość oleju w probówce PCR ściśle odpowiada objętości fazy zdyspergowanej, aby zapobiec koalescencji kropelek podczas cykli termicznych, i umieść probówkę o pojemności 200 mikrolitrów w termocyklerze.

W celu obrazowania fluorescencyjnego zemulgowanej próbki należy przenieść emulsję PCR do borokrzemianowej rurki kapilarnej o głębokości 50 mikrometrów o profilu prostokątnym, aby umożliwić ułożenie kropel w ściśle upakowaną monowarstwę do obrazowania. Po zamocowaniu i uszczelnieniu kapilar na szkiełku mikroskopowym, załaduj szkiełko na stolik mikroskopu odwróconego. W oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego wybierz opcję Rejestruj i Żyj szybko, aby rozpocząć akwizycję kamery w czasie rzeczywistym.

Następnie obserwuj próbkę w jasnym polu i mikroskopii fluorescencyjnej. Po wytworzeniu kropel i cyklach termicznych kropelki mogą zostać wprowadzone do szklanej kapilary o szerokości jednego milimetra i wysokości 50 mikrometrów. Aby uzyskać jednowarstwowy rozkład kropel, który jest idealny do akwizycji obrazu fluorescencyjnego, obrazy mogą być następnie rejestrowane dla każdej długości fali.

Po analizie obrazu można wykreślić intensywność fluorescencji wszystkich kropel w odpowiednich fluoroforach w celu ustalenia progu kropli dodatnich i ujemnych. Po identyfikacji i zliczeniu można obliczyć wartości kopii na kroplę, a procent limfocytów T CD3 + i limfocytów T regulatorowych CD4 + 25 + można określić na podstawie metylowanych kopii CD3Z i FOXP3 odpowiednio, w odniesieniu do kopii na kroplę wszystkich komórek lub genu bez C. Wartości procentowe można następnie porównać z uzyskanymi w procesie obrazowania immunofluorescencyjnego przy użyciu odpowiednich przeciwciał.

Myślę, że stabilność emulsji od momentu wytworzenia kropli poprzez cykl termiczny i końcowe etapy obrazowania kropel ma kluczowe znaczenie dla uzyskania precyzyjnych, wiarygodnych i powtarzalnych wyników kwantyfikacji. Personalizacja MD PCR poprzez dostosowaną formułę mieszanki PCR może być wykorzystywana do wielu zastosowań, w tym do badań nad rakiem, diagnostyki chorób zakaźnych i analizy na poziomie pojedynczej komórki.