Name: Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Poznaj mikroskopię superrozdzielczą SIM do badania kolokalizacji białek w pierwotnych neuronach myszy. Ta metoda pozwala osiągnąć rozdzielczość około 100 nanometrów i szczegółowo analizować interakcje białek synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Edoardo Micottiemu za konstruktywną krytykę manuskryptu. Badanie to było wspierane przez BrightFocus A2019296F, przez Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), przez Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN), przez Innowacyjną Sieć Szkoleniową "Maria Skłodowska-Curie" (JK) oraz przez Fondazione Telethon TCP15011, Alzheimer's Association AARG-17-505136 (LF).

1. Kultury pierwotne
<ol>
	<li>Hodowla pierwotnych neuronów hipokampa myszy w komorowych szkiełkach nakrywkowych (takich jak Ibidi μ-Slide 8 Well lub Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), które spełniają obiektywne wymagania dotyczące grubości szkiełka nakrywkowego #1,5 (0,17 mm).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe z komorą pokryć 100 μl poli-L-lizyny (100 μg/ml).</li>
	<li>Następnego dnia należy dwukrotnie przemyć szkiełka nakrywkowe w komorze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Aby uzyskać pierwotne neurony myszy, wyizoluj hipokampy od P1-P4 pups23.</li>
	<li>Umieść wypreparowane hipokampy w 10 ml pożywki preparacyjnej (Tabela 1) i pozwól im odłożyć je na dno probówki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie wyjmij pożywkę do wypreparowania, pozostawiając hipokamp nienaruszony na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki 1 (Tabela 1) do hipokampa i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie wyjmij pożywkę 1, pozostawiając hipokampy nienaruszone na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki 2 (Tabela 1) i pozostawić (zakrytą) probówkę wirówkową poziomo pod okapem na 45 minut.</li>
	<li>Pozostaw probówkę wirówkową pionowo, aby tkanka mogła osiąść na dnie probówki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety ostrożnie wyjmij pożywkę 2, pozostawiając hipokampy nienaruszone na dnie probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki 3 (Tabela 1).</li>
	<li>Za pomocą pipety p1000 z końcówką z filtrem mechanicznie oddzielić komórki od tkanki.</li>
	<li>Przenieść supernatant, w którym znajdują się izolowane neurony, do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 2 minuty przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Po odwirowaniu komórki znajdują się na dnie probówki wirówkowej. Za pomocą sterylnej pipety wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w 1 ml pożywki 4.</li>
	<li>Użyj filtra 70 μm, aby wyeliminować niezdysocjowane komórki.</li>
	<li>Policz żywe komórki w komorze Bürkera, dodając 1 μl 0,4 % roztworu błękitu trypanowego do 19 μl zawiesiny komórek.</li>
	<li>Płytki komórkowe w ilości 70 000 komórek/dołek w objętości 200 μl na studzienkę.</li>
	<li>Pozostawić komórki na przyczepienie się na 2 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyjąć szkiełka nakrywkowe z komorą z inkubatora i ostrożnie zastąpić podłoże 200 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Pozostawić szkiełka nakrywkowe z komorą w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2.</li>
	<li>Zastąp jedną trzecią pożywki świeżymi pożywkami hodowlanymi co 5-7 dni.</li>
	<li>Poczekaj, aż pierwotne neurony hipokampa osiągną pełną dojrzałość (12-14 dni po posiewie), aby przeprowadzić badania kolokalizacji.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Pobrać szkiełka nakrywkowe z komorą z inkubatora.</li>
	<li>Usuń nośnik.</li>
	<li>Szybko umyj studzienki 200 μl PBS.</li>
	<li>Dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS (200 μl/studzienkę) do neuronów, aby szybko je naprawić.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór PFA.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez dodanie PBS z 0,2% Triton X-100 (200 μL/dołek).</li>
	<li>Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór i inkubować próbki z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (200 μl/basenik) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby biernie pokryć wszystkie wolne powierzchnie wiążące płytki białkiem nieistotnym do analizy. Bufor blokujący oparty na BSA bez Triton X-100 redukuje tło przeciwciał bardziej efektywnie niż ten sam bufor z 0,2% Triton X-100.</li>
	<li>Usuń roztwór.</li>
	<li>Dodać wybrane przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze PBS zawierającym 1% BSA i 0,2% Triton X-100 (120-200 μl/basenik, w zależności od rozcieńczenia przeciwciała i dostępności). Inkubować próbki przez 2 godziny.
	<ol>
		<li>Jako kontrolę ujemną nie dodawaj żadnego przeciwciała pierwszorzędowego do jednej z studzienek. W tym samym czasie można stosować wiele przeciwciał różnych gatunków przeciwko różnym celom. Użyj przeciwciała przeciwko MAP2 (markerowi neuronalnemu) wyhodowanemu u kurczaka, przeciwciała przeciwko PSD95 lub synaptofizynie wyhodowanej u myszy oraz przeciwciała przeciwko docelowemu białku wyhodowanemu u królika. Pozwala to na trójkolorowe analizy karty SIM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko umyj studzienki trzykrotnie PBS (200 μl/studzienkę).</li>
	<li>Dodaj przeciwciała drugorzędowe (można użyć przeciwciał drugorzędowych dyLight i Alexa) rozcieńczone w roztworze PBS zawierającym 1% BSA i 0,2% Triton X-100 (200 μL/basenik). Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szybko umyj studzienki trzykrotnie PBS (200 μl/studzienkę).</li>
	<li>Dodać barwnik Hoechst o stężeniu 1 μg/ml rozcieńczony w PBS (200 μl/basenik) do barwienia jąder. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szybko umyj studzienki dwukrotnie za pomocą PBS.</li>
	<li>Zamontuj komórki za pomocą uchwytu kompatybilnego z kartą SIM. Użyj 10 μl/dołek ProLong Glass Antifade Mountant.</li>
	<li>Przykryj i zabezpiecz ogniwa szkłem nakrywkowym (np. okrągłym szkłem nakrywkowym o średnicy 8 mm). Można również użyć kwadratowych.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe z komorą należy przechowywać w temperaturze pokojowej i odczekać co najmniej 48 godzin przed uzyskaniem obrazów. Diamond Glass wymaga co najmniej dwóch dni utwardzania przed przejęciami w super rozdzielczości.</li>
</ol>
3. Kontrola swoistości przeciwciał
UWAGA: Użyj dwóch strategii, aby zapewnić swoistość przeciwciał. Pierwsza strategia polega na użyciu co najmniej dwóch różnych przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu substratowi. Drugą strategią jest neutralizacja przeciwciał poprzez inkubację z oczyszczonym celem białkowym lub epitopem używanym do podniesienia przeciwciała.
<ol>
	<li>Inkubować wybrane przeciwciało z pięciokrotnym nadmiarem rekombinowanego celu lub epitopu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 1% BSA w PBS.</li>
	<li>Po inkubacji użyć zneutralizowanego przeciwciała o zwykłym stężeniu do barwienia, jak opisano powyżej z ppkt 2.11.</li>
</ol>
4. Kalibracja mikroskopu
UWAGA: Rutynowo używamy systemu mikroskopu super-rozdzielczego N-SIM wyprodukowanego przez firmę Nikon do badań super-rozdzielczości. Jednak kilka innych firm również oferuje w swoich katalogach mikroskopy superrozdzielcze. Chociaż opisano konkretne wskazania dla systemu N-SIM firmy Nikon, poniższe instrukcje można uogólnić na inne systemy. Przed akwizycją obrazów SIM system wymaga odpowiedniej kalibracji za pomocą koralików fluorescencyjnych o określonym rozmiarze poniżej rozdzielczości. Przykładem są mikrosfery TetraSpeck. Koraliki te są barwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, aby umożliwić kalibrację różnych laserów za pomocą jednej próbki.
<ol>
	<li>W łaźni wodnej sonikować około 1,8 x 108 fluorescencyjnych mikrosfer przez 10 minut. System N-SIM firmy Nikon wymaga do kalibracji próbki rzadko zaludnionych wielokolorowych koralików. Może się to różnić w przypadku innych systemów, które wymagają gęstej pojedynczej warstwy koralików fluorescencyjnych o rozmiarze poniżej rozdzielczości. Dostosuj odpowiednio liczbę cząstek fluorescencyjnych.</li>
	<li>Rozcieńczyć mikrosfery fluorescencyjne w stosunku 1:500 w wodzie podwójnie destylowanej.</li>
	<li>Poddaj sonifikację po raz drugi przez dodatkowe 10 minut.</li>
	<li>Odpipetować 15 μl rozcieńczonych kulek do studzienki w komorze na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Pozostaw roztwór do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu montażowego i umieścić na wierzchu szkiełko nakrywkowe o grubości 8 mm.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 48 godzin, aby umożliwić prawidłowe utwardzenie.</li>
	<li>Włącz mikroskop i lasery.</li>
	<li>Pozwól systemowi się rozgrzać, aby osiągnąć równowagę termiczną wszystkich elementów mikroskopu. System mikroskopu superrozdzielczego N-SIM wymaga co najmniej 3 godzin.</li>
	<li>Wybierz obiektyw 100x.</li>
	<li>Rozpocznij kalibrację od wyrównania laserów do środka bloku siatki dyfrakcyjnej. W systemie N-SIM pokrętło mikrometryczne oraz dedykowana kamera umożliwiają wyśrodkowanie wiązki światła do celu.</li>
	<li>Włóż szkiełko nakrywkowe z komorą do mikroskopu w celu view. Ustawić system na grubość szkiełka nakrywkowego w komorze poprzez regulację kołnierza korekcyjnego obiektywu. Oprogramowanie NIS, autorskie oprogramowanie dostarczane z systemami mikroskopu N-SIM Super-Resolution Microscope, posiada automatyczną funkcję regulacji kołnierzy korekcyjnych.</li>
	<li>Dostosuj ostrość bloku siatki dla każdego kanału, aby zapewnić skupione, strukturalne oświetlenie wzoru na próbce. Oprogramowanie NIS zapewnia automatyczną funkcję dla tego zadania.</li>
	<li>Następnie uzyskaj surowe obrazy 3D-SIM wielokolorowych mikrosfer. Zrekonstruuj surowe obrazy, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości, korzystając z oprogramowania mikroskopowego lub platformy oprogramowania typu open source do analizy obrazów biologicznych ImageJ24 i wtyczki fairSIM25.</li>
	<li>Oblicz, dla każdej wydzielonej długości fali, transformację Fouriera obrazu superrozdzielczego uzyskanego w 4.14. Jeśli przekształcony obraz nie uzyska prawidłowego wzoru przypominającego kwiat, należy wznowić kalibrację od wersji 4.11, ponieważ nie osiągnięto superrozdzielczości.</li>
	<li>Na obrazie o wysokiej rozdzielczości wybierz pojedynczą mikrosferę i oblicz jej profil intensywności dla każdego kanału, aby zmierzyć osiągniętą rozdzielczość. Powinien być teraz bliski 100 nm w boku.</li>
	<li>Następnie wykonaj rejestrację kanału, nakładając wielokanałową akwizycję mikrosfer. Celem jest kolimacja wszystkich sygnałów kanału poprzecznie i osiowo. Wyeliminuje to aberracje chromatyczne spowodowane niewspółosiowością różnych kanałów i pomoże w analizie kolokalizacji.</li>
	<li>Potwierdź jakość kalibracji za pomocą funkcji "Etapy fazy oświetlenia" i "Skupienie wzoru oświetlenia" w SIMcheck26, zestawie wtyczek do aplikacji open source ImageJ. W tym celu należy przygotować komorowe szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać gęstą pojedynczą warstwę mikrosfer TetraSpeck i uzyskać obraz 3D-SIM próbki. Przeanalizuj obraz w obrazie ImageJ i, jeśli zostaną wykryte aberracje, uruchom ponownie kalibrację mikroskopu od kroku 4.11.</li>
</ol>
5. Akwizycja
<ol>
	<li>Rozpocznij analizę próbki za pomocą obiektywu 40x w trybie konfokalnym lub szerokokątnym. Pozwala to na nawigację do próbki, zachowując dobre szczegóły i duże pole widzenia.</li>
	<li>Użyj sygnału przeciwciała MAP2, aby zidentyfikować obszar reprezentujący procesy neuronalne.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy próbki w trybie konfokalnym, aby określić jakość barwienia. Słaba jakość konfokalna będzie odzwierciedlać się w niskiej jakości karty SIM, co będzie wymagało wyrzucenia próbek.</li>
	<li>Jeśli obszar i jakość obrazów są zadowalające, przełącz obiektyw na 100x.</li>
	<li>Nałóż olej na obiektyw 100x.</li>
	<li>Uzyskaj obraz szerokokątny lub konfokalny, który zostanie później wykorzystany do oceny jakości obrazu o wysokiej rozdzielczości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Przełącz na tryb 3D-SIM.</li>
	<li>Korzystając z okien dialogowych do ustawiania parametrów akwizycji, wybierz najwyższe dostępne ustawienie głębi bitowej, aby zmaksymalizować informacje o kolorach. Zazwyczaj standardowym wyborem jest wersja 16-bitowa. Ponadto, aby poprawić stosunek sygnału do szumu, wybierz wartość niskiej częstotliwości do akwizycji, na przykład 1 MHz.</li>
	<li>Korzystając z okien histogramu, ustaw moc laserów, aby uzyskać liniową odpowiedź sygnału. Aby uniknąć utraty informacji, ogranicz nasycone piksele na obrazach. System N-SIM wykorzystuje kamerę Andor iXon3. Podczas pracy w trybie 16-bitowym wybierz docelową intensywność 16 000, aby zapewnić liniową reakcję kamery. Alternatywnie wybierz zakres od 30 000 do 45 000, aby zmaksymalizować dynamiczny zakres akwizycji.</li>
	<li>Ustaw moc lasera w zakresie od 0,1% do 50% podczas obrazowania próbek i czasy ekspozycji od 50 ms do 2 s. Moce lasera powyżej 50% mogą powodować szybkie fotowybielanie używanych fluoroforów.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie obrazów w trybie 3D-SIM.</li>
	<li>Użyj SIMcheck, pakietu bezpłatnych wtyczek do ImageJ, aby ocenić jakość pozyskiwania surowych obrazów.</li>
	<li>Jeśli SIMCheck nie wykryje żadnych artefaktów ani problemów z jakością, uzyskaj co najmniej 10 obrazów z 4 replik technicznych, aby umożliwić analizę statystyczną.</li>
</ol>
6. Postprodukcja: rekonstrukcja obrazu
UWAGA: Obrazy pozyskane za pomocą karty 3D-SIM to surowe obrazy, które muszą zostać przetworzone, aby uzyskać zrekonstruowane obrazy o wysokiej rozdzielczości. Nieprawidłowa rekonstrukcja surowych obrazów może prowadzić do powstania artefaktów, które wpłynęłyby na analizę próbek. Dużą uwagę należy zatem zwrócić na odpowiedni dobór parametrów rekonstrukcji.
<ol>
	<li>Przetwarzaj surowe obrazy za pomocą oprogramowania do analizy rekonstrukcji mikroskopu, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Alternatywnie użyj bezpłatnej wtyczki ImageJ fairSIM, aby zrekonstruować surowe obrazy.</li>
	<li>Oblicz transformację Fouriera obrazów o wysokiej rozdzielczości za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji mikroskopu lub wtyczki ImageJ SIMCheck. Dobry, zrekonstruowany obraz powinien zwracać, dla każdego kanału, obraz przypominający kwiat. Jeśli zrekonstruowane obrazy nie odtworzą kształtu przypominającego kwiat, uruchom ponownie od obrazów RAW i zrekonstruuj je, modyfikując parametry rekonstrukcji, takie jak filtrowanie Wienera, apodyzacja i tłumienie zerowego rzędu27. W oprogramowaniu sieciowej usługi informacyjnej, korzystając z podglądu, aby monitorować, jak zmiana parametrów wpływa na ostateczny rozdzielczość obrazu, zmodyfikuj parametry i) Kontrast modulacji oświetlenia, ii) Tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości i iii) Tłumienie nieostrości.</li>
	<li>Następnie przeanalizuj zrekonstruowany obraz, aby bezstronnie wykryć artefakty za pomocą NanoJ-SQUIRREL28, wtyczki opartej na ImageJ do oceny jakości obrazów o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Jeśli NanoJ-SQUIRREL wykryje artefakty, uruchom ponownie od surowych obrazów i zrekonstruuj je, modyfikując parametry rekonstrukcji, takie jak filtrowanie Wienera, apodyzacja i tłumienie zerowego rzędu. W oprogramowaniu sieciowej usługi informacyjnej, korzystając z podglądu, aby monitorować, jak zmiana parametrów wpływa na ostateczną rozdzielczość obrazu, zmodyfikuj parametry Kontrast modulacji oświetlenia, Tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości i Tłumienie nieostrości.</li>
	<li>Użyj obrazów o wysokiej rozdzielczości, aby obliczyć profil kolokalizacji i/lub współczynniki Pearsona i Mandera.</li>
</ol>
7. Kolokacja z analizą profilu
UWAGA: Jako pierwszy krok do zbadania kolokalizacji między markerami synaptycznymi a interesującym białkiem, weź obraz o wysokiej rozdzielczości i przeanalizuj pojedynczy locus w celu określenia nakładania się sygnałów.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj pojedyncze miejsce na obrazie o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Uzyskaj profile intensywności sygnałów fluorescencyjnych miejsca zainteresowania.</li>
	<li>Eksportuj dane.</li>
	<li>Użyj GraphPad Prism lub podobnego oprogramowania analitycznego, aby znormalizować wszystkie piki sygnału i uzyskać porównywalne intensywności sygnału dla każdego kanału, a ostatecznym celem jest określenie kolokalizacji specyficznej dla locus.</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja współczynników Pearsona i Mandera
UWAGA: Jeśli analiza profilu sugerowała kolokalizację pojedynczego miejsca, bardziej ogólną analizę całego obrazu można przeprowadzić, obliczając współczynniki Pearsona i Mandera29,30.
<ol>
	<li>Użyj wtyczki ImageJ JACoP31, aby określić dwa parametry kolokalizacji: Pearsona i Mandera.</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Użyj GraphPad Prism lub podobnego oprogramowania do analizy i tworzenia wykresów, aby przetworzyć dane zebrane za pomocą JACoP.</li>
	<li>Użyj co najmniej 40 obrazów karty SIM dla każdego analizowanego warunku, aby uzyskać wykresy i uzyskać trafność statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+M+%22A+textbook+of+physiology%2C+part+three%3A+The+central+nervous+system+%287th+ed.%29%22">A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.)</a>. , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).</li>
<li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Dynamic Synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Aspects+of+CNS+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).</li>
<li>Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Classes+of+Secreted+Synaptic+Organizers+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System.</a> Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).</li>
<li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy%3A+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644(2020).</li>
<li>Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+Inhibitory+Synapse+Organization+Using+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 133(2019).</li>
<li>Yang, X., Specht, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+Domains+in+Super-Resolution+Microscopy%3A+The+Treachery+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).</li>
<li>Monro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Beyond the diffraction limit.</a> Nature Photonics. 3 (7), 361(2009).</li>
<li>Won, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Eyes on super-resolution.</a> Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6 (1), 27290(2016).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptopathy%3A+dysfunction+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Synaptopathy: dysfunction of synaptic function.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).</li>
<li>Tyebji, S., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptopathic+mechanisms+of+neurodegeneration+and+dementia%3A+Insights+from+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease.</a> Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).</li>
<li>Won, H., Mah, W., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+spectrum+disorder+causes%2C+mechanisms%2C+and+treatments%3A+focus+on+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).</li>
<li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+State+of+Synapses+in+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The State of Synapses in Fragile X Syndrome.</a> The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).</li>
<li>Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+major+synaptic+signaling+pathways+involved+in+intellectual+disability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability.</a> Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).</li>
<li>Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysfunction+in+prion+diseases%3A+a+trafficking+problem%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem.</a> International Journal of Cell Biology. 2013, 543803(2013).</li>
<li>Colnaghi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+Resolution+Microscopy+of+SUMO+Proteins+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7 (1), 10980(2016).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).</li>
<li>Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy%3A+artefact+analysis+and+reduction+utilizing+a+parameter+optimization+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach.</a> Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).</li>
<li>Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoJ-SQUIRREL%3A+quantitative+mapping+and+minimisation+of+super-resolution+optical+imaging+artefacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts.</a> Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+co-localization+of+objects+in+dual-colour+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images.</a> Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%E2%80%99s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>Bae, J. R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Synapses in neurodegenerative diseases.</a> BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).</li>
<li>Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Microscopy+Approaches+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging.</a> Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Karras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+optimization+of+reconstruction+parameters+in+structured+illumination+microscopy+-+A+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Communications%22%5BJournal%5D)">Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide.</a> Optics Communications. 436, 69-75 (2019).</li>
<li>Bereczki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+markers+of+cognitive+decline+in+neurodegenerative+diseases%3A+a+proteomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.</a> Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).</li>
<li>Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Changes+in+Synaptic+Markers+as+a+Function+of+Sleep+and+Wakefulness+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila.</a> Science. 324 (5923), 109-112 (2009).</li>
<li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+colocalization+by+correlation%3A+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander%27s+overlap+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyjaśnienie struktury i składu synapsy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia procesów fizjologicznych i patologicznych, które regulują pamięć i poznanie. Podczas gdy w normalnym stanie synapsy są budulcem pamięci, leżą również u podstaw złożonych zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera32. Opisany tutaj protokół służy do badania kolokalizacji białek neuronalnych za pomocą techniki mikroskopii superrozdzielczej zwanej SIM. Wykorzystując określony wzór oświetlenia, SIM może osiągnąć r...

Rozumienie i pogląd na synapsę ogromnie się zmieniły od czasu jej pierwszego opisu przez Fostera i Sherringtona w 1897 roku1. Od tego czasu nasza wiedza na temat komunikacji neuronalnej i procesów molekularnych, które za nią stoją, wzrosła wykładniczo2. Stało się jasne, że synapsy można traktować jako system dwukompartmentowy: przedział presynaptyczny zawierający pęcherzyki do uwalniania neuroprzekaźników i przedział postsynaptyczny z receptorami3. Ten uproszczony pogląd w ciągu ostatnich dwudziestu lat przekształcił się w złożoną sieć białek niezbędnych do transdukcji wiązania nadajnika w sygnalizację4.
Korzyści w zrozumieniu są częściowo spowodowane technikami super-rozdzielczości, które pokonały limit dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, aby lepiej dopasować wymiary synaps5,6,7,8,9,10. Ze względu na granicę dyfrakcji mikroskop optyczny nie może osiągnąć rozdzielczości powyżej 200 nm poprzecznie11,12. Aby obejść ten limit, stworzono techniki superrozdzielczości, wykorzystujące różne podejścia i osiągające różne rozdzielczości graniczne subdyfrakcyjne: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) i STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM podwaja rozdzielczość przestrzenną laserowych systemów mikroskopii szerokokątnej poprzez wstawienie siatki dyfrakcyjnej do ścieżki wiązki wzbudzenia15. Ruchoma siatka załamuje wiązki laserowe, tworząc znany wzór oświetlenia, zwykle paski. Ten celowo ustrukturyzowany wzór światła jest nakładany na nieznany rozkład przestrzenny barwnika fluorescencyjnego (próbki). Pręgi interferencyjne utworzone przez te dwa wzory kodują drobne szczegóły, których nie dałoby się inaczej odróżnić za pomocą normalnej mikroskopii szerokokątnej. Ostateczny obraz superrozdzielczy uzyskuje się przez połączenie i dekodowanie metodami matematycznymi kilku surowych obrazów tej samej próbki uzyskanych przez translacje i obroty siatki dyfrakcyjnej. Rozdzielczość obrazów superrozdzielczych osiąga 100 nm w kierunku bocznym i 500 nm w kierunku osiowym dla 2D-SIM15 lub 100 nm w kierunku bocznym i 250 nm w kierunku osiowym dla 3D-SIM16.
Nowe zrozumienie synapsy jest jeszcze ważniejsze w świetle wielu zaburzeń neurologicznych, w których dysfunkcja synaps odgrywa główną rolę w powstaniu i progresji17,18. Choroba Alzheimera, zespół Downa, choroba Parkinsona, choroby prionowe, padaczka, zaburzenia ze spektrum autyzmu i zespół łamliwego chromosomu X zostały powiązane z nieprawidłowościami w składzie, morfologii i funkcji synaptyków19,20,21,22.
Niedawno, używając zestawu przeciwciał specyficznych dla SUMO, użyliśmy SIM, aby pokazać kolokalizację białek SUMO w pierwotnych neuronach hipokampa z pre- i postsynaptycznymi markerami synaptofizyną i PSD95 na poziomie superrozdzielczości23. Umożliwiło nam to potwierdzenie dowodów z mikroskopii biochemicznej i konfokalnej na lokalizację SUMO w neuronach.
Tutaj opisujemy protokół do badania lokalizacji białek w pierwotnych neuronach hipokampa myszy. Jednocześnie protokół ten może być dostosowany do różnych typów pierwotnych kultur neuronalnych.

<table><tbody><tr><td>0,4% roztwór błękitu trypanowego&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>70 & mikro; Filtr M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td></td> <td>przeciwciało</td></tr><tr><td>przeciwprzeciwciałowe SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe z komorą</td> chemiczną <td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>Scientific-Antibody</td></tr><tr><td>FBS (Hyklon)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Mikrosfery modyfikowane karboksylanem FluoSpheres, 0,1 &mu; m, żółty&ndash; zielony fluorescencyjny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Ekwipunek</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck Life Science</td><td>G8769</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Life Science</td><td>H3537</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>L-Cysteina&nbsp;</td><td>Merck Nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>C6852-25g</td><td>Chemiczne</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21575022</td><td>Medium</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Merck Life Science</td><td>M8266</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>1 091 371 000</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>A Life Technologies</td><td>10888022</td><td>Medium</td></tr><tr><td>N-SIM Super Resolution Microscope</td><td>Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Life Science& nbsp;</td><td>P-3125</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Pen/Strep 10x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Poly-L lizyna</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Glass Antiblade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PSD95&nbsp;</td><td>Przeciwciało NeuroMab</td><td>K28/43</td><td></td></tr><tr><td>Okrągła szklanka nakrywkowa</td><td>Thermo</td><td>12052712</td><td>Ekwipunek</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Synaptofizyna&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S5768&nbsp;</td><td>przeciwciało</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>inhibitor trypsyny&nbsp;</td><td>Merck Nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>T9003-500MG</td><td>Chemiczny</td></tr></tbody></table>

obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapsy są funkcjonalnymi elementami neuronów, a ich defekty lub straty leżą u podstaw wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurologicznych. Badania obrazowe są szeroko stosowane do badania ich funkcji i plastyczności w stanach fizjologicznych i patologicznych. Ze względu na ich rozmiar i strukturę, badania lokalizacyjne białek wymagają technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W tym protokole opisujemy procedurę badania w neuronach pierwotnych kolokalizacji białek docelowych z markerami synaptycznymi na poziomie superrozdzielczości przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM). SIM to technika oświetlenia światłem wzorzystym, która podwaja rozdzielczość przestrzenną mikroskopii szerokokątnej, osiągając szczegółowość około 100 nm. Protokół wskazuje wymagane kontrole i ustawienia dla solidnych badań kolokalizacyjnych oraz przegląd metod statystycznych do prawidłowej analizy danych obrazowych.

Przedstawiamy standardowy schemat postępowania w badaniu kolokalizacji białek neuronalnych. W pierwszej kolejności skalibrowaliśmy mikroskop, a następnie przeprowadziliśmy analizę próbek metodą SIM. Do kalibracji systemu wykorzystaliśmy fluorescencyjne mikrosfery o średnicy 0,1 μm. Po uzyskaniu obrazów 3D-SIM o superrozdzielczości dla kuleczek, podstawowe dane obrazowe poddano transformacie Fouriera, aby przekształcić je z powrotem w reprezentację częstotliwości przestrzennych. Na Rysunku 2A...

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapsy są funkcjonalnymi elementami neuronów, a ich defekty lub ubytki leżą u podstaw wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurologicznych. Badania obrazowe są szeroko stosowane do badania ich funkcji i plastyczności w stanach fizjologicznych i patologicznych. Ze względu na ich rozmiar i strukturę, badania lokalizacyjne białek wymagają technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości.W tym protokole opisujemy procedurę badania w neuronach pierwotnych kolokalizacji docelowych białek z markerami synaptycznymi na poziomie superrozdzielczości przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego. SIM to technika wzorzystego oświetlenia światłem, która podwaja rozdzielczość przestrzenną mikroskopii szerokokątnej, osiągając szczegółowość około 100 nanometrów. Protokół wskazuje wymagane kontrole i ustawienia dla solidnych badań kolokalizacyjnych oraz przegląd metod statystycznych do prawidłowej analizy danych obrazowych.Kluczem do umożliwienia analizy na poziomie superrozdzielczości są jednak odczynniki używane podczas akwizycji, takie jak komorowe szkiełka nakrywkowe i roztwory montażowe zgodne ze współczynnikiem dyfrakcji obiektywu. Aby uzyskać pierwotny neuron hipokampa myszy, wyizoluj hipokampy od szczeniąt P1 do P4. Płytki komórkowe po 70 000 komórek na studzienkę w objętości 200 mikrolitrów na studzienkę.Poczekaj, aż pierwotne neurony hipokampa osiągną pełną dojrzałość 12 do 14 dni po posiewie, aby przeprowadzić badania kolokalizacji. Dodaj 4% paraformaldehydu, PFA, w PBS 200 mikrolitrów na studzienkę do neuronów, aby szybko je naprawić. Usunąć roztwór i inkubować próbki z 1% albuminą surowicy bydlęcej, BSA, w PBS w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby pasywnie pokryć wszystkie swobodnie wiążące powierzchnie płytki białkiem nieistotnym do analizy.Bufor blokujący oparty na BSA bez Triton X-100 redukuje tło przeciwciał skuteczniej niż ten sam bufor z 0,2%Triton X-100. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe. Jako kontrolę ujemną nie dodawaj żadnego przeciwciała pierwszorzędowego do jednej z studzienek.Zamontuj ogniwa za pomocą uchwytu kompatybilnego z kartą SIM, np. ProLong Glass Antifade Mountant. Przykryj i zabezpiecz komórki szkłem nakrywkowym, na przykład okrągłym szkłem nakrywkowym o średnicy ośmiu milimetrów.Można również użyć kwadratowych. Szkiełka nakrywkowe z komorą należy przechowywać w temperaturze pokojowej i odczekać co najmniej 48 godzin przed uzyskaniem obrazów. Szkło diamentowe wymaga co najmniej dwóch dni utwardzania przed akwizycją w super rozdzielczości.Użyj dwóch strategii, aby zapewnić swoistość przeciwciał. Pierwszym z nich jest zastosowanie co najmniej dwóch różnych przeciwciał ukierunkowanych na ten sam substrat. Drugą strategią jest neutralizacja przeciwciał poprzez inkubację z oczyszczonym celem białkowym lub używanym do wyhodowania przeciwciała.Do naszych analiz rutynowo używamy mikroskopu superrozdzielczego N-SIM wyprodukowanego przez firmę Nikon. Poniższe instrukcje mają na celu uzyskanie obrazów karty SIM niezależnie od używanego mikroskopu. Ważne jest również, aby zmaksymalizować wydajność mikroskopu, aby przeprowadzić dokładną kalibrację instrumentów, w tym pierścień korekcyjny, wyrównanie lasera i ogniskowanie bloku siatki.Przed akwizycją obrazów SIM system wymaga odpowiedniej kalibracji za pomocą koralików fluorescencyjnych o określonym rozmiarze poniżej rozdzielczości. Przykładem są mikrosfery TetraSpeck. Koraliki te są barwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, aby umożliwić kalibrację różnych laserów za pomocą jednej próbki.W łaźni wodnej sonikować około 1,8 razy 10 do 8 fluorescencyjnych mikrosfer przez 10 minut. Rozcieńczyć mikrosfery fluorescencyjne jeden na 500 w wodzie podwójnie destylowanej. Poddaj sonifikację po raz drugi przez dodatkowe 10 minut.Odpipetować 15 mikrolitrów rozcieńczonych kulek do studzienki z komorowym szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw roztwór do wyschnięcia na pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu montażowego, np. ProLong Glass, i umieść na wierzchu ośmiomilimetrowe szkiełko nakrywkowe. Odczekaj co najmniej 48 godzin, aby umożliwić prawidłowe utwardzenie. Włącz mikroskop i lasery.Pozwól systemowi się rozgrzać, aby osiągnąć równowagę termiczną wszystkich elementów mikroskopu, a system mikroskopu superrozdzielczego SIM wymaga co najmniej trzech godzin. Wybierz obiektyw 100X. Rozpocznij kalibrację od wyrównania laserów do środka bloku siatki dyfrakcyjnej.W systemie N-SIM pokrętło mikrometryczne oraz dedykowana kamera umożliwiają wyśrodkowanie wiązki światła do celu. Włóż szkiełko nakrywkowe z komorą mikroskopu do view. Ustaw system na grubość szkiełka nakrywkowego z komorą, regulując osłonę korekcji obiektywu.NIS Software, zastrzeżone oprogramowanie dostarczane z systemami mikroskopów superrozdzielczych N-SIM, posiada automatyczną funkcję regulacji korekcji kolorów. Dostosuj ostrość bloku siatki dla każdego kanału, aby zapewnić skupione, strukturalne oświetlenie wzoru na próbce. Oprogramowanie zapewnia automatyczną funkcję tego zadania.Uzyskaj surowe obrazy 3D SIM wielokolorowych mikrosfer. Oblicz dla każdej oddzielnej długości fali transformację Fouriera obrazu nadrozdzielczego. Jeśli przekształcony obraz nie uzyska prawidłowego wzoru przypominającego kwiat, wznów kalibrację, ponieważ nie osiągnięto super rozdzielczości.Na obrazie o wysokiej rozdzielczości wybierz pojedynczą mikrosferę i oblicz jej profil intensywności dla każdego kanału, aby zmierzyć osiągniętą rozdzielczość. Powinien teraz wynosić blisko 100 nanometrów w boku. Wykonaj rejestrację kanałów, nakładając wielokanałową akwizycję mikrosfer.Celem jest kolimacja wszystkich sygnałów kanału poprzecznie i osiowo. Wyeliminuje to aberracje chromatyczne spowodowane niewspółosiowością różnych kanałów i pomoże w analizie kolokalizacji. Potwierdź jakość kalibracji, korzystając z funkcji etapu fazy oświetlenia i wzorzystego ostrości iluminacji SIMcheck, zestawu wtyczek do aplikacji open source ImageJ.Rozpocznij analizę próbki za pomocą obiektywu 40X w trybie konfokalnym lub szerokokątnym. Pozwala to na nawigację po próbce, zachowując dobrą szczegółowość i duże pole widzenia. Użyj sygnału przeciwciała MAP2, aby wykryć obszar reprezentujący procesy neuronalne.Uzyskaj obrazy próbki w trybie konfokalnym, aby określić jakość barwienia. Przełącz się na obiektyw 100X. Nałóż olej na obiektyw 100X.Uzyskaj obraz szerokokątny lub konfokalny, który zostanie później wykorzystany do oceny jakości obrazu o wysokiej rozdzielczości. Przełącz na tryb karty SIM 3D. Korzystając z okien dialogowych do ustawiania parametrów akwizycji, wybierz najwyższe dostępne ustawienie głębi bitowej, aby zmaksymalizować informacje o kolorach.Zazwyczaj standardowym wyborem jest 16 bitów. Ponadto, aby poprawić stosunek sygnału do szumu, wybierz wartość niskiej częstotliwości do akwizycji, na przykład jeden megaherc. Korzystając z okien histogramu, ustaw moc lasera, aby uzyskać liniową odpowiedź sygnału, aby uniknąć utraty informacji, ogranicz nasycone piksele na obrazach.System N-SIM wykorzystuje kamerę Andor iXon3. Podczas pracy w trybie 16 bitów wybierz docelową intensywność 16 000, aby zapewnić liniową reakcję kamery. Alternatywnie wybierz zakres od 30 000 do 45 000, aby zmaksymalizować dynamiczny zakres przejęć.Ustaw moc lasera w zakresie od 0,1% do 50% podczas obrazowania próbek i czasy naświetlania od 50 milisekund do dwóch sekund. Moc lasera powyżej 50% może powodować szybkie fotowybielanie używanych fluoroforów. Rozpocznij pobieranie obrazów w trybie 3D SIM.Użyj SIMcheck, zestawu bezpłatnych wtyczek do ImageJ, aby ocenić jakość pozyskiwania surowych obrazów. Jeśli SIMcheck nie wykryje żadnych artefaktów ani problemów z jakością, uzyskaj co najmniej 10 obrazów z pełnych replik technicznych, aby umożliwić analizę statystyczną. Pozyskane obrazy to surowe dane, które należy przetworzyć w celu uzyskania zrekonstruowanych obrazów karty SIM, które zostaną wykorzystane do dalszej analizy.W protokole sugerujemy stosowanie synaptofizyny i PSD-95 jako markerów synaptycznych przed i po. Można jednak użyć dodatkowych znaczników. Ogromna literatura popiera stosowanie innych białek, takich jak drebryna i fagot, jako markerów synaptycznych.Obrazy uzyskane za pomocą karty SIM 3D to surowe obrazy, które należy przetworzyć w celu uzyskania zrekonstruowanych obrazów o wysokiej rozdzielczości. Nieprawidłowa rekonstrukcja surowych obrazów może prowadzić do powstania artefaktów, które wpłynęłyby na analizę próbek. Dużą uwagę należy zatem zwrócić na odpowiedni dobór parametrów rekonstrukcji.Przetwarzaj surowe obrazy za pomocą oprogramowania do analizy rekonstrukcji mikroskopu, aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości. Alternatywnie użyj bezpłatnej wtyczki ImageJ fairSIM, aby zrekonstruować surowe obrazy. Oblicz transformację Fouriera obrazów superrozdzielczych za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji mikroskopu lub wtyczki ImageJ SIMcheck.Dobry, zrekonstruowany obraz powinien zwracać, dla każdego kanału, obraz przypominający kwiat. Jeśli zrekonstruowane obrazy nie odtworzą kształtu przypominającego kwiat, uruchom ponownie od obrazów RAW i zrekonstruuj je, modyfikując parametry rekonstrukcji, takie jak filtrowanie liniowe, apodyzacja i pomijanie zerowego rzędu. W oprogramowaniu sieciowej usługi informacyjnej, korzystając z podglądu, w celu monitorowania, jak zmiana parametrów wpływa na ostateczną rozdzielczość obrazu, zmodyfikuj kontrast modulacji oświetlenia parametru, tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości i tłumienie nieostrości.Analizuj zrekonstruowany obraz, aby bezstronnie wykrywać artefakty za pomocą NanoJ-SQUIRREL, wtyczki opartej na ImageJ, do oceny jakości obrazów o wysokiej rozdzielczości. W naszej analizie kolokalizacji zastosowaliśmy dwa podejścia. Pierwszym z nich jest podejście wizualne oparte na analizie profilu, które pokazuje pojedyncze zdarzenia kolokalizacji i identyfikuje wkład każdego kanału.Pierwszym krokiem do zbadania kolokalizacji między markerami synaptycznymi a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania jest wykonanie obrazu o wysokiej rozdzielczości i przeanalizowanie pojedynczego locus w celu określenia nakładania się sygnałów. Zidentyfikuj pojedyncze miejsce na obrazie o wysokiej rozdzielczości. Uzyskaj profile intensywności sygnałów fluorescencyjnych do miejsca zainteresowania.Jeśli analiza profilu zasugerowała kolokalizację pojedynczego locus, bardziej ogólną analizę całego obrazu można przeprowadzić, obliczając współczynniki Pearsona i Mandera. Użyj JACoP, wtyczki ImageJ, aby określić dwa parametry kolokalizacji, Pearsona i Mandera. Po skalibrowaniu systemu i ocenie jakości zrekonstruowanych obrazów, przystąpiliśmy do analizy pierwotnych kultur neuronalnych wybarwionych przeciwciałem przeciwko MAP2, markerowi neuronalnemu, PSD-95, markerowi postsynaptycznemu i naszemu docelowemu białku SUMO1.Najpierw przeanalizowaliśmy próbkę, wykonując czterokanałową mikroskopię konfokalną z obiektywem 40X. Po wybraniu obszaru reprezentującego procesy neuronalne, przełączyliśmy się na obiektyw 100X. Pobraliśmy zarówno obrazy konfokalne, jak i SIM tego samego obszaru, aby ocenić jakość rekonstrukcji za pomocą NanoJ-SQUIRREL i przeprowadzić analizę kolokalizacji.Wyjaśnienie struktury i składu synapsy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych procesów regulujących pamięć i poznanie. Podczas gdy w stanie normalnym synapsy są budulcem pamięci, są one również podstawą złożonych zaburzeń neurologicznych, takich jak jedna z najczęstszych form demencji, choroba Alzheimera. Opisany tutaj protokół pozwala na badanie składu białek synaps za pomocą techniki mikroskopii superrozdzielczej zwanej mikroskopią oświetlenia strukturalnego.

super-resolution-imaging-to-study-co-localization-proteins-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj mikroskopię superrozdzielczą SIM do badania kolokalizacji białek w pierwotnych neuronach myszy. Ta metoda pozwala osiągnąć rozdzielczość około 100 nanometrów i szczegółowo analizować interakcje białek synaptycznych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów