Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Synapsy są funkcjonalnymi elementami neuronów, a ich defekty lub ubytki leżą u podstaw wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurologicznych. Badania obrazowe są szeroko stosowane do badania ich funkcji i plastyczności w stanach fizjologicznych i patologicznych. Ze względu na ich rozmiar i strukturę, badania lokalizacyjne białek wymagają technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

W tym protokole opisujemy procedurę badania w neuronach pierwotnych kolokalizacji docelowych białek z markerami synaptycznymi na poziomie superrozdzielczości przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego. SIM to technika wzorzystego oświetlenia światłem, która podwaja rozdzielczość przestrzenną mikroskopii szerokokątnej, osiągając szczegółowość około 100 nanometrów. Protokół wskazuje wymagane kontrole i ustawienia dla solidnych badań kolokalizacyjnych oraz przegląd metod statystycznych do prawidłowej analizy danych obrazowych.

Kluczem do umożliwienia analizy na poziomie superrozdzielczości są jednak odczynniki używane podczas akwizycji, takie jak komorowe szkiełka nakrywkowe i roztwory montażowe zgodne ze współczynnikiem dyfrakcji obiektywu. Aby uzyskać pierwotny neuron hipokampa myszy, wyizoluj hipokampy od szczeniąt P1 do P4. Płytki komórkowe po 70 000 komórek na studzienkę w objętości 200 mikrolitrów na studzienkę.

Poczekaj, aż pierwotne neurony hipokampa osiągną pełną dojrzałość 12 do 14 dni po posiewie, aby przeprowadzić badania kolokalizacji. Dodaj 4% paraformaldehydu, PFA, w PBS 200 mikrolitrów na studzienkę do neuronów, aby szybko je naprawić. Usunąć roztwór i inkubować próbki z 1% albuminą surowicy bydlęcej, BSA, w PBS w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby pasywnie pokryć wszystkie swobodnie wiążące powierzchnie płytki białkiem nieistotnym do analizy.

Bufor blokujący oparty na BSA bez Triton X-100 redukuje tło przeciwciał skuteczniej niż ten sam bufor z 0,2%Triton X-100. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe. Jako kontrolę ujemną nie dodawaj żadnego przeciwciała pierwszorzędowego do jednej z studzienek.

Zamontuj ogniwa za pomocą uchwytu kompatybilnego z kartą SIM, np. ProLong Glass Antifade Mountant. Przykryj i zabezpiecz komórki szkłem nakrywkowym, na przykład okrągłym szkłem nakrywkowym o średnicy ośmiu milimetrów.

Można również użyć kwadratowych. Szkiełka nakrywkowe z komorą należy przechowywać w temperaturze pokojowej i odczekać co najmniej 48 godzin przed uzyskaniem obrazów. Szkło diamentowe wymaga co najmniej dwóch dni utwardzania przed akwizycją w super rozdzielczości.

Użyj dwóch strategii, aby zapewnić swoistość przeciwciał. Pierwszym z nich jest zastosowanie co najmniej dwóch różnych przeciwciał ukierunkowanych na ten sam substrat. Drugą strategią jest neutralizacja przeciwciał poprzez inkubację z oczyszczonym celem białkowym lub używanym do wyhodowania przeciwciała.

Do naszych analiz rutynowo używamy mikroskopu superrozdzielczego N-SIM wyprodukowanego przez firmę Nikon. Poniższe instrukcje mają na celu uzyskanie obrazów karty SIM niezależnie od używanego mikroskopu. Ważne jest również, aby zmaksymalizować wydajność mikroskopu, aby przeprowadzić dokładną kalibrację instrumentów, w tym pierścień korekcyjny, wyrównanie lasera i ogniskowanie bloku siatki.

Przed akwizycją obrazów SIM system wymaga odpowiedniej kalibracji za pomocą koralików fluorescencyjnych o określonym rozmiarze poniżej rozdzielczości. Przykładem są mikrosfery TetraSpeck. Koraliki te są barwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, aby umożliwić kalibrację różnych laserów za pomocą jednej próbki.

W łaźni wodnej sonikować około 1,8 razy 10 do 8 fluorescencyjnych mikrosfer przez 10 minut. Rozcieńczyć mikrosfery fluorescencyjne jeden na 500 w wodzie podwójnie destylowanej. Poddaj sonifikację po raz drugi przez dodatkowe 10 minut.

Odpipetować 15 mikrolitrów rozcieńczonych kulek do studzienki z komorowym szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw roztwór do wyschnięcia na pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu montażowego, np.

ProLong Glass, i umieść na wierzchu ośmiomilimetrowe szkiełko nakrywkowe. Odczekaj co najmniej 48 godzin, aby umożliwić prawidłowe utwardzenie. Włącz mikroskop i lasery.

Pozwól systemowi się rozgrzać, aby osiągnąć równowagę termiczną wszystkich elementów mikroskopu, a system mikroskopu superrozdzielczego SIM wymaga co najmniej trzech godzin. Wybierz obiektyw 100X. Rozpocznij kalibrację od wyrównania laserów do środka bloku siatki dyfrakcyjnej.

W systemie N-SIM pokrętło mikrometryczne oraz dedykowana kamera umożliwiają wyśrodkowanie wiązki światła do celu. Włóż szkiełko nakrywkowe z komorą mikroskopu do view. Ustaw system na grubość szkiełka nakrywkowego z komorą, regulując osłonę korekcji obiektywu.

NIS Software, zastrzeżone oprogramowanie dostarczane z systemami mikroskopów superrozdzielczych N-SIM, posiada automatyczną funkcję regulacji korekcji kolorów. Dostosuj ostrość bloku siatki dla każdego kanału, aby zapewnić skupione, strukturalne oświetlenie wzoru na próbce. Oprogramowanie zapewnia automatyczną funkcję tego zadania.

Uzyskaj surowe obrazy 3D SIM wielokolorowych mikrosfer. Oblicz dla każdej oddzielnej długości fali transformację Fouriera obrazu nadrozdzielczego. Jeśli przekształcony obraz nie uzyska prawidłowego wzoru przypominającego kwiat, wznów kalibrację, ponieważ nie osiągnięto super rozdzielczości.

Na obrazie o wysokiej rozdzielczości wybierz pojedynczą mikrosferę i oblicz jej profil intensywności dla każdego kanału, aby zmierzyć osiągniętą rozdzielczość. Powinien teraz wynosić blisko 100 nanometrów w boku. Wykonaj rejestrację kanałów, nakładając wielokanałową akwizycję mikrosfer.

Celem jest kolimacja wszystkich sygnałów kanału poprzecznie i osiowo. Wyeliminuje to aberracje chromatyczne spowodowane niewspółosiowością różnych kanałów i pomoże w analizie kolokalizacji. Potwierdź jakość kalibracji, korzystając z funkcji etapu fazy oświetlenia i wzorzystego ostrości iluminacji SIMcheck, zestawu wtyczek do aplikacji open source ImageJ.

Rozpocznij analizę próbki za pomocą obiektywu 40X w trybie konfokalnym lub szerokokątnym. Pozwala to na nawigację po próbce, zachowując dobrą szczegółowość i duże pole widzenia. Użyj sygnału przeciwciała MAP2, aby wykryć obszar reprezentujący procesy neuronalne.

Uzyskaj obrazy próbki w trybie konfokalnym, aby określić jakość barwienia. Przełącz się na obiektyw 100X. Nałóż olej na obiektyw 100X.

Uzyskaj obraz szerokokątny lub konfokalny, który zostanie później wykorzystany do oceny jakości obrazu o wysokiej rozdzielczości. Przełącz na tryb karty SIM 3D. Korzystając z okien dialogowych do ustawiania parametrów akwizycji, wybierz najwyższe dostępne ustawienie głębi bitowej, aby zmaksymalizować informacje o kolorach.

Zazwyczaj standardowym wyborem jest 16 bitów. Ponadto, aby poprawić stosunek sygnału do szumu, wybierz wartość niskiej częstotliwości do akwizycji, na przykład jeden megaherc. Korzystając z okien histogramu, ustaw moc lasera, aby uzyskać liniową odpowiedź sygnału, aby uniknąć utraty informacji, ogranicz nasycone piksele na obrazach.

System N-SIM wykorzystuje kamerę Andor iXon3. Podczas pracy w trybie 16 bitów wybierz docelową intensywność 16 000, aby zapewnić liniową reakcję kamery. Alternatywnie wybierz zakres od 30 000 do 45 000, aby zmaksymalizować dynamiczny zakres przejęć.

Ustaw moc lasera w zakresie od 0,1% do 50% podczas obrazowania próbek i czasy naświetlania od 50 milisekund do dwóch sekund. Moc lasera powyżej 50% może powodować szybkie fotowybielanie używanych fluoroforów. Rozpocznij pobieranie obrazów w trybie 3D SIM.

Użyj SIMcheck, zestawu bezpłatnych wtyczek do ImageJ, aby ocenić jakość pozyskiwania surowych obrazów. Jeśli SIMcheck nie wykryje żadnych artefaktów ani problemów z jakością, uzyskaj co najmniej 10 obrazów z pełnych replik technicznych, aby umożliwić analizę statystyczną. Pozyskane obrazy to surowe dane, które należy przetworzyć w celu uzyskania zrekonstruowanych obrazów karty SIM, które zostaną wykorzystane do dalszej analizy.

W protokole sugerujemy stosowanie synaptofizyny i PSD-95 jako markerów synaptycznych przed i po. Można jednak użyć dodatkowych znaczników. Ogromna literatura popiera stosowanie innych białek, takich jak drebryna i fagot, jako markerów synaptycznych.

Obrazy uzyskane za pomocą karty SIM 3D to surowe obrazy, które należy przetworzyć w celu uzyskania zrekonstruowanych obrazów o wysokiej rozdzielczości. Nieprawidłowa rekonstrukcja surowych obrazów może prowadzić do powstania artefaktów, które wpłynęłyby na analizę próbek. Dużą uwagę należy zatem zwrócić na odpowiedni dobór parametrów rekonstrukcji.

Przetwarzaj surowe obrazy za pomocą oprogramowania do analizy rekonstrukcji mikroskopu, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości. Alternatywnie użyj bezpłatnej wtyczki ImageJ fairSIM, aby zrekonstruować surowe obrazy. Oblicz transformację Fouriera obrazów superrozdzielczych za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji mikroskopu lub wtyczki ImageJ SIMcheck.

Dobry, zrekonstruowany obraz powinien zwracać, dla każdego kanału, obraz przypominający kwiat. Jeśli zrekonstruowane obrazy nie odtworzą kształtu przypominającego kwiat, uruchom ponownie od obrazów RAW i zrekonstruuj je, modyfikując parametry rekonstrukcji, takie jak filtrowanie liniowe, apodyzacja i pomijanie zerowego rzędu. W oprogramowaniu sieciowej usługi informacyjnej, korzystając z podglądu, w celu monitorowania, jak zmiana parametrów wpływa na ostateczną rozdzielczość obrazu, zmodyfikuj kontrast modulacji oświetlenia parametru, tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości i tłumienie nieostrości.

Analizuj zrekonstruowany obraz, aby bezstronnie wykrywać artefakty za pomocą NanoJ-SQUIRREL, wtyczki opartej na ImageJ, do oceny jakości obrazów o wysokiej rozdzielczości. W naszej analizie kolokalizacji zastosowaliśmy dwa podejścia. Pierwszym z nich jest podejście wizualne oparte na analizie profilu, które pokazuje pojedyncze zdarzenia kolokalizacji i identyfikuje wkład każdego kanału.

Pierwszym krokiem do zbadania kolokalizacji między markerami synaptycznymi a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania jest wykonanie obrazu o wysokiej rozdzielczości i przeanalizowanie pojedynczego locus w celu określenia nakładania się sygnałów. Zidentyfikuj pojedyncze miejsce na obrazie o wysokiej rozdzielczości. Uzyskaj profile intensywności sygnałów fluorescencyjnych do miejsca zainteresowania.

Jeśli analiza profilu zasugerowała kolokalizację pojedynczego locus, bardziej ogólną analizę całego obrazu można przeprowadzić, obliczając współczynniki Pearsona i Mandera. Użyj JACoP, wtyczki ImageJ, aby określić dwa parametry kolokalizacji, Pearsona i Mandera. Po skalibrowaniu systemu i ocenie jakości zrekonstruowanych obrazów, przystąpiliśmy do analizy pierwotnych kultur neuronalnych wybarwionych przeciwciałem przeciwko MAP2, markerowi neuronalnemu, PSD-95, markerowi postsynaptycznemu i naszemu docelowemu białku SUMO1.

Najpierw przeanalizowaliśmy próbkę, wykonując czterokanałową mikroskopię konfokalną z obiektywem 40X. Po wybraniu obszaru reprezentującego procesy neuronalne, przełączyliśmy się na obiektyw 100X. Pobraliśmy zarówno obrazy konfokalne, jak i SIM tego samego obszaru, aby ocenić jakość rekonstrukcji za pomocą NanoJ-SQUIRREL i przeprowadzić analizę kolokalizacji.

Wyjaśnienie struktury i składu synapsy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych procesów regulujących pamięć i poznanie. Podczas gdy w stanie normalnym synapsy są budulcem pamięci, są one również podstawą złożonych zaburzeń neurologicznych, takich jak jedna z najczęstszych form demencji, choroba Alzheimera. Opisany tutaj protokół pozwala na badanie składu białek synaps za pomocą techniki mikroskopii superrozdzielczej zwanej mikroskopią oświetlenia strukturalnego.