Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach
11 sierpnia 2020
Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.
Conpokal łączy mikroskopię konfokalną z mikroskopią sił atomowych za pomocą sondy do szturchania powierzchni próbki. Chociaż obie techniki są skuteczne indywidualnie, Conpokal ułatwia kolokację fluorescencji z charakteryzacją mechaniczną. Główną zaletą techniki Conpokal jest niemal jednoczesna podwójna mikroskopia.
Confocal bada cytoszkielet i inne procesy komórkowe przed i po sondowaniu AFM, które zapewnia właściwości mechaniczne specyficzne dla danego obszaru. Technika ta ma wpływ na dziedzinę mechanobiologii, ponieważ na przykład komórki mózgowe mogą być badane w warunkach fizjologicznych w celu zbadania impulsów elektrycznych i działania siły. Przed rozpoczęciem analizy należy wybrać odpowiedni wspornik AFM do żądanego zbierania danych i użyć rękawiczek, stolika do montażu chipa AFM, pęsety i małego śrubokręta do zamontowania chipa w pustaku szklanym.
Ostrożnie umieść chip AFM na środku pustaka szklanego. Wspornik wraz z bardzo małą częścią chipa AFM powinien znajdować się w widocznej, nieprzezroczystej części pustaka szklanego. Użyj śrubokręta, aby dokręcić, aż wiór będzie ściśle przylegał do pustego szkła i użyj soczewki, aby sprawdzić, czy chip jest prawidłowo zorientowany.
Gdy chip zostanie prawidłowo zorientowany, umieść pustak szklany w głowicy AFM we właściwej orientacji i zablokuj pustak szklany na miejscu. Po zlokalizowaniu dna naczynia kalibracyjnego za pomocą mikroskopii w jasnym polu, użyj panelu sterowania silnika krokowego AFM system Z, aby przesunąć wspornik AFM o 2000 mikronów nad próbkę. Korzystając z jasnego oświetlenia pola i panelu sterowania silnika krokowego Z, powoli opuść chip AFM na dno szklanej naczynia w krokach od 100 do 200 mikronów, aby uniknąć zderzenia końcówki AFM z szalką Petriego.
Zlokalizuj ręczne mikrometry, które sterują X, Y lub w ruchu swobodnym głowicy AFM na platformie instrumentu. Gdy cień z wysięgnika AFM staje się ciemniejszy, a kształt staje się ostrzejszy, użyj ręcznych mikrometrów, aby skorygować głowicę AFM i dostosować położenie wspornika AFM w polu view. W tej chwili może być konieczne dostosowanie tabel odnośników.
Uważaj, czy w widoku oprogramowania mikroskopu pojawi się cień, który wskazuje, że końcówka AFM zbliża się do dna naczynia. Kontynuuj, małymi krokami, aby obniżyć końcówkę AFM, aż końcówka będzie w większości ostra. Gdy laser jest na swoim miejscu, użyj pokręteł wyrównywania lasera, aby ustawić laser z tyłu miejsca, w którym końcówka AFM znajduje się na wsporniku.
Panel wyrównywania lasera powinien wyświetlać sygnał sumy większy niż zero woltów. Przesuń laser na niewielką odległość we wszystkich kierunkach na wsporniku AFM, aż do uzyskania maksymalnego sygnału sumy, pozostając na końcówce AFM. Po ustawieniu pozycji lasera użyj ręcznie sterowanych pokręteł odchylenia, aby wyzerować odchylenie pionowe i boczne.
Użyj pokręteł odchylenia pionowego i bocznego, aby ustawić detektor tak, aby cel był wyśrodkowany i nie zaobserwowano odchylenia pionowego ani bocznego w panelu wyrównywania lasera. Otwórz okno Kalibracja i wprowadź wszystkie informacje specyficzne dla eksperymentów. Wymień filtr światła laserowego.
Przed kalibracją wyłącz źródło światła mikroskopu konfokalnego i zamknij obudowę AFM, aby tłumić wszelkie potencjalne szumy pochodzące ze światła w pomieszczeniu lub wibracje. Naciśnij przycisk kalibracji, aby automatycznie zezwolić systemowi na kalibrację końcówki. Po zakończeniu kalibracji sztywność wspornika i jego czułość zostaną wyświetlone w panelu Kalibracja.
Następnie użyj przycisku Automated Approach Command, aby opuścić końcówkę na dno naczynia na próbkę i ustawić rozmiar obszaru skóry, rozdzielczość, wartość zadaną, długość Z i czas piksela, zanim naciśniesz przycisk odtwarzania, aby rozpocząć skanowanie. W przypadku obrazowania mikroskopem konfokalnym w oprogramowaniu mikroskopu włącz możliwości konfokalne i wybierz linie laserowe odpowiednie dla barwników, które zostały użyte do barwienia próbek. Wybierz jedną lub wiele linii laserowych, aby wzbudzić i zobrazować te cechy w próbce i ustaw wzmocnienie na wartość, która optymalizuje fluorescencję próbki, ale ogranicza ilość szumu.
Dostosuj moc lasera, aby uniknąć nasyconych pikseli, jednocześnie maksymalizując zakres dynamiczny i ustaw rozmiar otworka na jedną jednostkę obszaru, aby zmaksymalizować rozdzielczość przekroju optycznego. W razie potrzeby dostosuj wartości na podstawie jasności próbki. Aby ustawić czas przebywania pikseli, zacznij od około dwóch mikrosekund czasu przebywania i dostosuj, aby odzwierciedlić jasność próbki zgodnie z potrzebami.
Aby wybrać rozmiar piksela dla wybranego obiektywu, pozwól instrumentowi obliczyć rozmiar piksela za pomocą przycisku opcji Nyquist i wybraną liczbę pikseli na obrazie. Następnie wybierz opcję Skanuj i rozpocznij zbieranie danych. Użyj pokrętła ostrości, aby zlokalizować płaszczyznę ogniskową reprezentującą cechy próbek w jej najwyraźniejszej formie, przycisku Skanuj, aby rozpocząć zbieranie danych, a przycisku Przechwyć, aby przechwycić dwuwymiarowy obraz.
Korzystając z panelu, który steruje rozmiarem piksela za pomocą opcji Nyquist, zmniejsz rozmiar obszaru skanowania, aby objąć tylko jedną komórkę. Aktywuj narzędzie do zbierania i korzystając z opcji od dołu do góry, przy czym tylko linia lasera oświetla obiekt w próbce, ustaw płaszczyznę początkową i końcową dla mierzonej objętości, korzystając z sugerowanych odstępów między płaszczyznami. Nazwij plik i zapisz go w powiązanym folderze.
Alternatywnie, jeśli istnieje nasza aprioryczna wiedza na temat grubości próbek, wybierz najjaśniejszą, najostrzejszą środkową płaszczyznę, dostosowując ostrość, aby zdefiniować objętość i ustaw górną część tak, aby grubość próbki znajdowała się powyżej środkowej płaszczyzny, a dolną tak, aby grubość znajdowała się poniżej środkowej płaszczyzny, a następnie wybierz odpowiedni rozmiar kroku. Uruchom akwizycję, naciskając przycisk Uruchom teraz. Po zakończeniu pobierania zapisz plik w odpowiednim folderze.
Pod koniec eksperymentu załóż rękawiczki podczas wyjmowania pustaka szklanego i umieść go w stacji montażowej. Użyj pęsety z gumowymi uchwytami, aby ostrożnie usunąć chip AFM i umieść zużytą końcówkę z powrotem w miejscu schowka skierowanym poza dostęp, aby wskazać, że była używana. Na przyszłość zanotuj, która końcówka została użyta w eksperymencie.
Tutaj pokazano reprezentatywny skan AFM nad żywą komórką HEK. Wysokość tej konkretnej komórki HEK wynosiła około 10 mikronów, jak wykazano na skanowaniu linii. W tym miejscu można zaobserwować przykład słabego skanowania spowodowanego niewłaściwym doborem końcówki AFM.
Na tym zdjęciu czarne piksele pojawiły się na wierzchołku komórki, co wskazuje, że strefa AFM PA była poza zasięgiem ze względu na dużą wysokość komórki. Koniec wspornika AFM pojawia się również na obrazie ze względu na przesunięcie końcówki w połączeniu z niewystarczającą wysokością końcówki w porównaniu z wysokością komórki. Te artefakty na obrazie AFM wskazują, że do obrazowania komórki należało wybrać inną końcówkę AFM.
Można wykonać trójkolorowe obrazowanie konfokalne. Na przykład, aby uwidocznić jądro komórkowe, mikrokanaliki i błonę lipofilową. Analiza wgłębień końcówki w połączeniu z modelem nanomechanicznym pozwala na wygenerowanie mapy modułowej powierzchni.
Tutaj pokazano odpowiednią projekcję 3D laserowego stosu konfokalnego Z. Skany AFM i mapy zmierzonego modułu mogą być również pozyskiwane dla drobnoustrojów, jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie bakterii Streptococcus mutans. Jak wykazano, lepszą rozdzielczość w tej skali można osiągnąć za pomocą AFM niż przy użyciu tradycyjnej mikroskopii konfokalnej.
Mapowanie siły adhezji to technika wykonywana za pomocą conpokal w celu wizualizacji interakcji molekularnych. Na przykład, aby zbadać modulację cząsteczek na powierzchni komórki w celu obserwacji kinetyki wiązania. Projekt Conpokal otwiera nową ścieżkę badania zależności między strukturą a funkcją w mikrobiologii medycznej.
Na przykład zdarzenia fizyczne i chemiczne oraz warstwa peptydoglikanu mogą być powiązane z opornością na antybiotyki.
Przegląd
Technika Conpokal integruje mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych, umożliwiając niemal jednoczesne obrazowanie i charakteryzację mechaniczną żywych próbek biologicznych. Metoda ta poprawia badania procesów komórkowych, zapewniając szczegółowe informacje o właściwościach mechanicznych obok obrazowania fluorescencyjnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mechanobiologia
- Wizualizowanie komórek
- Charakteryzacja biofizyczna
Tło
- Conpokal łączy dwie potężne techniki mikroskopowe.
- Umożliwia ko-lokalizację fluorescencji z charakteryzacją mechaniczną.
- Technika ta jest szczególnie przydatna do badania komórek mózgowych w warunkach fizjologicznych.
- Pozwalla naukowcom badać impulsy elektryczne i transakcje sił w żywych komórkach.
Cel badania
- Dostarczyć protokół dla techniki Conpokal.
- Przedstawić zalety dwóch mikroskopii w badaniach biologicznych.
- Ułatwić zrozumienie mechaniki i procesów komórkowych.
Zastosowane metody
- Selekcja i montaż wahaczy AFM.
- Kalibracja systemu AFM.
- Konfiguracja i optymalizacja obrazowania konfokalnego.
- Procedury zbierania i analizowania danych.
Główne wyniki
- Udana integracja obrazowania konfokalnego i AFM.
- Wykazanie mapowania właściwości mechanicznych żywych komórek.
- Lepsze zrozumienie zachowania komórkowego pod stresem mechanicznym.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu dla powtarzalności w badaniach.
Wnioski
- Technika Conpokal jest cennym narzędziem w mechanobiologii.
- Pozwalla na kompleksową analizę mechaniki i procesów komórkowych.
- Metoda ta może prowadzić do nowych wglądów w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Conpokal enables near simultaneous confocal imaging and atomic force microscopy, providing co-localized mechanical and fluorescence data from live cells. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking in target validation by linking subcellular structures to nanoscale mechanical properties such as elastic modulus and adhesion. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by enabling direct correlation of cytoskeletal dynamics with force transmission in physiologically relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating cytoskeletal organization with localized mechanical responses in live cells.
- Operational Value: Enables area-specific mechanical property mapping (e.g., elastic modulus, adhesion) alongside subcellular fluorescence signals.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by revealing how molecular perturbations affect cellular mechanophenotypes under near-physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated live-cell systems for quantitative nanomechanical readouts that complement fluorescence-based assays.
- Operational Value: Standardizes probe-sample interaction through calibrated AFM cantilever selection and controlled indentation parameters.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across cell types (e.g., HEK cells, Streptococcus mutans) for consistent mechanical phenotyping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links nanoscale mechanical maps (e.g., modulus, adhesion) to subcellular components via fluorescence co-localization, supporting biomarker alignment in mechanobiology.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of cellular responses to mechanical or chemical perturbations in live microbiological samples.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies structural-functional relationships (e.g., peptidoglycan layer changes linked to antibiotic resistance) that inform go/no-go decisions in antimicrobial development.
Pipeline & Workflow Integration
Conpokal fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing orthogonal mechanical and imaging data from the same cellular region.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how cytoskeletal drugs or genetic edits alter local stiffness and adhesion in live cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative nanomechanical outputs (e.g., force maps, modulus distributions) when AFM parameters are standardized and calibrated.
- Analytics: Generates co-localized datasets where mechanical properties are directly overlaid with confocal signals (e.g., tubulin, nucleus, membrane) for multiparametric analysis.
- Translational Research: Connects nanomechanical phenotypes to disease-relevant systems (e.g., microbial biofilms, neuronal cultures) only when supported by parallel fluorescence readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable core facility capability for mechanophenotyping across diverse live-cell models without requiring sample fixation or fixation-induced artifacts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking fluorescence-identified structures to quantified mechanical properties at subcellular resolution.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized AFM tip calibration, laser alignment, and deflection zeroing prior to data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, multi-parametric evidence of target engagement effects on cellular mechanics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to normalize pathological mechanophenotypes in disease-relevant live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both confocal microscopy and atomic force microscopy, including probe selection and laser safety.
- Dependent on instrumentation capable of near-simultaneous modality integration, including synchronized scanning stages and dual-detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of indentation parameters (set point, Z length, pixel time) for reproducible mechanical mapping across labs.
- Requires adaptation of AFM cantilever stiffness and tip geometry to match sample topography (e.g., avoiding tip-offset artifacts in high-height cells like HEK).
- Practical limitation: Accurate mechanical mapping depends on proper tip-sample contact and avoidance of artifacts from insufficient tip height or PA zone saturation, as demonstrated in failed scans.
