Name: Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę multipleksowego PCR kropelkowego specyficznego dla metylacji do precyzyjnego różnicowania leukocytów w diagnostyce hematologicznej. Ta technika oferuje opłacalną alternatywę dla barwienia immunofluorescencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Rady ds. Badań Naukowych Kanady.

<ol><li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li>
<li>Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+A+promising+landscape+for+immune+system-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases.</a> Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).</li>
<li>Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modulation+of+the+immune+function%3A+A+potential+target+for+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance.</a> Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).</li>
<li>Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and the adaptive immune response.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).</li>
<li>Zouali, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZouali%2C+M+%22The+Autoimmune+Diseases%22">The Autoimmune Diseases</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Wiencke, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+DNA+methylation+specific+droplet+digital+PCR+%28mdPCR%29+and+real+time+qPCR+with+flow+cytometry+in+characterizing+human+T+cells+in+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood.</a> Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoplastic+elastomers+for+microfluidics%3A+Towards+a+high-throughput+fabrication+method+of+multilayered+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).</li>
<li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cellular+lysis+to+microarray+detection%2C+an+integrated+thermoplastic+elastomer+%28TPE%29+point+of+care+Lab+on+a+Disc%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li>
<li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed%2C+methylation-specific+digital+droplet+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li>
<li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li>
<li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów do zgłoszenia.

Przedstawiony protokół i metody eksperymentalne pozwalają na przeprowadzenie mdPCR we własnym zakresie przy użyciu wyprodukowanego generatora kropel TPE, termocyklera i mikroskopu fluorescencyjnego. Wyprodukowane urządzenie wykorzystujące miękkie połączenie TPE z TPE zapewnia hydrofobowe właściwości powierzchni, które są jednolite na wszystkich ściankach kanału, dzięki czemu końcowe urządzenie nie wymaga żadnej obróbki powierzchni w celu późniejszego wykorzystania jako generator kropel. Materiał ten jest rutynowo stosowa...

Analiza składu białych krwinek (WBC) jest jednym z najczęściej wymaganych badań laboratoryjnych w diagnostyce hematologicznej. Różnicowa liczba leukocytów służy jako wskaźnik dla spektrum chorób, w tym infekcji, stanów zapalnych, niedokrwistości i białaczki, i jest badana jako wczesny biomarker prognostyczny dla kilku innych schorzeń. Złoty standard w podtypowaniu WBC obejmuje barwienie immunologiczne i/lub cytometrię przepływową, które wymagają kosztownych, podatnych na niestabilność przeciwciał fluorescencyjnych i często w dużym stopniu zależą od biegłości operatora w przygotowywaniu próbek. Ponadto metoda ta ma zastosowanie wyłącznie do świeżych próbek krwi, tak aby próbki nie mogły zostać zamrożone w celu wysyłki lub późniejszej analizy.
Markery epigenetyczne pojawiły się ostatnio jako potężne narzędzia analityczne do badania zmienności fenotypowej. Następnie wykazano, że ludzkie populacje leukocytów mają wzorce metylacji DNA linii komórkowej, które pozwalają na precyzyjną charakterystykę podzbiorów WBC. Podtypowanie oparte na markerach epigenetycznych stanowi obiecującą alternatywę, która nie zależy od pobrania próbki świeżej krwi ani drogich przeciwciał i może być wykorzystana jako biomarker początku choroby i podatności1,2,3,4,5.
Przeprowadzono badania całego genomu w celu obszernego mapowania metylowanych, specyficznych regionów bogatych w CG w genomie (wyspy CpG) w podtypach leukocytów w celu zidentyfikowania potencjalnych markerów epigenetycznych specyficznych dla podtypów leukocytów. Z tego powodu protokoły PCR zostały opracowane dla metylowanych regionów genów, np. CD3Z i FOXP3, odpowiadających odpowiednio limfocytom T CD3 + i limfocytom T regulatorowym CD4 + CD25 + (T-Regs). Wiencke i wsp. wykazali użyteczność dupleksowej kropelkowej reakcji PCR do epigenetycznego podtypowania limfocytów T, uzyskując wyniki, które silnie korelują z analizą sortowania komórek aktywowanych przepływem (FACS)6. Ta ilościowa metoda analizy genetycznej opiera się na podziale matrycowych cząsteczek kwasu nukleinowego i odczynników PCR na tysiące dyskretnych, zdefiniowanych objętościowo kropelek o rozmiarach poniżej nanolitrów, zawierających zero, jedną lub więcej docelowych kopii kwasów nukleinowych, przy użyciu emulsji typu woda w oleju umożliwianej przez mikrofluidykę7,8. Amplifikację PCR przeprowadza się w każdej pojedynczej kropli i mierzy się intensywność fluorescencji w punkcie końcowym każdej kropli, co pozwala na bezwzględne określenie ilościowe celów obecnych w próbce. Stwierdzono, że PCR kropelkowy jest bardziej precyzyjny, dokładny i technicznie prostszy niż standardowy qPCR, co czyni go bardziej korzystną metodą opartą na metylacji DNA do klinicznej oceny limfocytów T. Chociaż szybko rozwijająca się metodologia podtypowania, brakuje multipleksowanej analizy epigenetycznej do jednoczesnego sondowania różnych metylowanych regionów CpG. Jest to konieczne do rutynowego zliczania leukocytów.
Tutaj, przedstawiono i zastosowano urządzenie mikroprzepływowe z termoplastycznym elastomerem (TPE) do specyficznego dla metylacji multipleksowego kropelkowego PCR (mdPCR). Technologia ta została wykorzystana do wyznaczenia określonych podtypów leukocytów, limfocytów T CD3 + i T-Regów CD4 + CD25 +, w oparciu o wzorce metylacji DNA linii komórkowej, tj. zmienność epigenetyczną regionów CpG CD3Z i FOXP3. Szczegółowy protokół ekstrakcji DNA, konwersji wodorosiarczynów i mdPCR jest opisany w połączeniu z metodą wytwarzania urządzenia do generowania kropel TPE. Reprezentatywne wyniki metody porównano z wynikami barwienia immunofluorescencyjnego, co podkreśla użyteczność proponowanego podejścia.

<table><tbody><tr><td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td><td>TFI0201</td><td>probówka</td><td></td>do PCR</tr><tr><td>RAN Biotechnologies, Beverly, MA</td><td>008-FluoroSurfaktant</td><td>Fluoro-środek powierzchniowo czynny</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Quest International, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxford Instruments, Abingdon, Wielka Brytania</td><td></td><td>Kamera</td><td></td>EMCCD</tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>MA5-16728</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>22-8425-71</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td></td><td>Używany do analizy</td><td></td>obrazu fluorescencyjnego</tr><tr><td>Nikon, Japonia</td><td></td><td>10x obiektyw</td><td></td></tr><tr><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td><td>PCS-800-011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ram&eacute;-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)</td><td>p/n 200-U1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher, Kanada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrocom, NJ, USA</td><td>5015 i 5010 Rurka</td><td></td> <td>kapilarna borokrzemianowa</td></tr> <tr><td>(http://definetherain.org.uk/)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hamamatsu, Japonia</td><td>LC-L1V5</td><td>DEL Źródło</td><td></td>światła</tr><tr><td>UV Dolomit</td><td>3200063</td><td>Jednorazowe rurki</td><td></td>płynowe</tr><tr><td>Dolomit</td><td>3200302</td><td>Jednorazowe rurki</td><td></td>przepływowe</tr><tr><td>IDT, Coralville, IA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon, Melville, NY</td><td></td><td>Pionowy mikroskop</td><td></td>świetlny</tr><tr><td>Cytec Industries, Woodland Park, NJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EV Group, Sch&auml; rding, Austria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D5030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photron, San Diego, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDT, Coralville, IA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gersteltec, Pully, Szwajcaria</td><td></td><td>SU-8 photoresist</td><td></td></tr><tr><td>Fineline Imaging, Colorado Springs, CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td></td><td></td><td></td>203603</tr><tr><td>Obraz J</td><td></td><td>Służy do oceny średnicy</td><td></td></tr><tr><td>kropli Anachemia, Montreal, QC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excelitas, MA, USA</td><td></td><td>Świetlówka LED o szerokim spektrum</td> Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC DE1010 Hexpol TPE, &<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> m&aring; l, Szwecja</td><td></td><td>Elastomer termoplastyczny (TPE)</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>13-400-518</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon, Japonia</td><td></td><td>Używany do akwizycji</td><td></td>obrazu</tr><tr><td>3M, St Paul, MN</td><td></td><td>Olej</td><td></td>nośnikowy</tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R37605</td><td>Barwienie żywymi komórkami fluorescencyjnymi na niebiesko (DAPI)</td><td></td></tr><tr><td>IDEX Zdrowie & Science, Oak Harbor, WA</td><td>P-881</td><td>Złączki</td><td></td>PEEK</tr><tr><td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td><td>806552</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThinkyUSA, CA, USA</td><td>ARV 310</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ihc world, Maryland, USA</td><td>IW-125-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinsser NA, Northridge, CA</td><td>2607808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni GmbH, Korbussen, Niemcy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON</td><td>484431</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad, Mississauga, ON</td><td>1861096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon, Melville, NY</td><td></td> Mikroskop <td></td><td>odwrócony</td></tr><tr><td>Nikon, Japonia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loctite</td><td>Zobacz materiał AA 352</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzny dla metylacji multipleksowy pcr kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

opisano przebieg procesu PCR z multipleksem kropelkowym (mdPCR) i szczegółowy protokół do określania liczby rozmazów białych krwinek (WBC) na bazie epigenetycznej, wraz z urządzeniem do generowania kropel mikroprzepływowych z elastomeru termoplastycznego (TPE). Markery epigenetyczne są wykorzystywane do podtypowania WBC, co ma ważną wartość prognostyczną, w różnych chorobach. Osiąga się to poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA określonych regionów genomu bogatych w CG (loci CpG). W tym artykule DNA potraktowane wodorosiarczynem z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) jest zamknięte w kropelkach z odczynnikami mdPCR, w tym starterami i sondami fluorescencyjnymi do hydrolizy specyficznymi dla loci CpG, które korelują z subpopulacjami WBC. Podejście multipleksowe pozwala na badanie wielu loci CpG bez konieczności oddzielnych reakcji mdPCR, umożliwiając dokładniejsze parametryczne określenie subpopulacji WBC za pomocą analizy epigenetycznej miejsc metylacji. Ta precyzyjna kwantyfikacja może być rozszerzona na różne zastosowania i podkreśla korzyści dla diagnozy klinicznej i późniejszego rokowania.

Urządzenie mikrofluidyczne do generowania kropel oparte na TPE zostało wykonane zgodnie z opisanym protokołem, jak pokazano na Rysunku 1. W procesie fotolitografii zastosowano maskę przezroczystą w celu otrzymania formy matki z krzemu (Si). Przeprowadzono litografię miękką, aby uzyskać odwróconą replikę formy matki Si z PDMS, która posłużyła następnie do wykonania formy z epoksydu. Prekursor epoksydowy wylano na PDMS i utwardzono w celu sieciowania i stwardnienia. Forma ta, będąca dokładną r...

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

A multiplexed droplet PCR (mdPCR) workflow and detailed protocol for determining epigenetic-based white blood cell (WBC) differential count is described, ...

Protokół ten przedstawia elastyczny przepływ pracy PCR z wieloma kropelkami, który umożliwia precyzyjne różnicowe zliczanie leukocytów w oparciu o epigenetyczne markery metylacji. Ta elastyczność może ułatwić przełożenie mdPCR na zastosowanie kliniczne. Metoda ta zapewnia wyniki, które są bardzo zbliżone do wyników uzyskanych przy użyciu metod barwienia immunofluorescencyjnego.Jednak w przeciwieństwie do barwienia immunofluorescencyjnego, ta metoda nie wymaga świeżych próbek krwi ani kosztownych przeciwciał. W diagnostyce hematologicznej leukocyty różnicowe mogą służyć jako wskaźniki spektrum chorób, w tym infekcji, stanów zapalnych, niedokrwistości i białaczki, i są uważane za wczesny prognostyczny biomarker raka. Procedurę zademonstruje wraz z Abdelrahmanem Elmanzalawym Christina Nassif, specjalista techniczny z naszego zespołu w Centrum Badań nad Wyrobami Medycznymi NRC.Rozpocznij od dokładnego wymieszania 20 mikrolitrów kinazy białkowej K i 400 mikrolitrów buforu wiążącego lizę zawierającego kulki magnetyczne ze świeżo rozmrożonymi ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej w 100 mikrolitrach PBS. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na jedną do dwóch minut przed wyjęciem supernatantu. Po wyjęciu rurki z magnesu ponownie zawiesić kompleks kulek DNA w 600 mikrolitrach pierwszego buforu do mycia, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane kulki.Umieść probówkę z powrotem na magnesie, aby umożliwić usunięcie supernatantu, przed umyciem komórek w 600 mikrolitrach drugiego buforu do przemywania wody, jak pokazano powyżej. Po usunięciu supernatantu pozostaw probówkę do wyschnięcia na magnesie na powietrzu przez jedną minutę przed dodaniem 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do probówki z dokładnym wymieszaniem. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną do dwóch minut, aby oddzielić kulki magnetyczne od naliczonego DNA i przenieś oczyszczony roztwór DNA do nowej probówki.W celu konwersji wodorosiarczynu oczyszczonego DNA należy przenieść 20 mikrolitrów próbki DNA do probówki PCR i dodać do probówki 130 mikrolitrów odczynnika konwersyjnego. Po dokładnym wymieszaniu na krótko odwiruj zawartość probówki i amplifikuj DNA na termocyklerze. Pod koniec cyklu dodać 600 mikrolitrów buforu wiążącego do kolumny chromatografii jonowej umieszczonej w probówce zbiorczej i dodać DNA do kolumny.Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać i odwiruj przez 30 sekund z pełną prędkością. Wyrzuć zebrany przepływ i dodaj 100 mikrolitrów buforu do płukania do kolumny. Odwirować kolumnę i ponownie odrzucić przepływ, jak pokazano.Dodać 200 mikrolitrów buforu odsulfonacyjnego do kolumny na 15-20 minutową inkubację w temperaturze pokojowej, przed odwirowaniem próbki i odrzuceniem przepływu, jak pokazano. Następnie przemyj kolumnę dwa razy 200 mikrolitrami buforu do płukania na pranie. Po drugim płukaniu przenieś kolumnę do nowej 1,5 mililitrowej probówki zbiorczej i dodaj 100 mikrolitrów wody klasy PCR do membrany kolumny.Następnie eluować DNA przez odwirowanie kolumny przez jedną minutę z pełną prędkością. W celu wytworzenia kropelek należy zmieszać jeden mikrolitr DNA przekształconego w wodorosiarczyn ze świeżo przygotowaną mieszanką główną sondy w probówce do PCR i zebrać próbkę przez krótkie odwirowanie. Użyj złączek szczytowych, aby podłączyć jednorazowe rurki płynowe do dwóch precyzyjnych szklanych strzykawek o objętości 250 mikrolitrów.I wstępnie napełnij jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 250 mikrolitrami oleju nośnikowego zawierającego 5% środka powierzchniowo czynnego flouro, a jedną precyzyjną szklaną strzykawkę 50 mikrolitrami oleju nośnikowego. Po załadowaniu obu strzykawek załaduj 100 mikrolitrów mieszanki PCR do strzykawki z olejem nośnikowym i umieść kropelkowe urządzenie mikroprzepływowe na stoliku pionowego mikroskopu świetlnego wyposażonego w szybką kamerę. W celu obserwacji i rejestracji tworzenia się kropel w czasie rzeczywistym, należy umieścić ampułkostrzykawki na programowalnej pompie strzykawkowej i użyć złączki szczytowej ze złączkami, aby połączyć rurki strzykawek z rurkami odpowiednich kanałów wlotowych urządzenia mikroprzepływowego kropelkowego.Umieść rurkę od wylotu generatora kropel do wnętrza 0,5 mililitrowej probówki do PCR i dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej do dwóch mikrolitrów na minutę, aby umożliwić ustabilizowanie się wielkości kropli przed zebraniem powstałej emulsji. Powoli i ostrożnie zebrać emulsję z górnej części probówki i przenieść 75 mikrolitrów roztworu do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów w celu przeprowadzenia cykli termicznych. Następnie upewnij się, że zawartość oleju w probówce PCR ściśle odpowiada objętości fazy zdyspergowanej, aby zapobiec koalescencji kropelek podczas cykli termicznych, i umieść probówkę o pojemności 200 mikrolitrów w termocyklerze.W celu obrazowania fluorescencyjnego zemulgowanej próbki należy przenieść emulsję PCR do borokrzemianowej rurki kapilarnej o głębokości 50 mikrometrów o profilu prostokątnym, aby umożliwić ułożenie kropel w ściśle upakowaną monowarstwę do obrazowania. Po zamocowaniu i uszczelnieniu kapilar na szkiełku mikroskopowym, załaduj szkiełko na stolik mikroskopu odwróconego. W oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego wybierz opcję Rejestruj i Żyj szybko, aby rozpocząć akwizycję kamery w czasie rzeczywistym.Następnie obserwuj próbkę w jasnym polu i mikroskopii fluorescencyjnej. Po wytworzeniu kropel i cyklach termicznych kropelki mogą zostać wprowadzone do szklanej kapilary o szerokości jednego milimetra i wysokości 50 mikrometrów. Aby uzyskać jednowarstwowy rozkład kropel, który jest idealny do akwizycji obrazu fluorescencyjnego, obrazy mogą być następnie rejestrowane dla każdej długości fali.Po analizie obrazu można wykreślić intensywność fluorescencji wszystkich kropel w odpowiednich fluoroforach w celu ustalenia progu kropli dodatnich i ujemnych. Po identyfikacji i zliczeniu można obliczyć wartości kopii na kroplę, a procent limfocytów T CD3 + i limfocytów T regulatorowych CD4 + 25 + można określić na podstawie metylowanych kopii CD3Z i FOXP3 odpowiednio, w odniesieniu do kopii na kroplę wszystkich komórek lub genu bez C. Wartości procentowe można następnie porównać z uzyskanymi w procesie obrazowania immunofluorescencyjnego przy użyciu odpowiednich przeciwciał.Myślę, że stabilność emulsji od momentu wytworzenia kropli poprzez cykl termiczny i końcowe etapy obrazowania kropel ma kluczowe znaczenie dla uzyskania precyzyjnych, wiarygodnych i powtarzalnych wyników kwantyfikacji. Personalizacja MD PCR poprzez dostosowaną formułę mieszanki PCR może być wykorzystywana do wielu zastosowań, w tym do badań nad rakiem, diagnostyki chorób zakaźnych i analizy na poziomie pojedynczej komórki.

methylation-specific-multiplex-droplet-pcr-using-polymer-droplet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Ten film demonstruje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej multipleksowej do jednoczesnej kwantyfikacji regionów metylowanego DNA w różnych populacjach białych krwinek jako wczesnego biomarkera dla diagnozy klinicznej i prognozowania.

Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Ta praca przedstawia prostą i wizualną metodę wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Dzięki proponowanej metodzie cały eksperyment, w tym manipulacja kropelkami i wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych, może być przeprowadzony w temperaturze około 23 °C bez pomocy zaawansowanych urządzeń.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.

Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Poznaj metodę multipleksowego PCR kropelkowego specyficznego dla metylacji do precyzyjnego różnicowania leukocytów w diagnostyce hematologicznej. Ta technika oferuje opłacalną alternatywę dla barwienia immunofluorescencyjnego.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Przeglądaj więcej filmów