Name: Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj technikę Conpokal łączącą mikroskopię konfokalną z mikroskopią sił atomowych do niemal równoczesnego obrazowania i charakteryzacji mechanicznej żywych komórek. Ta metoda umożliwia badanie właściwości mechanicznych komórek mózgowych w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy finansowanie NIH COBRE pod numerem P20GM130456. Dziękujemy brytyjskiej organizacji Light Microscopy Core, która jest wspierana przez Wiceprezydenta ds. Badań, za pomoc w tych pracach. Szczepy S. mutans i E. faecalis zostały dostarczone przez dr Natalię Korotkovą. Pierwsza wzmianka o grze słów, Conpokal, opisującej połączenie mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych, przypisuje się dr Bradowi Berronowi, inżynierowi chemicznemu i materiałowemu na Uniwersytecie Kentucky, w dyskusji z dr Marthą Grady (autorką korespondencyjną) w oczekiwaniu na przybycie prelegenta seminarium, dr Jonathana Phama. który dołączył do wydziału inżynierii chemicznej i materiałowej na Uniwersytecie Kentucky jesienią 2017 roku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Narzędzia do mechanicznej oceny w mikro- lub nanoskali są często wykorzystywane do odkrywania cech deformacji na poziomie pojedynczej komórki lub mikroorganizmu, podczas gdy oddzielne narzędzia mikroskopowe o wysokiej rozdzielczości są używane do wizualizacji procesów subkomórkowych i cech strukturalnych. Conpokal to połączenie laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych (AFM) w jedną platformę instrumentalną. Technika Conpokal została po raz pierwszy zastosowana w niebiologicznym systemie polimerowym, w którym celem było określenie przyczepności, elastyczności i napięcia powierzchniowego twardych powierzchni stykających się z miękkimi powierzchniami. Obrazy konfokalne zapewniły wizualne odwzorowanie tego, jak polimer odkształca się, przylega i uwalnia z twardej sondy1,2. Od polimerów po próbki biologiczne, technika ta daje możliwość niemal jednoczesnego obrazowania konfokalnego żywych komórek lub mikroorganizmów i AFM.
Zmiany w elastyczności komórek są związane z patogenezą wielu chorób ludzkich3 w tym zaburzeń naczyniowych4, malaria5,6, anemia sierpowatokrwinkowa7, artretitis8, astma9, oraz rak6,10,11,12,13,14,15. Typowe techniki pomiaru mechaniki komórek obejmują użycie kulek magnetycznych16,17, pęseta optyczna18,19, aspiracja mikropipety8,20,21,22, oraz AFM11,23,24,25,26. Od czasu zastosowania AFM do żywych komórek, został on łatwo przystosowany do charakteryzowania topografii komórek27,28, a także właściwości mechanicznych11,24,29,30,31 z nanoskalową precyzją. AFM został dodatkowo zaadaptowany do mikroreologii32,33, frequency modulation34,35, and creep25,36,37 eksperymenty mające na celu zbadanie właściwości lepkosprężystych różnych linii komórkowych. Zastosowanie odpowiedniego modelu nanokontaktowego ma kluczowe znaczenie dla wyodrębnienia ilościowych wartości elastyczności z pomiarów siły wgniecenia wytworzonych przez AFM1,2. Badania AFM, które badają wpływ leków stosowanych w cytoszkieletzie na elastyczność komórek, wykazały, że moduł sprężystości jest silnie zaburzony38. Na podstawie pomiarów modułu sprężystości wielu badaczy wykazało, że komórki nowotworowe są bardziej miękkie niż ich nieprzekształcone odpowiedniki11,38,39. Zwiększona odkształcalność prawdopodobnie odgrywa znaczącą rolę w zdolności komórek nowotworowych do tworzenia przerzutów i infiltracji tkanek40. Takie zachowanie jest regulowane przez modyfikacje w organizacji komórek cytoszkieletu38,41,42. Oprócz raka, inną klasą chorób mechanicznych są choroby układu oddechowego. Na przykład zespół ostrego stresu oddechowego dotyka każdego roku coraz więcej ludzi. Wykazano, że gdy pacjenci są poddawani wentylacji mechanicznej, z wysokim stężeniem tlenu, ich stan może się pogorszyć43. W serii badań obserwujących makrofagi nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą AFM naukowcy odkryli, że dodanie środowiska bogatego w tlen zwiększyło sztywność komórek w wyniku tworzenia aktyny; Doskonałym przykładem wpływu, jaki AFM wywiera na nasze szczegółowe zrozumienie wpływu środowiska atmosferycznego na funkcję oddechową na poziomie komórkowym, a ostatecznie na leczenie i zdrowie człowieka44,45,46. Sztywność komórek nabłonka podczas migracji w kierunku rany można również ocenić za pomocą AFM i że występuje zmiana modułu sprężystości, aby zasygnalizować przyszłe rozprzestrzenianie się komórek47,48. Dlatego istnieje praktyczna potrzeba ilościowego pomiaru mechaniki komórek, aby zrozumieć, w jaki sposób chore komórki różnią się od zdrowych komórek i wchodzą z nimi w interakcje.
AFM jest również używany do badania właściwości adhezyjnych i struktury powierzchni. Mikroskop sił atomowych ma różne tryby zbierania informacji o próbce za pomocą mechaniki kontaktowej. W przypadku żywych próbek biologicznych dwa z głównych celów to uzyskanie ilościowych wartości właściwości mechanicznych (np. modułów sprężystości, sił adhezji), a także wysokości powierzchni mapy. Tryby te obejmują tryb gwintowania (znany również jako kontakt przerywany), który utrzymuje stałą amplitudę wspornika sporadycznie stykając się z powierzchnią próbki oraz tryb kontaktowy, który podnosi lub obniża wspornik, aby utrzymać stałe ugięcie49. Mapy przyczepności można zbierać za pomocą mapowania sił w systemie AFM. Wspornik wcina próbkę z określoną siłą, a następnie jest cofany. Siła opierająca się cofaniu jest mierzona przez detektor w celu wygenerowania wykresu siły-przemieszczenia. Siła adhezji to maksymalna siła mierzona podczas wciągania. Morfologia powierzchni zapewnia szczegółowy obraz próbki na poziomie mikro lub nano. Wspornik wykonuje skanowanie rastrowe w poprzek próbki w oparciu o wgłębienia i ugięcie uchwycone przez ruch wspornika w każdym pikselu, ujawniając cechy o rozmiarach mikro i nano. Za pomocą AFM można zmierzyć rozmiar małych obiektów, takich jak struktura peptydoglikanu 50, alignment łańcucha polimerowego51, flagella52, lamellipodia53 i filipodia54. Podczas gdy siła AFM tkwi w krzywych siła-przemieszczenie i nieoptycznych obrazach topologicznych, mikroskopia konfokalna oferuje szczegółowe obrazowanie próbek znakowanych fluorescencyjnie.
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest dominującą techniką obrazowania żywych komórek, komórek stałych i tkanek55,56,57. CLSM jest stosowany w obrazowaniu biologicznym od 1955 roku, tj. od momentu jego powstania58,59. Podczas gdy zasada działania mikroskopów konfokalnych (tj. odrzucanie nieostrego światła przez otwór przez otwór) pozostała w dużej mierze taka sama, implementacja techniczna stała się bardzo zróżnicowana56,57,58,60. Obrazowanie konfokalne może być realizowane poprzez skanowanie wielopunktowe, jak w systemie obracającego się dysku61, skanowanie punktowe pojedynczej wiązki laserowej, jak w skanowaniu liniowym62, lub obrazowanie funkcji rozproszenia punktów z kolejnymi reprzypisacjami pikseli za pomocą detektora wieloelementowego57. Ostatnie osiągnięcia, które rozszerzają użyteczność obrazowania konfokalnego, obejmują możliwość skanowania laserowego, szybkie skanowanie rezonansowe i detektory o wysokiej czułości63,64,65. Przewagą wszystkich systemów konfokalnych nad mikroskopami szerokokątnymi jest możliwość wykonywania przekrojów optycznych w osi z większą szczegółowością, zwłaszcza w grubych próbkach. Mikroskopy szerokokątne wykorzystujące detekcję opartą na kamerze zbierają światło emitowane z płaszczyzny ogniskowej i jednocześnie światło emitowane z każdego miejsca na ścieżce oświetlenia. Zamykając otwór, kosztem zmniejszenia sygnału, można zwiększyć zarówno rozdzielczość osiową, jak i poprzeczną66. W CLSM obrazy są budowane piksel po pikselu poprzez zbieranie sygnału emisyjnego, gdy laser wzbudzający jest skanowany w polu widzenia x-y. Zebranie kilku płaszczyzn x-y wzdłuż osi z próbki może być następnie wykorzystane do zrekonstruowania 3-wymiarowej architektury próbki57,67. Mikroskopia konfokalna w połączeniu z wprowadzeniem białek fluorescencyjnych zrewolucjonizowała nasze rozumienie biologii komórki68. Na przykład stał się niezbędnym narzędziem w neurobiologii69. CLSM jest regularnie używany do obserwacji oczyszczonych tkanek oraz do uzyskiwania kompleksowych obrazów architektury mózgu i sieci neuronalnej zabarwionej immunologicznie70. Ta aplikacja zaowocowała nowymi spostrzeżeniami na temat kontaktów synaptycznych i komunikacji między neuronami i komórkami glejowymi w mózgu71. Od komórek mózgowych po pęcherzyki, protokoły barwienia fluorescencyjnego wspierają kontrolę i uchwycenie funkcji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu osiągnięcia postępów w technikach terapeutycznych72,73.
Chociaż są to imponujące i wszechstronne narzędzia indywidualnie, połączenie mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych (Conpokal) pozwala badaczom na unikalne skorelowanie topograficznych i mikromechanicznych właściwości komórek/tkanek z obserwacją różnych organelli komórkowych i ich odpowiedniej dynamiki. Sparowane oprzyrządowanie pozwala użytkownikom zasadniczo "zobaczyć" to, co sondują; Ogromna przewaga nad jedną techniką samą w sobie. W przypadku Conpokal mapowanie sił przez AFM jest nakładane na obrazy konfokalne w celu skorelowania sztywności komórek, adhezji lub morfologii ze strukturą cytoszkieletu w próbce, na przykład. Ogólnym celem metody Conpokal jest zapewnienie naukowcom platformy do badania żywych próbek w zwięzły i skuteczny sposób, dostarczając zarówno obrazu, jak i danych o właściwościach materiałów na jednej platformie. W tej pracy demonstrujemy działanie Conpokal, w tym prawidłowy wybór i przygotowanie próbki, konfigurację urządzenia, kalibrację wspornika i przedstawiamy wskazówki dotyczące skutecznego rozwiązywania problemów. Po protokole zapewniamy reprezentatywne wyniki, które obejmują udane mapowanie wysokości AFM bakterii i komórek, mapowanie modułu AFM bakterii i komórek oraz obrazowanie konfokalne komórek znakowanych wielokrotnie, poprzez konfokalne i AFM tej samej komórki. Kończymy omówieniem krytycznych etapów procedury Conpokal, zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów, ograniczeń techniki, znaczenia i perspektyw na przyszłość dla tej metody.

<table><tbody><tr><td>Obudowa akustyczna</td><td>JPK-Bruker</td><td>Komora akustyczna</td><td>służąca do łagodzenia hałasu</td></tr><tr><td>BioTracker 488 Zielony mikrotubula cytoszkielet</td><td>Barwnik Millipore Sigma</td><td>SCT142</td><td>Służy do oznaczania mikrotubul w komórkach ssaków</td></tr><tr><td>CP-qp-CONT-BSG Końcówki AFM</td><td>NanoAndMore</td><td>CP-qp-CONT-BSG-B</td><td>Kolodialne końcówki AFM dobre do pomiarów modułu na próbkach</td></tr> <tr><td>biologicznychDil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D282</td><td>Służy do znakowania błony plazmatycznej komórek ssaków</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285601</td><td>Służy do symulacji środowiska biologicznego</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Fischer Scientific</td><td>45000-736</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Dodatki do pożywek mikrobiologicznych: Ekstrakt</td> drożdżowy <td>Fischer Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>Składnik pożywki do hodowli bakteryjnej</td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD35-100</td><td>Naczynia ze szklanym dnem, których ścianki boczne są mniejsze niż 10 mm, niezbędne do pełnego funkcjonowania kwasu nukleinowego Nanowizard 4a AFM</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 barwienie</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62249</td><td>Służy do oznaczania jądra komórek ssaków, dobry marker jądrowy dla żywych komórek</td></tr><tr><td>Ludzka nerka embrionalna 293 komórki</td><td>ATCC Globalne Centrum Zasobów Biologicznych</td><td>CRL-1573</td><td>Komórki ssaków użyte w protokole</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-716</td><td>Powłoka w naczyniu do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Model: PFQNM-LC-A-CAL Końcówki AFM</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-A-CAL</td><td>Końcówki AFM, które dobrze sprawdzają się w przypadku próbek o dużej wysokości (takich jak komórki eukariotyczne)</td></tr><tr><td>NanoWizard 4a</td><td>JPK-Bruker</td><td>NanoWizard 4a</td><td>AFM</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Nikon A1</td> Mikroskop <td>Nikon</td><td>A1 HD25</td><td>używany do obrazowania jasnego pola, epi-fluorescencji i konfokalnej</td></tr><tr><td>PENICYLINA/STREPTOMYCYNA</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td>Składnik pożywek</td></tr> <tr><td>do hodowli komórkowychPetriDishHeater</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>Utrzymuje żądaną temperaturę próbki na szalce Petriego</td></tr><tr><td>qp-BioAC-Cl Końcówki AFM</td><td>Nanosensory</td><td>qp-BioAC-Cl-10</td><td>Trzy różne wsporniki AFM o różnej sztywności</td></tr><tr><td>Wymienna pęseta z końcówką z włókna węglowego</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5051</td><td>Służy do ostrożnego umieszczania i wyjmowania delikatnych końcówek AFM w szklanym bloku montażowym</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth Bacto</td><td>BD DIFCO Bacterius Ltd</td><td>Bacto-249240</td><td>Składnik pożywki bakteryjnej</td></tr><tr><td>Wankomycyna, BODIPY FL Sprzężony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V34850</td><td>Służy do fluorescencyjnego znakowania ściany komórkowej bakterii</td></tr></tbody></table>

niemal równoczesna skaning laserowy mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (conpokal) na żywych komórkach

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniki dostępne do mechanicznej charakterystyki w mikro- i nanoskali eksplodowały w ciągu ostatnich kilku dekad. Od dalszego rozwoju skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego, po wynalezienie mikroskopii sił atomowych i postępy w obrazowaniu fluorescencyjnym, nastąpił znaczny postęp w technologiach umożliwiających badanie małych materiałów. Conpokal to portmanteau, który łączy mikroskopię konfokalną z mikroskopią sił atomowych (AFM), w której sonda "szturcha" powierzchnię. Chociaż każda technika jest niezwykle skuteczna w jakościowym i/lub ilościowym zbieraniu obrazów samodzielnie, Conpokal zapewnia możliwość testowania za pomocą mieszanego obrazowania fluorescencyjnego i charakterystyki mechanicznej. Zaprojektowany do niemal jednoczesnego obrazowania konfokalnego i sondowania sił atomowych, Conpokal ułatwia eksperymentowanie na żywych próbkach mikrobiologicznych. Dodatkowy wgląd w sparowane oprzyrządowanie zapewnia kolokalizację mierzonych właściwości mechanicznych (np. modułu sprężystości, przyczepności, chropowatości powierzchni) przez AFM ze składnikami subkomórkowymi lub aktywnością obserwowaną za pomocą mikroskopii konfokalnej. Praca ta zapewnia krok po kroku protokół działania skaningowej mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych, jednocześnie, w celu uzyskania tej samej komórki, tego samego regionu, obrazowania konfokalnego i charakterystyki mechanicznej.

Technika Conpokal została przedstawiona schematycznie na Ryc. 1A, a zdjęcie układu pokazano na Ryc. 1B. Aby precyzyjnie współlokalizować struktury biologiczne za pomocą mikroskopii konfokalnej z tymi samymi strukturami w AFM, krytyczne jest wyrównanie obu systemów podczas instalacji. Należy wybrać renomowanych producentów mikroskopów konfokalnych i AFM, którzy znają wzajemne wymagania przestrzenne swoich urządzeń. Ponadto pomyślna implementacja tej techniki zależy od prawidłowych procedur barwienia, unieruchomienia struktury biologicznej oraz odpowiedniego doboru końcówki AFM. Wysokość żywych komórek często stanowi wyzwanie w obrazowaniu AFM. Skan AFM żywej komórki HEK przedstawiono na Ryc. 2A. Wysokość tej konkretnej komórki HEK wynosiła około 10 μm, co wykazano za pomocą skanu liniowego zaznaczonego na zielono (Ryc. 2B). Końcówka AFM z zerowym offsetem (końcówka znajduje się na samym końcu dźwigni) lub końcówka o wysokości większej niż wysokość komórki (np. wysokość końcówki ≥ 10 μm) pozwoli na uzyskanie obrazu pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości. Przykład nieprawidłowego skanu wynikającego ze złego doboru końcówki AFM zamieszczono na Ryc. 2C. Na tym obrazie w szczycie komórki pojawiły się czarne piksele, co wskazuje, że piezoelement AFM wyszedł poza zakres z powodu dużej wysokości komórki. Koniec dźwigni AFM pojawił się na obrazie (w formie zaokrąglonego kwadratu) z powodu offsetu końcówki w połączeniu z niewystarczającą wysokością końcówki w stosunku do wysokości komórki. Artefakty te na obrazie AFM wskazują, że do obrazowania komórki należy wybrać inną końcówkę AFM.
Do tej metody wymagane jest wydajne znakowanie w barwieniu fluorescencyjnym oraz zastosowanie odpowiedniej sondy do obrazowania żywych komórek. Wykonaliśmy trójkolorowe obrazowanie konfokalne przedstawione na Rysunku 3A z użyciem barwienia jądrowego (fluorescencja niebieska), barwienia mikrotubul (fluorescencja zielona) oraz lipofilnego barwienia błon (fluorescencja czerwona). Sondy do żywych komórek wybrano ze względu na ich ograniczony overlap spektralny oraz kompatybilność ze standardowymi kostkami filtracyjnymi. W Rysunku 3B zamieściliśmy również obraz optyczny w polu jasnym.
Na podstawie AFM, analiza wgłębień powstałych pod wpływem sondy wraz z modelem nanomechanicznym pozwala na stworzenie mapy modułu sprężystości powierzchni. Przykład mapy modułu, opracowanej przy użyciu dopasowania modelu Hertza i profilu parabolicznego (promień 8 nm) dla kształtu sondy, przedstawiono na nałożeniu na rekonstrukcję 3D kształtu komórki na Rycynie 4A (są to te same dwie komórki, które pokazano na Rycynie 3). Odpowiadająca im projekcja 3D stosu z-stack z konfokalnego mikroskopu laserowego przedstawiona jest na Rycynie 4B.
Metoda ta jest odpowiednia również dla mniejszych struktur biologicznych, w tym pojedynczych bakterii, których cechy mikroskopowe i nanoskopowe są trudne do rozdzielenia przy użyciu mikroskopii świetlnej. W trwającym badaniu wykorzystuje się technikę Conpokal do analizy mechanizmów mechanicznych w obrębie ściany komórkowej, które wpływają na oporność na antybiotyki u Streptococcus mutans.74 Manipulacja składnikami ściany komórkowej doprowadziła do zmian w morfologii i oporności na antybiotyki. Conpokal umożliwia zbieranie danych z żywych komórek w roztworze (np. morfologii powierzchni, modułu sprężystości, siły adhezji i chropowatości powierzchni) na tych samych próbkach komórkowych, co pozwala powiązać właściwości mechaniczne z obecnością lub brakiem składników ściany komórkowej. Rycina 5A,B przedstawia skan AFM oraz mapę zmierzonego modułu bakterii Streptococcus mutans. W tej skali uzyskano lepszą rozdzielczość za pomocą AFM niż przy użyciu tradycyjnej mikroskopii konfokalnej.
Rysunek 6 przedstawia obraz konfokalny kolonii Enterococcus faecalis zabarwionej zielonym fluorescencyjnym barwnikiem do struktur komórkowych, który wiąże się ze ścianą komórkową. Rysunek 5 oraz Rysunek 6 demonstrują możliwość zastosowania techniki Conpokal w odniesieniu do mikroorganizmów, a nie tylko do komórek eukariotycznych.
<img alt="Schemat połączonej mikroskopii AFM i konfokalnej, przedstawiający konfigurację AFM i proces analizy bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Konfiguracja Conpokal. 
(A) Schemat techniki Conpokal. (B) Zdjęcie konfiguracji instrumentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), mapy wysokości, profil dźwigni, pomiary w nanoskali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mikroskopia sił atomowych żywych komórek. 
(A) Obraz AFM dwóch komórek HEK. (B) Profil wysokości (zielona linia w A) komórki HEK wskazujący, że wysokość komórki jest znaczna i wynosi 10 μm. (C) Słabej jakości obraz AFM komórki astrocytu, w którym piezo AFM wyszedł poza zakres w wierzchołku komórki i widoczne są dowody odwrotnego obrazowania końca dźwigni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna struktur komórkowych; jądro zabarwione na niebiesko, cytoplazma na czerwono z zielonymi akcentami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Mikroskopia konfokalna i w polu jasnym żywych komórek. 
(A) Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna żywych komórek HEK zabarwionych barwnikiem jądrowym (fluorescencja niebieska), barwnikiem mikrotubul (fluorescencja zielona) oraz lipofilnym barwnikiem błon (fluorescencja czerwona). (B) Odpowiadający obraz optyczny w polu jasnym. Paski skali wynoszą 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Topografia komórki 3D, mapa modułu sprężystości i dane fluorescencyjne, wyniki mikroskopii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Porównanie renderingów 3D z mikroskopii AFM i konfokalnej żywych komórek HEK. 
(A) Mapa modułu opracowana przy użyciu dopasowania do modelu Hertza i profilu parabolicznego (promień 8 nm) dla kształtu końcówki, nałożona na rekonstrukcję 3D komórki z AFM. (B) Odpowiadająca jej projekcja 3D stosu z-stack z konfokalnego mikroskopu laserowego z barwieniem jądra (fluorescencja niebieska), barwieniem mikrotubul (fluorescencja zielona) i lipofilnym barwieniem błony (fluorescencja czerwona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii sił atomowych porównujące powierzchnię komórki bakteryjnej z pomiarami siły i skalą kolorystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: AFM próbki bakterii. 
(A) Skan AFM i (B) mapa zmierzonego modułu bakterii Streptococcus mutans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej skupisk bakterii zabarwionych na zielono; wizualizacja komórek, analiza mikrobiologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Mikroskopia konfokalna próbki bakterii. 
Obraz konfokalny kolonii Enterococcus faecalis z zielonym fluorescencyjnym barwieniem błony. Pasek skali wynosi 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Conpokal łączy mikroskopię konfokalną z mikroskopią sił atomowych za pomocą sondy do szturchania powierzchni próbki. Chociaż obie techniki są skuteczne indywidualnie, Conpokal ułatwia kolokację fluorescencji z charakteryzacją mechaniczną. Główną zaletą techniki Conpokal jest niemal jednoczesna podwójna mikroskopia.Confocal bada cytoszkielet i inne procesy komórkowe przed i po sondowaniu AFM, które zapewnia właściwości mechaniczne specyficzne dla danego obszaru. Technika ta ma wpływ na dziedzinę mechanobiologii, ponieważ na przykład komórki mózgowe mogą być badane w warunkach fizjologicznych w celu zbadania impulsów elektrycznych i działania siły. Przed rozpoczęciem analizy należy wybrać odpowiedni wspornik AFM do żądanego zbierania danych i użyć rękawiczek, stolika do montażu chipa AFM, pęsety i małego śrubokręta do zamontowania chipa w pustaku szklanym.Ostrożnie umieść chip AFM na środku pustaka szklanego. Wspornik wraz z bardzo małą częścią chipa AFM powinien znajdować się w widocznej, nieprzezroczystej części pustaka szklanego. Użyj śrubokręta, aby dokręcić, aż wiór będzie ściśle przylegał do pustego szkła i użyj soczewki, aby sprawdzić, czy chip jest prawidłowo zorientowany.Gdy chip zostanie prawidłowo zorientowany, umieść pustak szklany w głowicy AFM we właściwej orientacji i zablokuj pustak szklany na miejscu. Po zlokalizowaniu dna naczynia kalibracyjnego za pomocą mikroskopii w jasnym polu, użyj panelu sterowania silnika krokowego AFM system Z, aby przesunąć wspornik AFM o 2000 mikronów nad próbkę. Korzystając z jasnego oświetlenia pola i panelu sterowania silnika krokowego Z, powoli opuść chip AFM na dno szklanej naczynia w krokach od 100 do 200 mikronów, aby uniknąć zderzenia końcówki AFM z szalką Petriego.Zlokalizuj ręczne mikrometry, które sterują X, Y lub w ruchu swobodnym głowicy AFM na platformie instrumentu. Gdy cień z wysięgnika AFM staje się ciemniejszy, a kształt staje się ostrzejszy, użyj ręcznych mikrometrów, aby skorygować głowicę AFM i dostosować położenie wspornika AFM w polu view. W tej chwili może być konieczne dostosowanie tabel odnośników.Uważaj, czy w widoku oprogramowania mikroskopu pojawi się cień, który wskazuje, że końcówka AFM zbliża się do dna naczynia. Kontynuuj, małymi krokami, aby obniżyć końcówkę AFM, aż końcówka będzie w większości ostra. Gdy laser jest na swoim miejscu, użyj pokręteł wyrównywania lasera, aby ustawić laser z tyłu miejsca, w którym końcówka AFM znajduje się na wsporniku.Panel wyrównywania lasera powinien wyświetlać sygnał sumy większy niż zero woltów. Przesuń laser na niewielką odległość we wszystkich kierunkach na wsporniku AFM, aż do uzyskania maksymalnego sygnału sumy, pozostając na końcówce AFM. Po ustawieniu pozycji lasera użyj ręcznie sterowanych pokręteł odchylenia, aby wyzerować odchylenie pionowe i boczne.Użyj pokręteł odchylenia pionowego i bocznego, aby ustawić detektor tak, aby cel był wyśrodkowany i nie zaobserwowano odchylenia pionowego ani bocznego w panelu wyrównywania lasera. Otwórz okno Kalibracja i wprowadź wszystkie informacje specyficzne dla eksperymentów. Wymień filtr światła laserowego.Przed kalibracją wyłącz źródło światła mikroskopu konfokalnego i zamknij obudowę AFM, aby tłumić wszelkie potencjalne szumy pochodzące ze światła w pomieszczeniu lub wibracje. Naciśnij przycisk kalibracji, aby automatycznie zezwolić systemowi na kalibrację końcówki. Po zakończeniu kalibracji sztywność wspornika i jego czułość zostaną wyświetlone w panelu Kalibracja.Następnie użyj przycisku Automated Approach Command, aby opuścić końcówkę na dno naczynia na próbkę i ustawić rozmiar obszaru skóry, rozdzielczość, wartość zadaną, długość Z i czas piksela, zanim naciśniesz przycisk odtwarzania, aby rozpocząć skanowanie. W przypadku obrazowania mikroskopem konfokalnym w oprogramowaniu mikroskopu włącz możliwości konfokalne i wybierz linie laserowe odpowiednie dla barwników, które zostały użyte do barwienia próbek. Wybierz jedną lub wiele linii laserowych, aby wzbudzić i zobrazować te cechy w próbce i ustaw wzmocnienie na wartość, która optymalizuje fluorescencję próbki, ale ogranicza ilość szumu.Dostosuj moc lasera, aby uniknąć nasyconych pikseli, jednocześnie maksymalizując zakres dynamiczny i ustaw rozmiar otworka na jedną jednostkę obszaru, aby zmaksymalizować rozdzielczość przekroju optycznego. W razie potrzeby dostosuj wartości na podstawie jasności próbki. Aby ustawić czas przebywania pikseli, zacznij od około dwóch mikrosekund czasu przebywania i dostosuj, aby odzwierciedlić jasność próbki zgodnie z potrzebami.Aby wybrać rozmiar piksela dla wybranego obiektywu, pozwól instrumentowi obliczyć rozmiar piksela za pomocą przycisku opcji Nyquist i wybraną liczbę pikseli na obrazie. Następnie wybierz opcję Skanuj i rozpocznij zbieranie danych. Użyj pokrętła ostrości, aby zlokalizować płaszczyznę ogniskową reprezentującą cechy próbek w jej najwyraźniejszej formie, przycisku Skanuj, aby rozpocząć zbieranie danych, a przycisku Przechwyć, aby przechwycić dwuwymiarowy obraz.Korzystając z panelu, który steruje rozmiarem piksela za pomocą opcji Nyquist, zmniejsz rozmiar obszaru skanowania, aby objąć tylko jedną komórkę. Aktywuj narzędzie do zbierania i korzystając z opcji od dołu do góry, przy czym tylko linia lasera oświetla obiekt w próbce, ustaw płaszczyznę początkową i końcową dla mierzonej objętości, korzystając z sugerowanych odstępów między płaszczyznami. Nazwij plik i zapisz go w powiązanym folderze.Alternatywnie, jeśli istnieje nasza aprioryczna wiedza na temat grubości próbek, wybierz najjaśniejszą, najostrzejszą środkową płaszczyznę, dostosowując ostrość, aby zdefiniować objętość i ustaw górną część tak, aby grubość próbki znajdowała się powyżej środkowej płaszczyzny, a dolną tak, aby grubość znajdowała się poniżej środkowej płaszczyzny, a następnie wybierz odpowiedni rozmiar kroku. Uruchom akwizycję, naciskając przycisk Uruchom teraz. Po zakończeniu pobierania zapisz plik w odpowiednim folderze.Pod koniec eksperymentu załóż rękawiczki podczas wyjmowania pustaka szklanego i umieść go w stacji montażowej. Użyj pęsety z gumowymi uchwytami, aby ostrożnie usunąć chip AFM i umieść zużytą końcówkę z powrotem w miejscu schowka skierowanym poza dostęp, aby wskazać, że była używana. Na przyszłość zanotuj, która końcówka została użyta w eksperymencie.Tutaj pokazano reprezentatywny skan AFM nad żywą komórką HEK. Wysokość tej konkretnej komórki HEK wynosiła około 10 mikronów, jak wykazano na skanowaniu linii. W tym miejscu można zaobserwować przykład słabego skanowania spowodowanego niewłaściwym doborem końcówki AFM.Na tym zdjęciu czarne piksele pojawiły się na wierzchołku komórki, co wskazuje, że strefa AFM PA była poza zasięgiem ze względu na dużą wysokość komórki. Koniec wspornika AFM pojawia się również na obrazie ze względu na przesunięcie końcówki w połączeniu z niewystarczającą wysokością końcówki w porównaniu z wysokością komórki. Te artefakty na obrazie AFM wskazują, że do obrazowania komórki należało wybrać inną końcówkę AFM.Można wykonać trójkolorowe obrazowanie konfokalne. Na przykład, aby uwidocznić jądro komórkowe, mikrokanaliki i błonę lipofilową. Analiza wgłębień końcówki w połączeniu z modelem nanomechanicznym pozwala na wygenerowanie mapy modułowej powierzchni.Tutaj pokazano odpowiednią projekcję 3D laserowego stosu konfokalnego Z. Skany AFM i mapy zmierzonego modułu mogą być również pozyskiwane dla drobnoustrojów, jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie bakterii Streptococcus mutans. Jak wykazano, lepszą rozdzielczość w tej skali można osiągnąć za pomocą AFM niż przy użyciu tradycyjnej mikroskopii konfokalnej.Mapowanie siły adhezji to technika wykonywana za pomocą conpokal w celu wizualizacji interakcji molekularnych. Na przykład, aby zbadać modulację cząsteczek na powierzchni komórki w celu obserwacji kinetyki wiązania. Projekt Conpokal otwiera nową ścieżkę badania zależności między strukturą a funkcją w mikrobiologii medycznej.Na przykład zdarzenia fizyczne i chemiczne oraz warstwa peptydoglikanu mogą być powiązane z opornością na antybiotyki.

near-simultaneous-laser-scanning-confocal-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Najbardziej badanym aspektem biokompatybilności kompozytów dentystycznych jest ich cytotoksyczność, obrazowanie poklatkowe 3D CLSM w połączeniu z kwantyfikacją sygnału fluorescencyjnego pozwala na czułą ocenę losu komórki w czasie. Wykorzystanie tej metody może być skutecznym narzędziem do oceny cytokompatybilności kompozytów dentystycznych.

Konfokalne obrazowanie poklatkowe jako skuteczna metoda oceny cytozgodności kompozytów dentystycznych

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj technikę Conpokal łączącą mikroskopię konfokalną z mikroskopią sił atomowych do niemal równoczesnego obrazowania i charakteryzacji mechanicznej żywych komórek. Ta metoda umożliwia badanie właściwości mechanicznych komórek mózgowych w warunkach fizjologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów