Biomimetyczna replikacja mikrostruktury powierzchni korzenia przy użyciu zmiany miękkiej litografii

Protokół ten umożliwia opracowanie syntetycznego systemu naśladującego mikrostrukturę powierzchni korzenia. System może być wykorzystywany do badania interakcji między korzeniami a środowiskiem w sposób kontrolny, z naciskiem na strukturę powierzchni. Jest to prosta technika, którą można wykonać w dowolnym laboratorium badającym interakcje między korzeniami a środowiskiem.

Dodatkowo technika ta umożliwia formowanie powierzchni z różnych materiałów. Najtrudniejszym krokiem jest usunięcie naturalnego korzenia z pleśni ujemnej. Ten krok wymaga delikatnego obchodzenia się z korzeniem, aby uniknąć rozdarcia włośników.

Demonstracja wizualna zwiększy zdolność widza do odtworzenia tej procedury. Zacznij od usunięcia rośliny z gleby po trzech tygodniach wzrostu. Odetnij system korzeniowy od rośliny w miejscu interakcji z łodygą i umieść roślinę bez korzeni w zlewce z wodą.

Po kilku dniach odetnij korzenie przybyszowe, które wyłaniają się z łodygi i użyj ich do replikacji. Aby przygotować kiełkujące korzenie nasion, zwilż bibułę filtracyjną wewnątrz szalki Petriego wodą i umieść kilka nasion M82 na papierze. Inkubuj naczynie w temperaturze 25 stopni Celsjusza i codziennie nawadniaj papier.

Około pięć dni później kiełkujące korzenie będą wystarczająco długie, aby można je było wykorzystać do replikacji. Przygotować ujemny roztwór repliki, dodając 9,49 grama dimetarylanu diuretanu do 50-mililitrowego kubka. Dodaj 1,45 mililitra metakrylanu etylu do kubka i przechowuj w temperaturze pokojowej, aż roztwór stanie się jednorodny i będzie klarowny.

Dodaj trzy mililitry plastyfikatora i mieszaj roztwór przez kolejną godzinę. Następnie dodaj 300 mikrolitrów inicjatora fotograficznego i mieszaj przez noc lub do momentu, gdy wszystkie bąbelki zostaną usunięte. Aby wygenerować ujemną replikę korzenia, weź czyste szklane szkiełko i wlej na nie jeden mililitr roztworu repliki negatywu.

Umieść dwa do trzech korzeni nad roztworem, upewniając się, że korzenie nie są całkowicie zakryte. Trzymaj szkiełko pod ośmiowatową lampą ultrafioletową przez osiem do 10 minut, a następnie wyłącz lampę UV. Zdejmij replikę ze szkiełka i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej etanolem w celu usunięcia nieprzereagowanego monomeru.

Za pomocą kleszczy powoli i delikatnie usuwaj korzeń z repliki. Aby przygotować roztwór PDMS dla repliki dodatniej, umieść 10 gramów dimetylosiloksanu w filiżance. Dodaj jeden gram utwardzacza i dokładnie wymieszaj.

Podgrzewać mieszaninę w eksykatorze pod próżnią przez dwie godziny, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Umieścić poliuretanową replikę negatywu na szalce Petriego i wylać mieszaninę PDMS na wierzch repliki negatywu. Zastosuj próżnię przez dwie godziny, aby zapewnić pokrycie mikrostruktury i utrzymuj szalkę Petriego w temperaturze pokojowej przez noc.

Następnego dnia należy oddzielić utwardzoną replikę dodatnią od repliki ujemnej za pomocą kleszczy. Aby przygotować pozytywową replikę z etylocelulozy, dodaj 20 mililitrów etanolu do 100-mililitrowego kubka. Następnie dodaj 1,32 mililitra plastyfikatora i 3,3 grama etylocelulozy.

I mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnego dnia wylej roztwór etylocelulozy na wierzch negatywu na szalkę Petriego i pozostaw szalkę pod maską na noc. Następnie powoli wyjmij replikę pozytywową z repliki negatywowej za pomocą kleszczy.

Dobrą ujemną replikę można wygenerować, jeśli protokół jest przestrzegany poprawnie. Ta replika pokaże strukturę komórkową powierzchni korzenia, a także otwory reprezentujące lokalizację włośników. Jeśli korzeń zostanie zanurzony w roztworze poliuretanu, zostanie uwięziony w twardym polimerze i pozostanie w replice negatywu po jego utwardzeniu.

Podczas utwardzania światłem UV, przekroczenie zalecanego czasu utwardzania, spowoduje powstanie niezwykle twardej formy poliuretanowej, uniemożliwiającej usunięcie korzenia bez jego złamania. Czasami kawałki korzeni są tak małe, że aby je zobaczyć, wymagana jest mikroskopia. Dodatnie repliki wygenerowano za pomocą PDMS i etylocelulozy.

Włośniki znajdują się w strefie wydłużenia, w której zaczynają się wyłaniać. Ich długość zmienia się wzdłuż powierzchni korzenia, gdy stają się dłuższe, podobnie jak naturalny korzeń. Niektóre z włosów na replice etylocelulozy są nawet widoczne pod mikroskopem świetlnym.

Podczas umieszczania korzenia nad roztworem repliki ujemnej ważne jest, aby wybrać właściwą stronę i unikać zanurzenia korzenia w roztworze. Technika ta została opracowana, aby zapewnić nową drogę do badania interakcji środowiskowych na powierzchni korzeni. W szczególności siły fizyczne wywołane mikrostrukturą i właściwościami materiałowymi powierzchni.